馮金濤，韓 愉，袁 煒，張 欣，許 瑞，李 浩，陸 珂，金亞美，林矯矯，程國鋒，劉金明

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 國家防治動物血吸蟲病專業(yè)實驗室 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海200241）

·研究論文·

陽性水牛、黃牛IgG篩選日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫

馮金濤，韓 愉，袁 煒，張 欣，許 瑞，李 浩，陸 珂，金亞美，林矯矯，程國鋒，劉金明

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 國家防治動物血吸蟲病專業(yè)實驗室 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海200241）

為尋找有效的家畜日本血吸蟲病診斷抗原，從感染日本血吸蟲的水牛、黃牛血清中純化IgG，以親和淘洗方法篩選日本血吸蟲成蟲（44日齡）噬菌體展示 cDNA 文庫。經(jīng)每種動物IgG三輪（總計六輪）篩選后, 隨機挑取 53 個陽性噬菌體克隆進行序列測定及生物信息學分析。獲得了9個EST 序列，其中7個EST序列與已知基因或表達序列標簽同源，2個 EST 序列與已知基因或表達序列標簽均無同源性，以噬菌體展示載體的 10B 衣殼蛋白開放閱讀框（open reading frame，ORF）為依據(jù)，對上述 7個與 GenBank 數(shù)據(jù)庫資料同源的 EST 進行對碼分析，結果 7個EST序列能和噬菌體展示載體閱讀框對碼，為有效展示序列。其中3個EST具有較高的重復度，在51個有效克隆中，25個為HSP70 homolog基因，15個為Keratin9基因有重復，6個為Ornithine--oxo-acid transaminase基因。研究結果顯示，HSP70 homolog基因、Keratin9基因和Ornithine--oxo-acid transaminase基因作為診斷家畜血吸蟲病候選抗原基因，值得進一步開展克隆、表達和診斷效果評估方面的研究。

日本血吸蟲；水牛；黃牛；篩選；噬菌體展示 cDNA 文庫

血吸蟲病發(fā)生在熱帶和亞熱帶，是世界范圍內最重要的寄生蟲病，血吸蟲病的防控具有重要的社會經(jīng)濟意義[1]。血吸蟲病在74個國家流行，大約1億2千萬人為有癥狀性感染，2千萬人受到嚴重影響[2]。盡管在低感染度下血吸蟲很少引起死亡，但是它的復發(fā)特性使血吸蟲感染成為終身失調的慢性病[3]。日本血吸蟲病在中國長江中下游沿岸5?。ê鲜?、湖北省、江西省、安徽省和江蘇省）以及四川省、云南省2省流行。雖然我國血吸蟲病防控已取得顯著成效，但迄今為止仍然是主要的公共衛(wèi)生問題之一。2013年底全國仍有血吸蟲病患者約184 943例，其中急性血吸蟲感染病例9例，當年死亡1700例[4]。2012年在湖南省、湖北省、江西省、安徽省、江蘇省、四川省、云南省7個流行省，牛血吸蟲病的糞便毛蚴孵化法檢測陽性率為0.58%，推算的理論病牛數(shù)為5284頭[5]。

患病家畜特別是病牛，是我國血吸蟲病的最重要傳染源，因此及時發(fā)現(xiàn)病畜并給予治療是有效控制傳染源的重要途徑。長期以來，家畜血吸蟲病的診斷和監(jiān)測主要采用病原學診斷技術—糞便毛蚴孵化法。隨著我國血吸蟲病防控和疫情控制取得巨大成就，我國家畜血吸蟲感染率和感染度越來越低，傳統(tǒng)的病原學診斷技術在發(fā)現(xiàn)病畜和確定治療對象方面越來越困難。免疫學診斷技術主要采用蟲卵可溶性抗原（soluble egg antigen，SEA）檢測抗體的技術，包括ELISA、IHA等，但SEA抗原和其他吸蟲如片型吸蟲感染血清有較高的交叉反應[6]。雖然在基因工程診斷抗原研究方面已有不少報道，但目前還沒有一種基因工程抗原可以開展大規(guī)模的應用，繼續(xù)篩選敏感特異的診斷抗原是我國血吸蟲病防治的一大需求。本研究用感染日本血吸蟲家畜的IgG篩選日本血吸蟲成蟲 T7 噬菌體展示 cDNA 文庫，以期發(fā)現(xiàn)能用于后續(xù)研究的家畜日本血吸蟲病診斷抗原基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、實驗動物日本血吸蟲成蟲（Sj44d）噬菌體展示 cDNA 文庫由本研究室構建、保存，庫容量為4.98×106pfu，重組率為93.8%，其中95.6%的插入片段大于300 bp[7]。血吸蟲尾蚴由本研究室釘螺室提供；水牛、黃牛血吸蟲陽性血清（糞檢陽性）為本研究室用日本血吸蟲尾蚴攻擊感染后采集、保存。

