鄧玲玲，張向前，馮新港，賈英英，許靜秀，史永紅，李 浩，陸 珂，林矯矯,4，苑純秀

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，長春130118； 3.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱150030；4.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009）

·研究論文·

日本血吸蟲不同發(fā)育階段蟲體超微結構觀察

鄧玲玲1，張向前2，馮新港1，賈英英2，許靜秀3，史永紅1，李 浩1，陸 珂1，林矯矯1,4，苑純秀1

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，長春130118； 3.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱150030；4.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009）

為探尋不同發(fā)育階段及不同性別間血吸蟲生物學反應差異性的結構基礎，本研究對不同發(fā)育階段及雌、雄蟲體間的超微結構進行了比較觀察。經比較發(fā)現(xiàn)，血吸蟲的體被和腸上皮兩個直接跟外界接觸的界面均在童蟲階段薄而致密，而成蟲階段這兩個界面都更厚而稀疏。雌蟲體被比同一發(fā)育階段的雄蟲體被致密，基膜比雄蟲厚。了解血吸蟲不同發(fā)育階段及雌雄蟲體間超微結構的差異性，有助于解釋其生物學反應的差異性。

日本血吸蟲；發(fā)育；超微結構

血吸蟲是雌雄異體吸蟲，在尾蚴鉆入宿主皮膚后，要經歷由童蟲逐漸發(fā)育為成蟲的過程。不同發(fā)育階段的蟲體或同一發(fā)育階段的雌、雄蟲體，對于體外培養(yǎng)的適應性[1,2]、藥物的反應[3,4]、抗原性[5-7]等方面都存在差異。功能是以結構為基礎的，不同發(fā)育階段或不同性別蟲體在結構上的差異性是不是造成生物學反應差異性的原因之一，帶著這個問題，本文對不同發(fā)育階段間及雌、雄蟲體間超微結構進行了比較觀察。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和日本血吸蟲尾蚴 BALB/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；日本血吸蟲安徽株尾蚴由上海獸醫(yī)研究所血吸蟲病研究室的釘螺室提供。

1.2 不同發(fā)育階段日本血吸蟲日本血吸蟲（安徽株）尾蚴感染BALB/c小鼠，40～1000條尾蚴/只小鼠，腹部貼片。分別在感染后d7、14、18、23、35、42剖殺，用含有抗凝劑的滅菌PBS溶液從肝門靜脈灌注沖出蟲體，PBS洗滌蟲體3次，去除粘附的血細胞等其它雜質。在解剖鏡下將14、18 d蟲體雌雄分開，肉眼手工將23、35、42 d的蟲體進行雌雄分開。將收集的蟲體浸泡于2.5%的戊二醛（Sigma）溶液中進行前固定，4℃保存。

1.3 不同發(fā)育階段日本血吸蟲透射電鏡樣品 取出前固定樣品，用0.1 mol/L PBS buffer（pH 7.2）沖洗3次，每次15 min。后固定：加入1%鋨酸處理到樣品變黑。再用0.1 mol/L PBS buffer（pH 7.2）沖洗3次，每次15 min。脫水：室溫下，丙酮30%→50% →70%→80%→90%，每級作用30 min，純丙酮再作用3次，每次作用30 min。滲透：無水丙酮/包埋劑＝5:1，作用12 h；無水丙酮/包埋劑＝3:1，作用12 h；無水丙酮/包埋劑＝1:1，作用12 h；無水丙酮/包埋劑＝1:3，作用12 h；無水丙酮/包埋劑＝1:5，作用12 h；純包埋劑45℃作用12 h。包埋：用牙簽將滲透好的樣品挑到包埋板中，45℃聚合12 h，60℃聚合36～48 h。超薄切片：在超薄切片機上進行超薄切片，因7 d蟲體比較小，無法定位，隨機切片外，其他階段的雌雄蟲體均分別選擇腹吸盤下及蟲體后端1/3處進行切片。正染色：超薄切片先醋酸鈾染色30 min，去二氧化碳的雙蒸水清洗3次，再用檸檬酸鉛染色10 min，雙蒸水清洗3次，超薄切片干燥后，進行透射電鏡觀察。透射電鏡型號為：FEI T12。

