李 聰，董 輝，朱順海，朱雪龍，王自文，趙其平，夏偉麗,2，門啟斐,2，黃 兵,3，韓紅玉

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3.江蘇省動(dòng)物動(dòng)物疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

·研究論文·

柔嫩艾美耳球蟲胱硫醚β合成酶基因克隆及在真核細(xì)胞中的表達(dá)

李 聰1，董 輝1，朱順海1，朱雪龍1，王自文1，趙其平1，夏偉麗1,2，門啟斐1,2，黃 兵1,3，韓紅玉1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3.江蘇省動(dòng)物動(dòng)物疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

為構(gòu)建柔嫩艾美耳球蟲胱硫醚β合成酶（Eimeria tenella cystathionine β-synthase，Et CBS）基因的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFC-VC155-EtCBS，利用RACE技術(shù)克隆了Et CBS基因的全長cDNA序列，對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。通過RT-PCR擴(kuò)增含完整開放閱讀框（open reading frame，ORF）的cDNA片段，將其與真核表達(dá)載體pBiFC-VC155連接，經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，用免疫印跡和間接免疫熒光技術(shù)鑒定重組蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，成功獲得了Et CBS基因的全長cDNA序列，該基因全長2423 bp，ORF位于第201～2087 bp之間，編碼629個(gè)氨基酸，編碼蛋白的分子量約為68 kDa。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白不具有信號(hào)肽，也不存在跨膜結(jié)構(gòu)。Western blot可見大小約為68 kDa的重組表達(dá)蛋白條帶，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示在轉(zhuǎn)染的DF-1細(xì)胞中能檢測到綠色熒光。研究結(jié)果表明，本研究已成功獲得了Et CBS基因的全長cDNA序列，成功構(gòu)建了Et CBS基因含完整ORF的真核重組表達(dá)質(zhì)粒，并在DF-1細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，為深入研究Et CBS基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

柔嫩艾美耳球蟲；胱硫醚β合成酶；DF-1細(xì)胞；真核表達(dá)