1.1.2 主要試劑 Protein G親和層析柱購自GE公司；鹽酸胍購自華美生物工程公司；BSA（Fraction Ⅴ）購自 BBI公司；binding/wash buffer和elution buffer購自生工生物工程（上海）有限公司；T7噬菌體載體引物序列由 T7 Select 10-3b Cloning Kit 說明書提供，Invitrogen公司合成，上游引物序列為5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'，下游引物序列為5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'。

1.2 方法

1.2.1 水牛、黃牛日本血吸蟲陽性血清抗體純化 按照產(chǎn)品說明書，用Protein G親和層析柱親和層析純化IgG。主要步驟如下：分別取實驗室保存的水牛、黃牛兩種動物陽性血清各10份，4℃融化過夜后，每份取100 μL合并，用日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原（SEA）進行常規(guī)ELISA驗證血清為陽性后，加入1倍體積結合緩沖液，上下顛倒10次混勻，4℃、12 000×g離心6 min，小心吸取上清，用0.45 μm濾器過濾。將Protein G柱（1 mL）在室溫平衡5 min，用5倍柱體積的滅菌二級水洗柱后，加入5倍柱體積結合緩沖液平衡。待結合緩沖液流盡后，加入上述過濾血清。待血清樣品流盡，分別加入10倍柱體積結合緩沖液和0.5 mL 洗脫緩沖液洗滌，流盡后再加入5倍柱體積洗脫緩沖液洗脫，用EP管收集洗脫液，每管1 mL。以空白洗脫緩沖液作空白對照，用紫外分光光度計初步測定各收集管蛋白濃度。將洗脫純化后的抗體，用12%的分離膠進行SDS-PAGE電泳，測定純化抗體純度，將高蛋白濃度且純度達到要求的各管抗體合并，按照說明書以BSA為標準蛋白，用BCA法檢測洗脫純化后抗體濃度。

1.2.2 噬菌體文庫擴增 將宿主菌BLT5403接種于M9LB 培養(yǎng)基（Amp+），于37℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)至吸光度OD600=1.0。將超低溫冰箱中保存的原始文庫解凍后與宿主菌液按 100:250 比例混勻，37℃作用 10～20 min，再與頂層瓊脂混合，鋪于 120 mm LB 平板頂層，37℃倒置培養(yǎng) 3～4 h。然后每塊板加 10 mL 噬菌體提取緩沖液，4℃存貯過夜，d2收集噬菌體提取緩沖液，加入0.5 mL氯仿混合均勻，3000×g離心 5 min，收集上清。

1.2.3 噬菌體滴度測定 將文庫或每輪篩選獲得的噬菌體分別用1×TBS按1:10比例稀釋，每個稀釋度各取100 μL，加入250 μL BLT5403培養(yǎng)菌液（OD600=1.0）中，混勻后37℃孵育20 min，加入3 mL冷卻至55℃的頂層瓊脂，上下顛倒混勻后迅速平鋪含1‰氨芐（氨芐濃度為100 mg/mL）瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～4 h，將平板上的噬菌斑進行計數(shù)，計算噬菌體的滴度（pfu/mL=噬菌斑個數(shù)×10×稀釋倍數(shù)）。

