馬麗貞，李丹丹,2，苑純秀，艾 敏，史曉娜,2，塔 娜，馮新港

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物寄生蟲學重點開發(fā)實驗室，上海200241；2.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海200234）

·研究論文·

日本血吸蟲鈣網質蛋白活化宿主巨噬細胞的初步研究

馬麗貞1，李丹丹1,2，苑純秀1，艾 敏1，史曉娜1,2，塔 娜1，馮新港1

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物寄生蟲學重點開發(fā)實驗室，上海200241；2.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海200234）

為研究日本血吸蟲鈣網質蛋白（Schistosoma japonicum calreticulin protein，SjCRT）活化小鼠巨噬細胞的功能，利用桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)所表達的真核重組的SjCRT蛋白與巨噬細胞共培養(yǎng)72 h，采用流式細胞術檢測巨噬細胞表面趨化因子受體CCR7的表達。收集SjCRT蛋白刺激72 h后的巨噬細胞，抽提RNA并反轉錄為cDNA，利用RT-PCR檢測環(huán)加氧酶（cyclooxygenase，COX-2）、磷脂酶A2 （phospholipases A2，PLA2）、TNF-α和IL-1β基因的表達。SjCRT與巨噬細胞共孵育72 h后收集上清，ELISA檢測上清中TNF-α的含量，Griess法測上清中NO的含量。流式結果顯示，與對照組相比，SjCRT蛋白刺激組的巨噬細胞表面CCR7的表達量增高且差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，SjCRT蛋白刺激組巨噬細胞的COX-2、cPLA2、TNF-α和IL-1β表達量顯著升高。ELISA結果顯示，SjCRT能夠刺激巨噬細胞分泌致炎性因子TNF-α。Griess法表明SjCRT能夠促進巨噬細胞分泌NO。本研究結果表明SjCRT能活化小鼠巨噬細胞，為闡明其在RA血吸蟲疫苗中的功能等提供基礎資料。

日本血吸蟲；鈣網質蛋白；巨噬細胞；趨化因子受體；細胞因子

日本血吸蟲病目前仍是嚴重威脅我國人畜健康、制約我國經濟發(fā)展的一大疾病[1]。開發(fā)高效、安全、實用的抗血吸蟲疫苗是實現(xiàn)控制血吸蟲病的保障[2]。大量研究表明，通過模擬輻照致弱血吸蟲尾蚴或童蟲疫苗（radiation attenuated vaccine，RAV）誘導的高保護性效應機理來研發(fā)高效而又安全的分子疫苗可能是一條值得探索的新途徑，因此探索RAV的高保護性效應機制成為學者們關注的熱點課題，其中RAV的免疫原性分子與細胞基礎及機制等問題尤其受到重視[3]。研究表明，RA血吸蟲疫苗能夠誘生高保護性免疫效果，其機制可能是通過RA 血吸蟲來源的分子刺激宿主免疫細胞在肺部形成了以Th1為主的致炎性環(huán)境而實現(xiàn)的[4]。發(fā)現(xiàn)和鑒定這些保護性分子并闡明其免疫生物學功能，對研發(fā)高效安全的抗血吸蟲分子疫苗具有重要的指導意義。

Perona-Wright等[5]鑒定了曼氏血吸蟲的鈣網質蛋白（calreticulin，CRT）是輻照致弱血吸蟲疫苗的一種免疫顯性T細胞抗原。本實驗室陳雷等[6]發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲的鈣網質蛋白（Schistosoma japonicum calreticulin protein，SjCRT）含有一個雜合型的Th1細胞表位。李瑩等[7]的研究結果也顯示SjCRT在RA日本血吸蟲童蟲（7日齡）來源的細胞中呈現(xiàn)出高表達，且可以刺激小鼠樹突狀細胞的表型成熟。據(jù)此，我們初步推斷SjCRT可能是RA血吸蟲來源的候選保護性分子，并且在誘導宿主形成致炎性環(huán)境中發(fā)揮一定的作用。相關的研究還顯示，巨噬細胞在介導殺滅肺期童蟲和形成肺部炎性反應環(huán)境中發(fā)揮重要作用[8]。本研究以小鼠巨噬細胞RAW264.7為模型，檢測其在SjCRT刺激下致炎性細胞因子及趨化因子受體等的分泌表達情況，為進一步鑒定SjCRT的致炎性免疫生物學特性、闡明其在RA血吸蟲疫苗中的功能等提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 蛋白 SjCRT蛋白為中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所農業(yè)部動物寄生蟲學重點實驗室構建保存的桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)所表達[7]。