雞球蟲病是由多種艾美耳球蟲寄生于雞腸道上皮細(xì)胞引起的一種寄生性原蟲病[1]，是一種危害極為嚴(yán)重的全球性寄生蟲病。據(jù)報(bào)道全世界每年用于球蟲病預(yù)防和治療的費(fèi)用，以及因球蟲病引起的損失高達(dá)3億美元，給世界家禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。雞球蟲是屬于頂復(fù)器門（Apicomplexa）、艾美耳屬（Eimeria）的一類寄生于雞腸道的原蟲。頂復(fù)器原蟲多數(shù)是專一性的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，包括瘧原蟲（Plasmodium）、弓形蟲（Toxoplasma）、艾美耳球蟲（Eimeria）、隱孢子蟲（Cryptosporidium）等，有復(fù)雜的生活史，需入侵宿主細(xì)胞，完成生活史循環(huán)需要更替一個(gè)或多個(gè)宿主，或更換不同的細(xì)胞和組織，因而成功地入侵宿主細(xì)胞是這類寄生蟲感染建立的前提。雖然頂復(fù)器原蟲入侵的宿主細(xì)胞不同，包括紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和消化道細(xì)胞等，但都有一個(gè)共同的高度保守的入侵機(jī)制[3]。當(dāng)蟲體粘附宿主細(xì)胞后，在蟲體頂端和宿主細(xì)胞膜表面會(huì)形成一個(gè)緊密的運(yùn)動(dòng)連接環(huán)（moving junction，MJ）[4]。對(duì)弓形蟲、瘧原蟲等頂復(fù)器門原蟲的研究表明，MJ對(duì)蟲體成功入侵宿主細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用[5]，可作為支架推動(dòng)蟲體進(jìn)入帶蟲空泡。另外，MJ還具有分子篩的功能，可以選擇性的吸收宿主蛋白形成帶蟲空泡，阻止許多宿主細(xì)胞膜蛋白進(jìn)入帶蟲空泡，從而保護(hù)蟲體免受宿主溶酶體的破壞，逃避宿主的免疫反應(yīng)[6]。研究發(fā)現(xiàn)MJ的形成是依賴棒狀體和微線分泌的蛋白，其中微線分泌的頂膜抗原1（apical membrance protein-1，AMA1）和棒狀體分泌的棒狀體頸部蛋白（rhoptry neck proteins，RONs）是組成MJ的主要分子，在蟲體入侵過程中發(fā)揮重要作用[7-9]。目前，對(duì)AMA1在弓形蟲和瘧原蟲入侵細(xì)胞過程中與棒狀體頸部蛋白等形成復(fù)合體，參與MJ的形成及在入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮作用的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。雖然雞球蟲和弓形蟲、瘧原蟲同屬于頂復(fù)器門原蟲，基因組分析也發(fā)現(xiàn)雞球蟲有組成MJ復(fù)合體的同源蛋白AMA1和RONs，但是在雞球蟲中，還沒有對(duì)AMA1進(jìn)行深入的研究，目前只對(duì)AMA1進(jìn)行了一些初步的研究。姜連連等[10]根據(jù)柔嫩艾美耳球蟲AMA1基因的ESTs序列，利用RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得AMA1基因的全長cDNA序列，體外抑制結(jié)果顯示Et AMA1參與了柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵DF-1細(xì)胞。王燁等[11]構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-Et AMA1，對(duì)其免疫保護(hù)效果研究發(fā)現(xiàn)該真核表達(dá)重組質(zhì)粒對(duì)柔嫩艾美耳球蟲感染具有一定的免疫保護(hù)力。為了解柔嫩艾美耳球蟲AMA1（Et AMA1）的相互作用分子以及在蟲體入侵過程中發(fā)揮的作用，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中利用酵母雙雜交技術(shù)，以Et AMA1為誘餌，篩選柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫，獲得了一些可能與Et AMA1相互作用蛋白的ESTs序列[12]。這些蛋白分子可能參與了柔嫩艾美耳球蟲入侵宿主細(xì)胞，在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。因此，我們選擇編號(hào)為23的EST序列進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行研究，該EST序列含3'端Ploy（A）尾，Blast分析與柔嫩艾美耳球蟲推測的胱硫醚β合成酶（cystathionine β-synthase of Eimeria tenella，Et CBS）同源。本研究利用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技術(shù)擴(kuò)增獲得了該基因的全長cDNA序列，通過RT-PCR擴(kuò)增其開放閱讀框，連接到真核表達(dá)載體pBiFC-VC155上，構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFC-VC155-Et CBS，并在DF-1中成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究該蛋白的特性和功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)蟲株和菌株 柔嫩艾美耳球蟲（資源編號(hào)：CAAS21111611）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所原蟲病團(tuán)隊(duì)保存；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自上海天根生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 載體、抗體和細(xì)胞 兔源性抗重組Et CBS（rEt CBS）蛋白抗體由本課題組制備保存；真核細(xì)胞DF-1由上海獸醫(yī)研究所丁鏟研究員饋贈(zèng)；pGEM-Teasy載體克隆載體購自美國Promega公司；雙分子熒光互補(bǔ)載體pBiFC-VC155由上海獸醫(yī)研究所劉光清研究員饋贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑與工具酶 Trizol、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Bgl Ⅱ均購于大連寶生物工程有限公司；Lipofectamine 2000、opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗購自Sigma公司；胎牛血清和DMEM購自美國Gibco 公司；熒光（DyLight 488）標(biāo)記羊抗兔IgG購自LI-COR 公司；RIPA 裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 子孢子的收集和純化 將2.0×105柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊接種7日齡無球蟲雛雞，d 8收集未孢子化卵囊，在適宜條件下孢子化，待90%的卵囊為孢子化卵囊時(shí)，收集純化孢子化卵囊。將純化的孢子化卵囊加入含有適量滅菌PBS的玻璃勻漿器中，研磨至孢子囊完全釋放，加入適量滅菌的HBBS，946×g離心10 min，將沉淀用HBBS重懸轉(zhuǎn)移至三角燒瓶中，向其中加入0.5%的胰蛋白酶和5%的雞膽汁，混勻后41℃水浴消化至95%以上的子孢子逸出，G3砂芯漏斗過濾，反復(fù)離心后，置于液氮保存。