2 結果

2.1 不同發(fā)育階段血吸蟲體壁超微結構的比較

2.1.1 不同發(fā)育階段蟲體背部體壁的超微結構 圖1示不同發(fā)育階段血吸蟲的背部體壁的超微結構。體壁由體被、基膜及體被下層構成[8]。隨著蟲體的生長發(fā)育，體壁的超微結構也隨之變化。體壁最外層是體被（ 示體被），體被是細胞連體，由體被下層的體被細胞通過胞質小管將其內含物送到蟲體表層形成。14 d（1B）、18 d（1D）、23 d（1F）至42 d （1H）雄蟲間體被逐漸增厚，42 d雄蟲的體被厚度約是18 d雄蟲體被的2倍。體被的組成和結構也在變化，由體被下層運輸?shù)襟w被的分泌小體逐漸增多，如形態(tài)比較規(guī)則的環(huán)形體（ring body，Rb）。電鏡下14 d雄蟲的體被下層能見到少量的環(huán)形體，體被上少量分布。至18 d雄蟲的體被下層環(huán)形體增多，并可見體被細胞（tegumental cell，Tc）分泌的環(huán)形體向體被運輸（1D），體被上的環(huán)形體數(shù)量較14 d增多，至23 d及42 d雄蟲體被上的環(huán)形體數(shù)量繼續(xù)增多。另外還有一些形態(tài)不規(guī)則的顆粒狀或者多膜囊分泌小體也逐漸增多，使得體被由致密逐漸變得疏松。不同發(fā)育階段雌蟲間的體被增厚幅度比相應階段雄蟲間小。體被下是基膜，由基質膜、基底膜和間質層構成，它完整地包裹著整個蟲體。圖2中所示的膠原纖維樣結構即為基膜。相同發(fā)育階段的雌蟲基膜明顯厚于雄蟲，18 d（2A）、23 d（2C）至42 d（2E）雌蟲基膜逐漸增厚，而相應階段的雄蟲基膜厚度差別不大。基膜下依次分布外環(huán)肌、內縱肌及體被細胞等，隨著蟲體的不斷生長發(fā)育肌肉層逐漸增厚。同一發(fā)育階段的雄蟲一般較雌蟲肌肉層厚；雌蟲外環(huán)肌肌纖維束間連接比雄蟲緊密，雄蟲（2B、2D、2F）的外環(huán)肌肌纖維束間連接相對松散，在電鏡下呈淡染。

圖1 日本血吸蟲背部體壁超微結構Fig.1 Ultrastructure of dorsum body wall of Schistosoma japonicum

2.2.2 不同發(fā)育階段蟲體間腹面體壁的超微結構 圖3示14 d（3A）、18 d（3B）、23 d（3C）及42 d （3D）雄蟲的腹面抱雌溝處體壁。血吸蟲的腹面體壁超微結構與背部超微結構有明顯的區(qū)別。腹面抱雌溝內長有體棘，不同部位分布的體棘密度及大小不同，中段體棘密布，前、后段體棘較稀疏。腹面體被厚度比背部體被略薄，結構比背部體被緊密。腹面體被上多見大小和形狀不規(guī)則的顆粒狀或囊泡樣的分泌小體，而在背部體被上較多分布的環(huán)形體在腹面較少見到。被腹面體被下的外環(huán)肌纖維束也存在差異，腹面的明顯比被部的細小。

圖2 日本血吸蟲背部體壁超微結構Fig.2 Ultrastructure of dorsum body wall of Schistosoma japonicum

圖3 不同發(fā)育階段日本血吸蟲腹面體壁超微結構Fig.3 Ultrastructure of ventral body wall of Schistosoma japonicum from different developmental stage

2.3 不同發(fā)育階段蟲體腸壁超微結構 血吸蟲通過口腔不斷吞噬宿主紅細胞，紅細胞在腸道中被蛋白分解酶所消化。圖4顯示不同發(fā)育階段的蟲體腸壁的超微結構，蟲體腸上皮看似由網(wǎng)狀纖維分支互相交織連接而成，網(wǎng)孔中可見線粒體等細胞器，網(wǎng)狀纖維向腸腔內突出纖維細絲，網(wǎng)狀纖維接近蟲體實質的一側分散鑲嵌著腸上皮細胞，腸上皮外由肌層環(huán)繞。隨著蟲體的發(fā)育，腸上皮逐漸增厚，但密度減小，網(wǎng)狀纖維的結構逐漸松散，突出入腸腔的纖維絲逐漸加長加密，纖維絲間隙中充滿消化后的顆粒。由圖5顯示的結構推測，腸上皮是通過兩條臨近的突出網(wǎng)狀纖維絲包繞消化物，末端彼此連接成閉合環(huán)狀，將消化物以內吞的形式進行吸收，網(wǎng)狀纖維組織內可見大小不等的含顆粒的內吞小泡。

圖4 不同發(fā)育階段日本血吸蟲腸上皮超微結構Fig.4 Ultrastructure of intestinal epithelium of Schistosoma japonicum from different developmental stages

3 討論

圖5 日本血吸蟲腸上皮超微結構Fig.5 Ultrastracture of intestinal epithelium of Schistosoma japonicum