1.2 巨噬細胞 RAW264.7小鼠巨噬細胞株為中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所農業(yè)部動物寄生蟲學重點實驗室保存。

1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；胎牛血清購自Gibco公司；PE標記的抗CCR7單抗購自BD公司；反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；Mouse TNF-α ELISA Ready-SET-Go Kit購自eBioscience公司；GoTaq?qPCR Master Mix Kit 購自Promega中國公司；NO檢測試劑盒購自普利萊基因技術有限公司；引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司引物合成；其他試劑為進口或國產分析純。

1.4 引物設計 根據(jù)小鼠GAPDH、cPLA2、COX-2、TNF-α、IL-1β的基因序列，利用primer5.0軟件分別設計針對這幾個基因的特異性引物，由上海英濰捷基生物技術有限公司合成，其序列見表1。

表1 擴增基因所用引物Table1 Primers used in RT-PCR

1.5 實驗方法

1.5.1 巨噬細胞的培養(yǎng) RAW264.7細胞復蘇后，用含體積分數(shù)為10%的胎牛血清和1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中定期傳代。實驗時采用處于對數(shù)期生長的細胞。

1.5.2 SjCRT蛋白刺激巨噬細胞 調整巨噬細胞濃度為1×107個/mL，加入48孔細胞培養(yǎng)板中（100 μL/孔），實驗組加入真核表達蛋白SjCRT，調節(jié)濃度為 50 μg/mL，同時設未刺激組和LPS（50 ng/mL）對照組，補充培養(yǎng)基至1 mL/孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5.3 ELISA檢測SjCRT刺激巨噬細胞后TNF-α的分泌情況 按照上述方法處理巨噬細胞并收集培養(yǎng)細胞的上清。按照說明書要求稀釋各種溶液，將包被抗體加至96孔酶標板中（100 μL/孔），4℃包被過夜；0.05% PBST洗3遍，用200 μL assay diluent室溫封閉1 h；0.05%PBST洗3遍，將樣品及標準品加到96孔板合適的孔中室溫孵育2 h（100 μL/孔）；0.05% PBST洗3遍，每孔加入100 μL 檢測抗體室溫孵育1 h；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100μL 酶標二抗，室溫避光孵育30 min；0.05%PBST洗3遍，加入底物顯色液（100 μL/孔），室溫避光孵育15 min；每孔加入50 μL 終止緩沖液終止顯色后測OD450值。

1.5.4 RT-PCR檢測TNF-α和IL-1β轉錄水平的變化 繼續(xù)培養(yǎng)巨噬細胞72 h后，收集細胞，PBS洗2遍，加入800 μL RNAiso plus將細胞懸起，室溫放置5 min；4℃、10 800×g離心5 min后，將上層液體轉移到新的離心管中；加入200 μL 氯仿大力渦旋2 min左右使其成乳狀，室溫放置5 min。4℃、10 800×g離心15 min，將上層液體轉移到新的離心管中，加入500 μL 異丙醇混勻后置-80℃冰箱3 h；4℃、10 800×g離心10 min，棄上清后加入700 μL 75%酒精沖洗RNA；4℃、7500×g離心5 min，棄干凈上清，置空氣中干燥；用20 μL 滅菌蒸餾水溶解并測濃度。利用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。按照GoTaq?qPCR Master Mix Kit（Promega，China）說明書使用ABI 7900HT Real-Time PCR System進行如下反應：95℃預變性2 min；95℃預變性15 s和60℃退火1 min，40個循環(huán)。添加擴增產物的溶解曲線來確定反應的特異性。利用2-△△CT法計算目的基因mRNA的相對表達。