1.2.2 總RNA的提取 按照Trizol試劑的說明書進(jìn)行操作，提取子孢子的總RNA，取少量進(jìn)行甲醛凝膠變性電泳分析總RNA的完整性，用紫外分光光度計(jì)測定濃度并分析純度，符合要求后用于RACE模板的制備。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成

1.2.3.1 RACE引物 根據(jù)編號(hào)為23的EST 序列，該序列含有3' 端poly（A）尾，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增5' 端RACE的特異性引物。3'端引物：5'-GG CAAGAGACACCTGCGGCAGTGCCC-3'；巢式引物：5'-CTGCGGCAGTGCCCACGCGTGACAGG-3'；5'公用引物由試劑盒提供，包括 GeneRacerTM5' 引物： 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'和GeneRacerTM5' 巢式引物：5'-GGACACTGACATGG ACTGAAGGAGTA-3'。

1.2.3.2 ORF擴(kuò)增引物 根據(jù)拼接的全長cDNA 序列，設(shè)計(jì)上下游引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增含完整ORF 的cDNA 片段，在上下游引物引入酶切位點(diǎn)EcoR I和Bgl Ⅱ。上游引物：5'-CGAATTCGGGCCACCATG GAACCCATTAACAGCAGGCAGT-3'；下游引物：5'-GCAGATCTGAGGAAGCGAACATTCCCCCTGC T-3'。所有引物均由上海賽百盛公司合成。

1.2.4 Et CBS基因的克隆與測序

1.2.4.1 cDNA 5'端的擴(kuò)增和測序 利用GeneRacerTMKit擴(kuò)增Et CBS基因的5'端，具體步驟按照說明書操作，對(duì)提取的柔嫩艾美耳球蟲子孢子總RNA 依次進(jìn)行去磷酸化、去mRNA 帽結(jié)構(gòu)、連接RNA Oligo接頭、反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，然后進(jìn)行cDNA 的5' 端擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系：含模板1 μL，上游引物1.5 μL、下游引物1 μL，總體積為25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 2 min ；94℃變性 30 s，72℃延伸 1 min，5 個(gè)循環(huán)；94℃變性 30 s，70℃延伸1 min，5 個(gè)循環(huán)；94℃預(yù)變性 30 s，64℃退火30 s，72℃延伸 1 min，25 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取 10 μL 進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，無特異性條帶，則以上一輪PCR產(chǎn)物為模板繼續(xù)進(jìn)行nested PCR，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 2 min ；94℃變性 30 s，68℃退火 30s，72℃延伸2 min，25個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL 進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，回收特異性條帶與pGEM-Teasy 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑菌落過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR 鑒定。經(jīng)鑒定分子量大小與預(yù)期一致的陽性菌落，送上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4.2 Et CBS基因ORF序列的擴(kuò)增和測序 對(duì)5' RACE PCR的序列進(jìn)行分析，利用NCBI的去載體序列分析軟件去除載體序列，再利用DNAStar軟件查找5' RACE PCR產(chǎn)物的序列與原EST序列的重疊部分，將兩段序列拼接即可獲得全長cDNA序列。根據(jù)拼接的目的基因全長cDNA序列，利用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增ORF。PCR 擴(kuò)增體系含模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，總體積為20 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 2 min ；94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，回收特異性條帶與pGEM-T easy載體連接，轉(zhuǎn)化TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑菌落過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR 鑒定。經(jīng)鑒定分子量大小與預(yù)期一致的陽性菌落，送上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 Et CBS基因的生物信息學(xué)分析 利用NCBI的在線軟件ORF finder分析獲得的新基因全長cDNA序列,找出編碼框。利用ProtParam工具（http://cn.expasy.org/tools/protparam.html）計(jì)算編碼蛋白質(zhì)的理論分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等。利用TMHMM服務(wù)器（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析編碼蛋白有無跨膜結(jié)構(gòu)。利用SignalP3.0在線分析軟件（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）分析編碼蛋白有無信號(hào)肽。利用ProtScale分析軟件（www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）分析編碼蛋白的疏水性。采用motif_scan（http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/ motif_scan）尋找氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域。利用北京大學(xué)生物信息中心WebLab中提供的Antigenic程序（http://weblab.cbi.pku.edu.cn/program.inputForm.do?program=antigenic）分析其抗原位點(diǎn)。采用NCBI服務(wù)器中的CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ structure/cdd/cdd.shtml）程序?qū)Π被嵝蛄羞M(jìn)行功能保守域分析，判斷該蛋白是否具有完整的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.6 真核重組質(zhì)粒pBiFC-VC155-Et CBS的構(gòu)建 小提質(zhì)粒參照上海天根生物技術(shù)有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-Et CBS和空載體pBiFC-VC155，利用EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ?qū)χ亟M質(zhì)粒和空載體分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后膠回收空載體條帶和目的條帶。將回收的目的基因與空載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，連接體系中含2×Rapid Ligation Buffer 10.0 μL、Et CBS基因 7.0 μL、pBiFC-VC155載體2.0 μL、T4 DNA Ligase 1.0 μL。16℃連接6 h以上，轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取白斑至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒用EcoR I和BglⅡ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，陽性克隆送至上海桑尼生物有限公司進(jìn)行測序。

