嚴(yán) 妍，宮 婷，張守峰，趙敬慧，劉 曄，王 穎，張 菲，張錦霞，扈榮良

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130122；3.本溪市畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，本溪117000）

·簡(jiǎn)報(bào)·

廣東省豬圓環(huán)病毒2型基因的克隆與序列分析

嚴(yán) 妍1,2，宮 婷3，張守峰2，趙敬慧2，劉 曄2，王 穎2，張 菲2，張錦霞2，扈榮良2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130122；3.本溪市畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，本溪117000）

根據(jù)GenBank已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）全基因組序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，對(duì)廣東省不同地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)采集的臨床診斷為斷奶仔豬多系統(tǒng)消耗綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的組織病料進(jìn)行了PCV2基因克隆和序列分析。結(jié)果表明，采集的PMWS病料均可擴(kuò)增出PCV2完整基因序列，與GenBank已發(fā)表的PCV2參考毒株序列核苷酸同源性達(dá)93.7%～99.8%，親緣關(guān)系密切。其中10個(gè)PCV2基因全長(zhǎng)1767 bp，屬于PCV2b亞型，1個(gè)PCV2基因全長(zhǎng)1768 bp，屬于PCV2a亞型。

豬圓環(huán)病毒2型；基因分析；流行毒株

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus type 2，PCV 2）屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，為已知的最小的動(dòng)物病毒之一。PCV以滾環(huán)方式復(fù)制，呈20面體對(duì)稱，無(wú)囊膜，直徑17～22 nm，含有1.76～2.3 kb 的單鏈環(huán)狀DNA，相對(duì)分子量58 kDa，沉降系數(shù)為52 S。根據(jù)PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，將其分為PCV1和PCV2兩個(gè)型。PCV1無(wú)致病性，廣泛存在于豬體內(nèi)及豬源傳代細(xì)胞系。PCV2具有致病性，主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS），臨床癥狀為漸進(jìn)性消瘦、呼吸困難急促、貧血、腹瀉、黃疸、間質(zhì)性肺炎、淋巴腺炎及腎炎等。PCV2在淋巴系統(tǒng)增殖可導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能下降，造成其他病毒性、細(xì)菌性疾病的并發(fā)或繼發(fā)，使病情加重。此外，PCV2經(jīng)常與多種病原混合感染，使疾病復(fù)雜化，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

根據(jù)基因組大小，許多學(xué)者將PCV2分為PCV2a （PCV2-2）和PCV2b（PCV2-1）兩種亞型，其中PCV2a基因組全長(zhǎng)1768 bp，報(bào)道的國(guó)家主要有中國(guó)和歐洲國(guó)家；PCV2b基因組全長(zhǎng)1767 bp，在世界范圍內(nèi)普遍感染。2003年后豬群中PCV2的基因型逐漸從以PCV2a主導(dǎo)轉(zhuǎn)變成PCV2b主導(dǎo)，與此同時(shí)，豬群中PCVD的發(fā)病率和嚴(yán)重程度也逐漸升高。

本研究采用PCR從疑似病料中克隆得到PCV2全基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并對(duì)其序列進(jìn)行分析，探索PCV2的變異規(guī)律，為該病毒的分子生物學(xué)、流行病學(xué)、致病機(jī)理等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 陽(yáng)性病料 2010～2012年在廣東省不同地區(qū)發(fā)病豬場(chǎng)，采集臨床癥狀疑似PMWS發(fā)病死豬內(nèi)臟及淋巴結(jié)：2010年河源市1份、2012年陽(yáng)江市、中山市各1份，云浮市、清遠(yuǎn)市2份，佛山市3份，共11份。

1.2 主要試劑 質(zhì)粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；Biospin組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自BioFlux公司；rTaq聚合酶、pMD18-T、T4 DNA連接酶、DL2000 Marker均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 DNA提取 用Biospin組織基因組DNA提取試劑盒按使用說(shuō)明提取病料組織總DNA，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCV2全基因的擴(kuò)增 參考GenBank上PCV2全基因序列（GenBank登錄號(hào)：HM623764.1），利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)并合成針對(duì)豬圓環(huán)病毒2型全基因的引物。PCV2F：5'-GTACCTTGTTGG AGAGCGGG-3'；PCV2R：5'-TCACAGCAG TAGACAGGTCA-3'。引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。用高壓滅菌超蒸水溶解配成10 pmol/μL，－20℃保存?zhèn)溆谩?0 μL反應(yīng)體系：引物各1 μL（10 pmol/μL）、Premix Taq?Version2.0 （1.25 U /25 μL）25 μL、DNA模板3 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，51℃退火45 s，72℃延伸50 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。設(shè)無(wú)菌蒸餾水為陰性對(duì)照。