1.5.5 流式細胞術檢測巨噬細胞表面趨化因子受體CCR7的表達 繼續(xù)培養(yǎng)巨噬細胞72 h后，收集細胞。4℃、10 800×g離心5 min，沉淀用200 μL RPMI1640懸起，加入2 μL Rat Anti-Mouse CD16/ CD32 抗體，4℃封閉30 min消除抗體非特異性結合；加入PE標記的Rat Anti-Mouse CCR7單抗，4℃避光孵育30 min；4℃、10 800×g離心5 min，用預冷的PBS洗2遍，加入400 μL PBS懸起轉至流式管中，上流式儀檢測。

1.5.6 Griess法檢測SjCRT刺激巨噬細胞后NO的分泌情況 收集上述培養(yǎng)細胞的上清。按照說明書要求取50 μL標準品和樣品加入96孔板中，每孔加入50 μL Griess R1室溫避光放置5 min；每孔加入50 μL的Griess R2室溫避光放置5 min；540 nm測定吸光度。制備標準曲線并計算NO的濃度。

1.6 數(shù)據(jù)處理 所有的數(shù)據(jù)利用t檢驗進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異具有顯著統(tǒng)計學意義，借助GraphPad Prism 5等軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析和繪圖。

2 結果

2.1 SjCRT誘導巨噬細胞高表達前炎性細胞因子TNF-α 以ELISA檢測巨噬細胞分泌至上清中的TNF-α含量，由圖1可以看出，LPS刺激組和SjCRT刺激組中TNF-α的含量顯著高于對照組且差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。由此可知，SjCRT的刺激能夠促進巨噬細胞分泌前炎性因子TNF-α。

圖1 SjCRT刺激巨噬細胞產生細胞因子TNF-αFig.1 Cytokine TNF-α production of macrophagocyte stimulated by recombinant SjCRT

2.2 SjCRT促進巨噬細胞上調表達COX-2、cPLA2、TNF-α和IL-1β mRNA 經過SjCRT和LPS處理后的巨噬細胞COX-2、cPLA2、TNF-α和IL-1β的mRNA均上調，但上調的幅度有所不同。與對照組相比，SjCRT刺激組的COX-2 mRNA表達量是對照組的6.25倍，cPLA mRNA表達量增加了20.61倍，TNF-α mRNA表達量增加了6.87倍、IL-1β mRNA表達量上調了233.51倍（圖2）。

圖2 巨噬細胞表達COX-2、cPLA2、TNF-α和IL-1β的RT-PCR分析Fig.2 mRNA expression of the COX-2, cPLA2, TNF-α and IL-1β by RT-PCR

2.3 SjCRT促進趨化因子受體CCR7在巨噬細胞上表達 由圖3的流式結果可知，未經處理的巨噬細胞能表達一定水平的CCR7，但SjCRT和LPS的刺激能使巨噬細胞表面趨化因子受體CCR7的表達水平極顯著地增加。與對照組相比，SjCRT刺激組能促進巨噬細胞表面高表達趨化因子受體CCR7且差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。SjCRT刺激組與LPS刺激組相比，巨噬細胞表面CCR7的表達差異無顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05)。

2.4 SjCRT誘導巨噬細胞分泌NO 以Griess檢測巨噬細胞分泌到上清中的NO含量，由圖4可以看出，LPS和SjCRT的刺激能夠促使巨噬細胞分泌NO，且SjCRT刺激組的含量與對照組差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖3 流式細胞儀分析CCR7在巨噬細胞表面的表達Fig.3 FACS analysis of CCR7 expression on Macrophagocyte

圖4 SjCRT刺激巨噬細胞產生NOFig.4 NO production of Macrophagocyte stimulated by recombinant SjCRT