1.2.7 DF-1細(xì)胞的培養(yǎng)以及真核重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 從液氮中取出DF-1細(xì)胞，迅速放入37℃水浴，細(xì)胞液融化后將其420×g離心5 min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)吸出凍存液，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，然后接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中，并加入足量的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶放入37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)細(xì)胞至80%～90%豐度后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，加入完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種約60萬個(gè)細(xì)胞，放入37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至長滿約80%時(shí)，將空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine 2000操作說明進(jìn)行，6 h后將孔中溶液更換為含2%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，在37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，分別用Western blot和間接免疫熒光（indirect immunoinfluscence assay，IFA）檢測表達(dá)情況。

1.2.8 Western blot鑒定真核重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFCVC155-Et CBS在DF-1中的表達(dá)情況 收集轉(zhuǎn)染過pBiFC-VC155-Et CBS和pBiFC-VC155并培養(yǎng)48 h的DF-1細(xì)胞，加入Western及IP細(xì)胞裂解液100 μL充分裂解細(xì)胞后，4℃、10 509×g離心3 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，全濕法電轉(zhuǎn)PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜。PBS洗滌3次，加入1:100稀釋的抗rEt CBS 蛋白兔血清，37℃孵育2 h；PBST洗膜3次，加入1:10 000稀釋的熒光（DyLight 488）標(biāo)記羊抗小鼠IgG，37℃孵育2 h，PBST洗膜5次，PBS洗膜3次，用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.9 間接免疫熒光（IFA）鑒定真核重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFC-VC155-Et CBS在DF-1中的表達(dá) 為了檢測真核重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFC-VC155-Et CBS在DF-1中的表達(dá)情況，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，分別向每孔中加入2%多聚甲醛1 mL固定15 min；PBST洗滌3遍，加入1%Triton X-100 mL，室溫下作用15 min；用PBST洗3次，加入2%BSA/PBS 2 mL，4℃封閉過夜；PBST洗滌3遍，加入1:100稀釋的抗rEt CBS 蛋白兔源血清，37℃作用1 h；PBST洗滌3次，加入1:400稀釋的綠色熒光標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃作用1 h，PBS洗滌3次后再熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Et CBS基因的生物信息學(xué)分析 該序列全長2423 bp，包括5' 的UTR序列，長200 bp，含有CAAT序列，沒有TATA序列；3' 端UTR序列，長336 bp，含poly（A）尾，沒有典型的AATAAA序列，ORF 長1887 bp，編碼629個(gè)氨基酸（圖1），理論分子量為68 kDa，預(yù)測等電點(diǎn)為5.23。在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為48.93，高于域值40，在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定，脂肪族指數(shù)88.76，總平均親水性-0.176；信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)的分析表明：該基因編碼的蛋白不具有信號(hào)肽，也不存在跨膜結(jié)構(gòu)。疏水性分析顯示最大值為2.911，最小值為-3.900?？乖稽c(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白可能有24個(gè)抗原位點(diǎn)。Coil區(qū)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白不具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白可能含有4個(gè)N端糖基化位點(diǎn)，1個(gè)cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，8個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，13個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)異戊烯基的結(jié)合位點(diǎn)。與柔嫩艾美耳球蟲基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.genedb.org/ Homepage/Etenella）比較發(fā)現(xiàn)，該基因的ORF與保守的假象蛋白（hypothEtical protein，conserved，ETH_00004510）100%同源，利用NCBI的CDD程序?qū)υ摶蚓幋a的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行搜索，結(jié)果顯示該基因編碼的氨基酸有胱硫醚-β-合成酶（cystathionine β-synthase）位點(diǎn)。使用NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）BLAST發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白與柔嫩艾美耳球蟲推測的胱硫醚β合成酶（cystathionine β-synthase）100%同源，因此命名該基因?yàn)槿崮郯蓝蛳x胱硫醚β合成酶（Et CBS）。