1.2.4 噬菌體展示文庫的篩選 將洗脫純化后抗體用CB 稀釋至蛋白含量為 10 μg/mL，按每孔100 μL加至 96 孔酶標板中，4℃過夜，TBST洗滌3次，每次置于搖床振蕩5 min。加入1%明膠（200 μL/孔），37℃封閉 1 h，TBST清洗5 次，每次置于搖床振蕩 5 min。將擴增文庫按每孔100 μL 加入板中，37℃孵育 1 h。TBST清洗 5 次，每次置于搖床振蕩 5 min。每孔加 2 mol/L 鹽酸胍 200 μL，室溫孵育 20 min 后洗脫。收集洗脫液，按上述文庫擴增方法用宿主菌BLT5403 擴增并測定滴度后用于下一輪篩選。水牛純化抗體進行3輪篩選后，洗脫下噬菌體，繼續(xù)用黃牛純化抗體進行3輪篩選，共連續(xù)進行6輪篩選。

1.2.5 插入片段的序列測定及生物信息學分析 從6 輪篩選后擴增平板上隨機挑取噬菌斑，浸入噬菌體提取緩沖液，用 T7 噬菌體載體引物以PCR方法擴增插入片段。PCR條件：94℃熱變性5 min；94℃變性50 s、50℃退火1 min、72℃延伸1 min，35個循環(huán)后，72℃延伸6 min。 取5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將 PCR 產(chǎn)物送 Invitrogen 公司用T7 噬菌體載體引物測序。

將測序所得序列用 DNAStar MegAlign 軟件進行聚類分析，獲取非重復序列，用BLASTn（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)）在 GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行同源性搜索，對已搜索到同源性的序列，用 Protein Blast 和tblastn（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）以及 Translation To（http://www.expasy.org/tools/dna.htmL）分析所獲取序列與T7 噬菌體載體是否對碼。用InterProScan（http//www.ebi.ac.uk/interpro/）和PROSITE（http://www.expasorg/ prosite/）等數(shù)據(jù)庫預測這些序列編碼蛋白可能參與的生物學過程、分子功能及包含的結構域。

2 結果

2.1 水牛、黃牛日本血吸蟲陽性血清IgG純化 將收集的日本血吸蟲的水牛、黃牛血清分別經(jīng)Protein G親和柱層析純化，各得到5管洗脫液，純化抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳后在50 kDa和25 kDa有兩條明顯的條帶（圖1），無其他雜條帶，說明經(jīng)Protein G親和柱層析純化血清后，得到了較純凈的抗體。 純化抗體濃度：水牛870 μg/mL，黃牛1500 μg/mL。

圖1 利用Protein G 純化兩種動物IgGFig.1 Purifi ed IgG from the two animals by Protein G

2.2 噬菌體展示文庫的篩選 用純化的水牛、黃牛IgG，依次對文庫進行淘洗篩選，每種動物進行3輪篩選，每輪篩選之后檢測篩選洗脫液中的噬菌體滴度和擴增之后測滴度。6輪篩選過程中噬菌體的投入、洗脫數(shù)量和富集程度結果見表1。從表中可以看出同種動物IgG的第2輪篩選的富集度比第1輪高，第3輪篩選的富集度比第2輪略有提高，說明與抗體結合的噬菌體量得到富集，經(jīng)過6輪篩選后去除了非特異性結合和低親和力的噬菌體。

2.3 插入片段的序列測定及生物信息學分析 從第 6輪篩選后擴增平板上隨機挑取 53個陽性菌體克隆進行測序，經(jīng)歸類分析后得到9個 EST序列。利用BLAST 軟件搜索這9個 EST在GeneBank 中的同源序列，其中7個與已登錄的血吸蟲已知基因相匹配，2個與數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)沒有同源性。以噬菌體展示載體的 10B 衣殼蛋白開放閱讀框（open reading frame，ORF）為依據(jù)，對上述 7個與 GenBank 數(shù)據(jù)庫資料同源的 EST 進行對碼分析，結果 7個EST序列能和噬菌體展示載體閱讀框對碼，為有效展示序列。

在7個與已登錄的血吸蟲已知基因相匹配的EST序列中，編碼HSP70 homolog的基因有25個重復，編碼Keratin 9的基因有15個重復，編碼Ornithine--oxo-acid transaminase的基因有6個重復，編碼Protein BUD31 homolog的基因有2個重復，為篩選出的重復較多的EST序列。篩選出的其他基因序列均沒有重復，其生物信息學分析結果如表2。