3 討論

近年來的研究顯示，輻照可引起免疫原性細胞死亡（immunogenic cell death，ICD）[9]。ICD的顯著特征是通過釋放或表面表達所謂的危險信號分子如HSP70、HMGB1和CRT等分子來增強免疫應答。本實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)經輻照的日本血吸蟲尾蚴，體外轉化的早期童蟲的細胞呈現(xiàn)明顯的壞死表型，且SjCRT和SjHSP70能夠表達在RA尾蚴轉化的童蟲細胞表面[10]，提示SjCRT和SjHSP70很可能在RA日本血吸蟲疫苗誘導的保護性免疫中發(fā)揮重要作用。研究揭示，RA血吸蟲免疫小鼠后在宿主肺部和引流淋巴結誘導了偏向于Th1的保護性應答，其中活化的免疫細胞如樹突細胞、巨噬細胞和T細胞等分泌的IFN-γ和TNF-α起了關鍵作用。但是，SjCRT是否也能夠活化巨噬細胞從而有利于宿主產生Th1的保護性應答環(huán)境，尚有待研究驗證。本研究通過測定經SjCRT刺激的小鼠巨噬細胞的趨化因子受體和細胞因子的表達情況，初步證明SjCRT可誘導小鼠巨噬細胞產生較高水平的TNF-α等致炎性細胞因子及趨化因子受體CCR7。

研究表明活化的巨噬細胞能合成和分泌大量細胞因子。因此，通過測定巨噬細胞分泌表達相關細胞因子的情況可以推斷其功能活性。本研究分別用ELISA法和RT-PCR法在蛋白水平和轉錄水平測定了受刺激的巨噬細胞TNF-α的含量，發(fā)現(xiàn)SjCRT可刺激巨噬細胞高表達前炎性細胞因子TNF-α。另外，我們也檢測到IL-1β mRNA在受刺激的巨噬細胞上呈現(xiàn)高表達。相關的研究顯示TNF-α和IL-1β是重要的誘導炎癥反應的細胞因子[11]，在炎癥發(fā)生早期，作為重要的早期炎癥因子，參與了固有免疫和適應性免疫反應。TNF-α具有刺激單核/巨噬細胞等合成、分泌細胞因子（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等），導致炎性細胞浸潤和增強吞噬細胞的殺傷作用。IL-1β是巨噬細胞激活 T 細胞的重要介質，有調節(jié)免疫應答的作用。SjCRT能夠誘導巨噬細胞高表達TNF-α和IL-1β mRNA，分泌早期炎癥因子TNF-α，提示巨噬細胞被活化。至于被SjCRT活化的巨噬細胞是否在宿主體內通過TNF-α和IL-1β誘導了早期炎癥反應并參與了激活T細胞等免疫反應，尚有待我們進一步實驗證實。

巨噬細胞炎癥反應功能的活化還可以通過測定與前列腺素類炎癥介質合成相關的誘導酶COX-2和胞漿性磷脂酶A2（cPLA2）表達情況來反映。通常炎癥的產生機制是機體在受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等刺激后產生炎癥性細胞因子，刺激和活化PLA2，引發(fā)磷脂的水解并產生花生四烯酸，在COX的作用下進一步轉變?yōu)榍傲邢偎仡愌装Y介質，進而機體發(fā)生炎癥癥狀[12]。COX是前列腺素合成的限速酶，有COX-1和COX-2兩種結構。COX-1是組成酶，在大部分組織中穩(wěn)定表達，參與體內的正常代謝；COX-2是誘導酶，在正常組織中不表達，只有在被細胞因子、生長因子等刺激后才大量表達，從而導致前列腺素含量的增加，引起炎癥、疼痛等癥狀[13]。根據(jù)生物活性的不同，可將PLA2分為3類：分泌性磷脂酶A2（sPLA2）、胞漿性磷脂酶A2（cPLA2）和Ca2+非依賴性磷脂酶A2 （iPLA2），但只有cPLA2對花生四烯酸的產生有調控作用。本研究發(fā)現(xiàn)受SjCRT刺激的巨噬細胞具有上調cPLA2和COX-2基因表達的趨勢，提示巨噬細胞具有較強的炎癥反應功能。

活化的巨噬細胞不僅分泌細胞因子，也能合成NO，通過測定巨噬細胞NO的含量變化可以反映其功能活化的狀態(tài)。另外，有研究顯示由巨噬細胞產生的NO在殺滅肺期血吸蟲童蟲時起重要作用[14,15]。本研究結果顯示受SjCRT刺激的巨噬細胞分泌NO的能力顯著增強，提示巨噬細胞的炎癥反應功能被活化。至于RA日本血吸蟲來源的SjCRT在體內是否也能通過巨噬細胞產生的NO來消除肺部的血吸蟲童蟲，仍有待進一步的鑒定。