1.5 PCV2全長(zhǎng)基因核苷酸序列測(cè)定 按照DNA回收試劑盒的說(shuō)明對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，并將回收產(chǎn)物與pMD18-T連接，連接體系：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL、回收的PCR產(chǎn)物5 μL、pMD18-T 1 μL、T4 DNA 連接酶 0.5 μL，加水至10 μL，于16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，37℃溫箱培養(yǎng)12～16 h后，進(jìn)行菌落PCR鑒定。陽(yáng)性克隆送中美泰和生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.6 PCV2同源性對(duì)比與系統(tǒng)發(fā)育分析 利用DNAStar軟件將測(cè)序結(jié)果同已發(fā)表的PCV2全基因核苷酸序列進(jìn)行比較，確定各PCV2毒株與已發(fā)表的PCV2全基因核苷酸序列的同源性。為更好了解PCV毒株的遺傳學(xué)特性及相互的親緣關(guān)系，在分析所有毒株同源性的基礎(chǔ)上繪制了系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCV2 全基因組PCR結(jié)果 廣東省不同地區(qū)11份疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）組織病料均克隆出PCV2基因，表明PCV2在廣州省普遍流行。自2000年郎洪武等[1]首次報(bào)道PCV2在我國(guó)流行以來(lái)，全國(guó)多個(gè)地區(qū)報(bào)道有PCV2的流行。李玲等[2]檢測(cè)全國(guó)12個(gè)省市不同豬群的452份樣品，陽(yáng)性率73.8%。崔亞蘭等[3]對(duì)貴州省不同豬群的133份樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為77.44%。吳瑗等[4]檢測(cè)浙江省180份可疑病料，陽(yáng)性率為41.4%。

通過(guò)擴(kuò)增全基因組序列，得到的11條PCV2全基因序列中，其中10條大小為1767 bp、1條為1768 bp，序列名稱如下：廣東GD12-393株為PCV2a亞型，基因組為1787 bp；廣東GD10-01、GD12-59、GD12-130、GD12-202、GD12-275、GD12-266、GD12-259、GD12-228、GD12-230、GD12-238株為PCV2b亞型，基因組為1767bp(見圖1)。表明PCV2b為廣東地區(qū)的主要流行株。PCV2分為PCV2a 和PCV2b[5-9]兩種基因亞型，其中PCV2a細(xì)分為5個(gè)基因型（2A-2E），PCV2b可分為3個(gè)基因型（1A-1C）[10]。有研究表明PCV2b致病性更強(qiáng)[6,11-13]。李玲等[2]檢測(cè)的陽(yáng)性樣品中克隆得到的31株毒株序列均為PCV2b。邵萌等[14]檢測(cè)了2010年至2012年間陜西省141份樣品，其中106例為PCV2b型感染。說(shuō)明我國(guó)流行PCV2的基因型逐漸已從以PCV2a主導(dǎo)轉(zhuǎn)變成PCV2b主導(dǎo)[15]并成為我國(guó)當(dāng)前優(yōu)勢(shì)基因型毒株[12]。

圖1 樣品中PCV2 的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The result of PCV2 detection by PCR

2.2 同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析 將以上得到的11株P(guān)CV2全基因核苷酸序列同GenBank中的中國(guó)大陸株（ZJ0882、JS0737、GX0841a、SH0710），臺(tái)灣株（HsinChu）、新疆株（XJ0901）核苷酸序列同源性比對(duì)和建立系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2、3），結(jié)果顯示其同源性為93.7%～99.8%。表明廣東省在2010～2012 年P(guān)CV2流行毒株與全國(guó)各地區(qū)流行毒株相似，為我國(guó)普遍流行的毒株。本次對(duì)廣東省PCV2流行病學(xué)情況的調(diào)查，可以為該地區(qū)PCV2的診斷、控制和預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。

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圖2 PCV2全基因序列同源性對(duì)比（1-11為本研究測(cè)定序列）Fig.2 Genetic sequence homology based on the amino acid sequence of PCV2 ORF2 gene (The 1-11 indicates the gene segment sequenced in this study)

圖3 PCV2全基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹（粗體為本研究測(cè)定序列）Fig.3 Phylogenetic tree based on the amino acid sequence of PCV2 ORF2 gene (The bold indicates the gene segment sequenced in this study)

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CLONGING AND SEQUENCING OF PORCINE CIROVIRUS TYPE 2 IN GUANGDONG

YAN Yan1,2, GONG Ting3, ZHANG Shou-feng2, ZHAO Jing-hui2, LIU Ye2, WANG Ying2, ZHANG Fei2, ZHANG Jin-xia2, HU Rong-liang2
(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agriculture University, Changchun 130118, China; 2.Military Veterinary Research Institute, Academy of Military Medical Sciences, Changchun 130122, China; 3.Livestock Product Safety Supervision Institute of Benxi, Benxi 117000, China)

A pair of specific primers were designed according to the whole genomic sequence of porcine circovirus type2( PCV2 ) published on GenBank.The suspicious samples were collected from large scale pig farms in different areas of Guangdong province and examined in PCR and resulting amplicons were cloned and sequenced.The results showed that nucleotide sequences of 11 PCV2 isolates were stable and their similarities were 93.7% to 99.8% with the reference strain published in the GenBank.The complete sequences of 10 PCV2 isolates were1767 bp and belonged to PCV2b subtype.However, the complete sequence of one PCV2 isolate was 1768 bp and belonged to PCV2a subtype.

Porcine cirovirus type 2; phylogenetic analysis; epidemic strain

S852.659.2

B

1674-6422（2016）02-0076-04

2015-11-01

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203056）

嚴(yán)妍，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)；宮婷，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

扈榮良，E-mail：ronglianghu@hotmail.com