表1 6輪篩選的噬菌體富集結果Table1 The phages enrichment results by two kinds of serum after six rounds of biopanning

表2 陽性克隆的生物信息學分析Table2 Bioinformatic analysis of the positive clones

3 討論

黃牛與水牛一直被認為是我國血吸蟲病傳播的重要宿主[8]。目前對血吸蟲病診斷候選抗原基因的研究，大多數(shù)均以人群血吸蟲病診斷為目的。由于動物宿主在抗原遞呈方面存在差異，可能導致其在感染血吸蟲后血清抗體對血吸蟲抗原的反應也存在差異。家畜血吸蟲病診斷抗原的選擇應考慮宿主免疫的差異性，一方面需對已報道的候選基因重組抗原進行家畜血吸蟲病診斷效果評估，另一方面還需篩選適合不同家畜品種的抗原基因。本研究分別從曾感染血吸蟲的水牛和黃牛血清中純化IgG，篩選日本血吸蟲噬菌體展示文庫，期望獲得能同時診斷水牛和黃牛日本血吸蟲病的抗原基因。

噬菌體展示技術可將編碼蛋白質的 DNA 序列插入到噬菌體基因組中，使表達的目標多肽或蛋白以與內源蛋白融合的形式展示在噬菌體顆粒表面[9]，該技術使表達產(chǎn)物與其編碼基因在同一噬菌體顆粒上建立起一一對應的關系，并且被展示的外源肽或蛋白可保持相對獨立的空間結構和生物活性[10]，篩選出的噬菌體陽性克隆，本身可以直接作為候選重組診斷抗原，用于診斷效果的評估，同時也可以得到具有診斷價值的候選靶基因。篩選出的噬菌體陽性克隆，重復數(shù)量越多，表明該噬菌體陽性克隆在逐級篩選過程中富集程度越高，更易篩選出的具有較高診斷價值的噬菌體陽性克隆。本研究篩選出的HSP70 homolog 基因為篩選出的重復數(shù)最高的基因，日本血吸蟲HSP70（Grp78）基因，曾被報道具有高度的抗原特異性，并具有一定的早期診斷與療效考核潛能[11]。Keratin9基因為日本血吸蟲的卵殼蛋白基因的一部分，唐小牛等[12]、張莉等[13]曾嘗試對此基因進行原核克隆表達，研究其作為候選疫苗分子和診斷抗原的可能性，但未見后續(xù)報道。劉蘭英等[14]通過構建真核表達質粒，在Hela細胞中高效表達卵殼蛋白，表達的重組蛋白具有較強的免疫活性。鳥氨酸轉氨酶在血吸蟲中的特性尚無報道，對脊椎動物的研究發(fā)現(xiàn)，作為尿循環(huán)中的最后一個酶，鳥氨酸轉氨酶的主要作用是解毒，存在于血細胞中。Lu等[15]采用純化的抗血吸蟲全蟲蛋白的IgY 作為捕捉抗體，對感染血吸蟲病患者的血清進行篩選，獲得了4個可能具有診斷價值的循環(huán)抗原，其中包括Protein BUD31 homolog。

由于淘洗法篩選噬菌體文庫的假陽性較高，難以用陰性血清IgG進行扣除，本研究篩選獲得的基因的表達產(chǎn)物是否能用于家畜血吸蟲病的診斷，還需后續(xù)對相關基因進行克隆、表達后驗證。

[1] King C H, Dickman K, Tisch D J.Reassessment of the cost of chronic helminthic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis[J].Lancet, 2005, 365(9470): 1561-1569.

[2] Steinmann P, Keiser J, Bos R, et al.Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta analysis and estimates of people at risk[J].Lancet Infect Dis, 2006, 6(7): 411-425.

[3] Enk M J, Amaral G L, Costae Silva M F, et al.Rural tourism: a risk factor for schistosomiasis transmission in Brazil[J].Mem Inst Oswaldo Cruz, 2010, 105(4): 537-540.