圖1 Et CBS cDNA的核苷酸序列及其氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and predicted amino acid sequences of Et CBS gene

2.2 Et CBS基因ORF的克隆 根據(jù)拼接的全長cDNA序列，利用合成的引物以柔嫩艾美耳球蟲子孢子的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增含ORF的cDNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在1887 bp處有特異性的單一條帶，與預(yù)期大小一致（圖2）。將其回收后與pGEM-T easy載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TOP10，經(jīng)菌液PCR、雙酶切、測序鑒定正確，表明成功擴(kuò)增獲得Et CBS基因含ORF的cDNA片段。

圖2 Et CBS的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplifi cation of Et CBS by PCR

2.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pBiFC-VC155- Et CBS的構(gòu)建 分別用EcoR I 和Bgl Ⅱ?qū)﹁b定正確的重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-Et CBS和空載體pBiFC-VC155進(jìn)行雙酶切，膠回收純化后進(jìn)行連接，構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFC-VC155-Et CBS。對(duì)該重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果顯示均為陽性，測序結(jié)果顯示該基因正確插入，表明真核重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFC-VC155-Et CBS構(gòu)建成功（圖3）。

2.4 Western blot鑒定真核重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFCVC155- Et CBS在DF-1中的表達(dá)情況 Western blot 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFCVC155-Et CBS的DF-1細(xì)胞中可檢測到大小約為68 kDa的目的條帶，而轉(zhuǎn)染空載體的DF-1細(xì)胞中卻沒有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，這表明構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFC-VC155-Et CBS在DF-1細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染和表達(dá)（圖4）。

2.5 間接免疫熒光（IFA）鑒定真核重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFC-VC155- Et CBS在DF-1中的表達(dá)情況 用rEt CBS蛋白免疫兔制備的多克隆抗血清和綠色熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗作用后，進(jìn)行免疫熒光檢測。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染真核重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFC-VC155- Et CBS的DF-1細(xì)胞中，可以看到特異的綠色熒光，而在轉(zhuǎn)染pBiFC-VC155空載體的DF-1細(xì)胞中，則無綠色熒光（圖5）。結(jié)果表明重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFCVC155- Et CBS在DF-1細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染和表達(dá)。

圖3 重組質(zhì)粒pBiFC-VC155- Et CBS的PCR及雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 PCR and restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pBiFC-VC155-Et CBS

圖4 pBiFC-VC155- Et CBS重組蛋白Western blot分析結(jié)果Fig.4 Western blot analysis of recombinant pBiFCVC155- Et CBS protein

圖5 重組質(zhì)粒pBiFC-VC155- Et CBS表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光檢測Fig.5 IFA result of recombinant plasmids pBiFC-VC155-Et CBS expression product