血吸蟲為雌雄異體，整個蟲體呈合抱狀。體被和基膜完整包裹蟲體，體被下層的體被細胞通過胞質小管向體被進行物質傳遞。蟲體侵入終末宿主體內后，不斷由宿主血液攝取營養(yǎng)物質，經過消化吸收轉變成自身的組成成分。隨著蟲體的發(fā)育，體被的超微結構也隨之變化，體被逐漸增厚但結構越來越疏松，體被上的分泌小體逐漸增多，這些逐步增加的成分是以宿主物質為原料產生的，因此體被結構里逐漸增加了來源于宿主的成分，這或許是血吸蟲免疫逃避或者抗原偽裝的物質基礎。童蟲階段的體被比成蟲階段的明顯致密，在制備透射電鏡樣品時，固定液不易穿透，因此童蟲的內部結構沒有成蟲看起來清晰。吡喹酮對血吸蟲成蟲具有很強的殺滅效果，對早期鉆入皮膚的童蟲效果差或無效。童蟲階段和成蟲階段體被結構的差異性可能是造成這個結果的原因之一，童蟲階段體被致密，吡喹酮難以透過，無法進入蟲體內部，達不到損傷蟲體的效果。而成蟲階段體被疏松，吡喹酮易于滲透進入蟲體內部，進而殺傷蟲體。體外培養(yǎng)中童蟲比成蟲更容易存活，也可能是由于致密的體被幫助童蟲更好的屏障外界，維持自身的滲透壓和內環(huán)境的穩(wěn)定?；の挥隗w被之下，同一發(fā)育階段的雌蟲基膜明顯比雄蟲厚，而雌性蟲體在體外培養(yǎng)中比雄蟲更易存活，可能是因為雌蟲的體被更緊密且基膜更厚，更好的屏障外界，減少自身的抗原物質與外界接觸。

血吸蟲體被下的肌肉層在背、腹面呈不對稱分布，背部的肌層特別是外環(huán)肌比腹面的明顯粗大，這個結構決定蟲體主要靠背部肌群的收縮和舒張完成前后的匍匐運動。血吸蟲的肌肉中可能包含不隨意肌。新鮮收集的蟲體剪斷后進行培養(yǎng)，在長達2周的時間里，蟲體的每一個片段都可以進行節(jié)律性的顫動，這種顫動可能來自于不受自主神經控制的肌群。這樣看來蟲體寄生在宿主體內，在不進行前后移位時，身體仍會不自主進行節(jié)律性的收縮舒張運動，幫助蟲體消化或者物質的交換運輸。

血吸蟲主要靠在宿主體內攝食紅細胞維持自身的物質和能量供應。腸壁的超微結構比較顯示，伴隨著蟲體的發(fā)育腸上皮逐漸增厚，但是結構逐漸變得疏松。腸管是血吸蟲直接與宿主接觸的界面，在對宿主進行藥物治療時，是與藥物直接接觸的界面。吡喹酮對童蟲的殺傷效果差，除了其體被的致密高，其腸壁的致密度高，藥物難以滲透也是需要考慮的原因。

本研究對血吸蟲不同發(fā)育階段蟲體的超微結構進行了比較觀察，有助于從結構上理解不同發(fā)育階段以及雌雄蟲間在運動、體外培養(yǎng)、抗原性以及對藥物的反應性等方面存在的差異性。

[1] 林建銀, 李瑛, 周述龍.日本血吸蟲肺期童蟲體外培養(yǎng)的初步研究[J].寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 1983, 1(3): 164-166.

[2] 周述龍, 華先欣, 李瑛, 等.長期體外培養(yǎng)日本血吸蟲的體被及消化道的透射電鏡觀察[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 1992, 10(1): 5-7.

[3] 肖樹華, Catto B A, Webster L T, 等.不同發(fā)育期的曼氏血吸蟲對吡喹酮敏感性差異的體內、體外試驗觀察[J].寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 1983, (4): 17-18.

[4] 肖樹華, 尤紀青, 張榮泉.吡喹酮對不同發(fā)育期血吸蟲皮層損害的掃描電鏡觀察[J].藥學學報, 1985, 20(8): 577-583.

[5] 孟瑋, 吳忠道, 余新炳.血吸蟲肺期童蟲抗原的應用前景[J].熱帶醫(yī)學雜志, 2002, 2(1): 72-75.

[6] 方會龍, 曾慶仁, 楊志英, 等.日本血吸蟲不同發(fā)育階段抗原免疫反應性的差異研究[J].湘南學院學報（醫(yī)學版）, 2007, 9(3): 3-7.

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[8] 周述龍, 蔣明森, 林建銀, 等.日本血吸蟲超微結構[M].武漢: 武漢大學出版社, 2005: 3-30.

ULTRASTRUCTURAL COMPARISON OF SCHISTOSOMA JAPONICUM AT DIFFERENT DEVELOPMENTAL STAGES AND GENDERS

DENG Ling-ling1, ZHANG Xiang-qian2, FENG Xin-gang1, JIA Ying-ying2, XU Jing-xiu3, SHI Yong-hong1, LI Hao1, LU Ke1, LIN Jiao-jiao1,4, YUAN Chun-xiu1(1.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 3.College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 4.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

To explore the structural basis that might cause diverse responses to biological treatments, the ultrastructures of worms at different developmental stages and genders of Schistosoma japonicum were compared in the present study.The teguments and intestinal epitheliums, through which worms contacted with the outside world directly, were thinner and more compact in schistosomulums than in adults.The teguments of female worms were more compact than in male worms at the same stage while the basal lamina of female worms were thicker than male worms at the same stage.The differences on ultrastructures may help explain different biological responses at different developmental stages or different genders of Schistosoma japonicum.

Schistosoma japonicum; development stages; ultrastructure

S852.735

A

1674-6422（2016）02-0042-05

2015-12-15

公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201303037）；國家自然基金項目（31172315）

鄧玲玲，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

苑純秀，E-mail：yuanchx@shvri.ac.cn