[4] 雷正龍, 鄭浩, 張利娟, 等.2013年全國血吸蟲病疫情通報[J].中國血吸蟲病防治雜志, 2014, 26(6): 591-597.

[5] 李浩, 劉金明, 宋俊霞, 等.2012年全國家畜血吸蟲病疫情狀況[J].中國血吸蟲病防治雜志, 2014, 22(5): 68-71.

[6] Jose M M A, Yasuyuki G, Masashi K, et al.Utilization of ELISA using thioredoxin peroxidase-1 and tandem repeat proteins for diagnosis of schistosoma japonicum infection among water buffaloes[J].PLOS Negl Tropl Dis, 2012, 6(8): e1800.

[7] 孫毅, 賈人初, 劉金明, 等.日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫的構建[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2007, 25(5): 406-410.

[8] Ross A G P, Sleigh A C, Li Y S, et al.Schistosomiasis in the People’s Republic of China: prospects and challenges for the 21th century[J].Clin Microbiol Rev, 2001, 14(2): 270-295.

[9] Smith G P, Scott J K.Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous Phage[J].Methods Enzymol, 1993, 217: 228-257.

[10] ParmLey S F, Smith G P.Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification oftarget genes[J].Gene, 1988, 73(2): 305-318.

[11] 高玒, 余傳信, 宋麗君, 等.日本血吸蟲熱休克蛋白70 （SjHSP70）的抗體反應特性及免疫診斷價值[J].中國病原生物學雜志, 2014, 9(8): 699-705.

[12] 唐小牛, 汪學龍, 沈繼龍, 等.日本血吸蟲卵殼蛋白編碼基因的擴增和克隆[J].皖南醫(yī)學院學報, 2002, 21(1): 8-10.

[13] 張莉, 張雷, 李偉.日本血吸蟲卵殼蛋白編碼基因的擴增及克隆[J].大理學院學報, 2009, 8(12): 25-27.

[14] 劉蘭英, 余新炳.日本血吸蟲蟲卵蛋白基因的克隆與表達[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 1998, 16(6): 415-420.

[15] Lu Y, Xu B, Hu W, et al.Identification and profiling of circulating antigens by screening with the sera from schistosomiasis japonica patients[J].Parasit Vectors, 2012, 5: 115.

SCREENING OF A PHAGE DISPLAY CDNA LIBRARY OF SCHISTOSOMA JAPONICUM WITH IGG FROM INFECTED BUFFALO AND CATTLE

FENG Jin-tao, HAN Yu, YUAN Wei, ZHANG Xin, XU Rui, LI Hao, LU Ke, JIN Ya-mei, LIN Jiao-jiao, CHENG Guo-feng, LIU Jin-ming
(Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, National Laboratory of Animal Schistosomiasis Control, Shanghai Veterinary Research Institute ,CAAS, Shanghai 200241, China)

In order to fi nd the effective diagnostic antigen for S.japonicum infection in domestic animals, IgG preparations were purifi ed from serum samples of infected buffalo and cattle and used to screen a phage display cDNA library from 44-day-old worms.After a total of six rounds of biopanning, 53 positive clones were randomly picked and sequenced and 9 ESTs including 2 unnamed ESTs were obtained.With open reading frame (ORF) of 10B capsid protein in phage display vector as the basis, 7 ESTs were determined to be effective display sequences.Among the 7 effectively displayed ESTs, 3 ESTs had higher multiplicity.Among the 51 positive clones sequenced, 25 clones were HSP70 homolog, 15 clones were Keratin 9 and 6 clones were Ornithine-oxo-acid transaminase.These results obtained here suggested that the genes encoding HSP70 homolog, Keratin 9 and Ornithine-oxo-acid transaminase might be relevant to the candidate diagnostic antigens for detection of S.japonicum infection in domestic animals.

Schistosoma japonicum; buffalo; cattle; screening; phage display cDNA library

S852.735

A

1674-6422（2016）02-0062-06

2015-12-28

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費（201303037）；農(nóng)業(yè)部動物疫情監(jiān)測與防治

馮金濤，男，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

劉金明，E-mail：jimyliu@shvri.ac.cn