3 討論

本研究獲得的Et CBS基因，是根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室利用柔嫩艾美耳球蟲Et AMA1為誘餌蛋白，篩選子孢子酵母雙雜交cDNA文庫獲得的EST，然后利用RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得的，因此該蛋白很可能與Et AMA1相互作用，參與子孢子入侵宿主細(xì)胞的過程。該基因全長2423 bp，包括5' 的UTR序列，長200 bp，含有CAAT序列，沒有TATA序列；5'UTR是指從真核生物mRNA 5' 末端的帽子結(jié)構(gòu)到起始密碼子之間的序列，是核糖體識(shí)別元件之一，主要參與翻譯調(diào)節(jié)，影響轉(zhuǎn)錄后的各個(gè)階段，包括mRNA的穩(wěn)定，折疊和核糖體的相互作用。3' 端UTR序列，長336 bp，含poly（A）尾，沒有典型的AATAAA序列，主要影響RNA的水平。對(duì)該基因ORF編碼的氨基酸序列抗原位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白可能有24個(gè)抗原位點(diǎn)，推測該蛋白具有良好的免疫原性，極有可能是很好的藥物靶標(biāo)。使用NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）BLAST發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白與柔嫩艾美耳球蟲推測的胱硫醚β合成酶100%同源。胱硫醚β-合成酶（CBS）是一種磷酸吡哆醛依賴型酶，以3個(gè)結(jié)構(gòu)域和1個(gè)血紅素結(jié)構(gòu)域組成的同源四聚體的形式存在，在動(dòng)物體內(nèi)是催化同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）轉(zhuǎn)硫途徑的關(guān)鍵酶，其活性的下降容易導(dǎo)致HCY異常升高而形成同型半胱氨酸血癥[13]。目前，人類[14]和哺乳動(dòng)物CBS[15]的研究已經(jīng)非常透徹，但對(duì)雞球蟲CBS的研究還未有報(bào)道，CBS是否在雞球蟲入侵宿主細(xì)胞過程以及生活史的完成過程中發(fā)揮重要作用，還需要進(jìn)一步的研究，本研究成果對(duì)進(jìn)一步研究雞球蟲的CBS提供了基礎(chǔ)。

雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)BiFC（bimolecular fluorescence complementation）是將熒光報(bào)告蛋白按照規(guī)則分成沒有熒光的兩段，分別與誘餌蛋白和捕獲蛋白融合，只有在誘餌蛋白和捕獲蛋白發(fā)生相互作用的情況下，兩段不完整的熒光報(bào)告蛋白才會(huì)形成完整的報(bào)告蛋白，發(fā)出熒光[16]。BiFC技術(shù)不需要提取蛋白，在活細(xì)胞內(nèi)可視化的觀察蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系[17,18]，該技術(shù)是將特定的熒光蛋白分子從環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特定位點(diǎn)切割成N端片段和C端片段，然后將其和擬觀察的目的蛋白融合表達(dá)。如果目的蛋白間可以相互作用，它們會(huì)相互靠近，使熒光蛋白的活性恢復(fù)，發(fā)出特定熒光[19]。根據(jù)切割位置的不同，目前有7對(duì)可以發(fā)出特定波長的雙分子熒光載體，其中pBiFC-VC155和pBiFC-VN155就是將綠色熒光蛋白GFP從155位氨基酸處切開得到的一對(duì)雙分子熒光載體[20]。本實(shí)驗(yàn)中成功地將Et CBS基因連接到pBiFC-VC155上與GFP的C端融合表達(dá)，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，48 h后分別用IFA和Western blot 檢測到構(gòu)建的重組真核質(zhì)粒能在DF-1細(xì)胞中成功表達(dá)，因此，在后續(xù)的試驗(yàn)中可以進(jìn)一步探討Et CBS基因和Et AMA1是否相互作用。

近年來，為了深入研究核酸疫苗和雞球蟲的功能基因，許多研究者將雞球蟲功能基因連接到真核表達(dá)載體上，成功構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒，并在不同的真核細(xì)胞中獲得表達(dá)。王曄等[21]在293T細(xì)胞中表達(dá)了柔嫩艾美耳球蟲棒狀體蛋白2（ROP2）。劉穎麗等[22]在Hela細(xì)胞中成功表達(dá)了柔嫩艾美耳球蟲的微線體蛋白2（Et MIC2）。但是這些表達(dá)球蟲蛋白所用的細(xì)胞均來自于哺乳動(dòng)物而并非來自球蟲的宿主雞。本研究用雞胚成纖維細(xì)胞DF-1來表達(dá)Et CBS基因，DF-1細(xì)胞系是一種穩(wěn)定的、無腫瘤基因、自發(fā)無限增殖的細(xì)胞系，有正常的成纖維細(xì)胞形態(tài)，目前被廣泛用于動(dòng)物病毒研究、疫苗研制、癌癥研究等諸多領(lǐng)域，是生命科學(xué)領(lǐng)域重要的病毒轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)生物的材料[23,24]。Lee等[25]研究發(fā)現(xiàn)，和MDCK細(xì)胞系相比較，DF-1細(xì)胞系對(duì)禽流感病毒有更高的轉(zhuǎn)染效率和復(fù)制率。王永強(qiáng)等[26]的研究表明DF-1細(xì)胞比CEF細(xì)胞系更適合傳染性法氏囊病病毒的傳代。近年來，DF-1細(xì)胞也被用于雞球蟲體外培養(yǎng)的研究。姜連連等[27]首次建立了柔嫩艾美耳球蟲DF-1傳代細(xì)胞培養(yǎng)體系，子孢子在該培養(yǎng)體系中可以發(fā)育為第一代裂殖子，表明該細(xì)胞系可以用于雞球蟲的體外研究。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功利用該細(xì)胞表達(dá)了柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白 CHP559[28]和沉默信息調(diào)節(jié)因子2（silence information regulator 2，EtSIR2）[29]。

本研究首先利用RACE技術(shù)克隆獲得了EtCBS基因含一個(gè)完整ORF的全長序列，通過RT-PCR擴(kuò)增得到含完整開放閱讀框的基因片段，并將其與真核表達(dá)載體pBiFC-VC155連接，成功構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFC-VC155-Et CBS，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示在DF-1細(xì)胞中檢測到綠色熒光。研究結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)已成功獲得了Et CBS的全長序列并成功構(gòu)建了Et CBS的真核重組表達(dá)質(zhì)粒，且在真核細(xì)胞DF-1中獲得表達(dá)。由于DF-1來自于柔嫩艾美耳球蟲天然宿主的本源細(xì)胞，以其為平臺(tái)更有利于研究球蟲基因的功能以及與宿主蛋白間的互作關(guān)系。本研究結(jié)果將為深入研究Et CBS基因的功能以及驗(yàn)證該基因與Et AMA1的相互作用關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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GENE CLONING AND EUKARYOTIC EXPRESSION OF CYSTATHIONINE β-SYNTHASE OF EIMERIA TENELLA

LI Cong1, DONG Hui1, ZHU Shun-hai1, ZHU Xue-long1, WANG Zi-wen1, ZHAO Qi-ping1, XIA Wei-li1,2, MEN Qi-fei1,2, HUANG Bing1,3, HAN Hong-yu1
(1.Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Life and Environment Sciences; Shanghai Normal Unversity, Shanghai 200234, China; 3.Jiangsu Coinnovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infections Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

The objective of the present study was to construct recombinant expression plasmids of cystathionine β-synthase of Eimeria tenella (Et CBS) and study the expression of Et CBS gene in transfected DF-1 cells.The full-length cDNA of EtCBS was obtained using rapid amplifi cation of cDNA ends (RACE).The ORF of Et CBS was amplifi ed in RT-PCR and ligated to the eukaryotic expression vector pBiFC-VC155.The recombinant plasmid pBiFC-VC155-Et CBS was confi rmed in PCR and restriction enzyme digestion.Subsequently, the recombinant plasmid was transfected into DF-1 cells.Western blot and indirect immunofl uorescence assay (IFA) were used to examine the expression of recombinant Et CBS.The results showed that the full-length cDNA of Et CBS was 2423 bp in length and contained a 1887-bp ORF located between 201～2087 bp encoding 407 amino acids with molecular weight of 68 kDa.The deduced amino acidsequence of the protein had neither transmembrane region nor signal peptide.Western blot indicated that a protein with molecular weight of 68 kDa in the transfected cells was strongly recognized by the antiserum of recombinant Et CBS protein (rEtCBS).Specifi c green fl uorescence was observed in the DF-1 cells by IFA.These results will provide important rationale to study the functions of Et CSB.

Eimeria tenella; cystathionine β-synthase; DF-1 cell; eukaryotic expression

S852.723

A

1674-6422（2016）02-0053-09

2015-12-18

國家自然科學(xué)基金（31201699、31572266）；農(nóng)業(yè)部中央級(jí)公益性科研院所項(xiàng)目（2015JB10）

李聰，女，碩士研究生，獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

韓紅玉，E-mail：hhysh@shvri.ac.cn