募集免疫細胞至淋巴結器官對于誘導宿主保護性免疫反應及免疫耐受的調節(jié)等至關重要，這一過程是表達在免疫細胞表面的CCR7受體以及表達于淋巴結細胞上的趨化因子配體CCL21 等介導的[16]。有關的研究表明在致炎性的M1巨噬細胞和成熟的樹突細胞表面CCR7呈現(xiàn)高表達，有利于這些細胞被募集到免疫效應器官如肺部和引流淋巴結，進而產生細胞毒效應或活化其他免疫細胞。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SjCRT刺激后巨噬細胞上調表達CCR7，提示SjCRT刺激后的巨噬細胞可能具有致炎性的M1巨噬細胞的功能。

本研究結果表明SjCRT具有促進巨噬細胞產生致炎癥反應的功能，為進一步闡明SjCRT在RA血吸蟲疫苗誘導的保護性免疫中所發(fā)揮的功能及其機制提供了有價值的資料。

[1] Wang L D, Chen H G, Guo J G.A strategy to control transmission of Schistosoma japonicum in China [J].N Engl J Med, 2009, 360(2): 121-128.

[2] McManus D P, Loukas A.Current status of vaccines for schistosomiasis[J].Clin Microbiol Rev, 2008, 21(1): 225-242.

[3] 李瑩, 李運燕, 徐瑞敏, 等.日本血吸蟲鈣網織蛋白在Sf9昆蟲細胞中的表達及其活化樹突細胞的初步分析[J].中國動物傳染病學報, 2012, 20(4): 45-51.

[4] Bickle Q D.Radiation-attenuated schistosome vaccination--a brief historical perspective[J].Parasitology, 2009, 136(12): 1621-3162.

[5] Perona-Wright G, Jenkins S J, Mac Donald A S.Dendritic cell activation and function in response to Schistosoma mansoni[J].Int J Parasitol, 2006, 36(6): 711-721.

[6] EI-Gengehi N, EIRidi R, Tawab N A, et al.A Schistosoma mansoni 62 kDa band is identified as an irradiated vaccine T-cell antigen and characterized as calreticulin[J].J Parasitology, 2000, 86(5): 993-1000.

[7] 陳雷, 楊健美, 陳虹, 等.日本血吸蟲童蟲期體被蛋白Th細胞表位預測及初步鑒定[J].中國血吸蟲病預防雜志, 2009, 2(16): 87-92.

[8] Borthwick L A, Barron L, Hart K M, et al.Macrophages are critical to the maintenance of IL-13-dependent lung inflammation and fibrosis[J].Mucosal Immunol, 2015, 10(34): 1038-1053.

[9] Kono K, Mimura K, Kiessling R.Immunogenic tumor cell death induced by chemoradiotherapy: molecular mechanisms and a clinical translation[J].Cell Death Dis, 2013, 4(25): 669-688.

[10] Duan M M, Xu R M, Yuan C X, et al.SjHSP70, a recombinant Schistosoma japonicum heat shock protein 70, is immunostimulatory and induces protective immunity against cercarial challenge in mice[J].Parasitol Res, 2015, 114(9): 3415-3429.

[11] Tracey K.The inflammatory reflex[J].Nat Rev, 2002, 420(6917): 853-859.

[12] Willimann K.The chemokine SLC is expressed in T cell areas of lymphnodes and mucosal lymphoid tissues and attracts activated T cells via CCR7[J].Eur J Immunology, 1998, 67(28): 2025-2034.

[13] Worbs T, Forster R.A key role for CCR7 in establing central and peripheral tolerance[J].Trends Immunol, 2007, 28(6): 274-280.

[14] Oswald I P, Eltoum I, Wynn T A, et al.Endothelial cells are activated by cytokine treatment to kill an intravascularparasite, Schistosoma mansoni, through the production of nitric oxide[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 87(91): 999-1003.

[15] Wynn T A, Oswald I P, Eltoum I A, et al.Elevated expression of Th1 cytokines and nitric oxide synthase in the lungs of vaccinated mice after challenge infection with Schistosoma mansoni[J].J Immunol, 1994, 6(153): 5200-5209.

[16] F?rster R, Davalos-Misslitz A C, Rot A.CCR7 and its ligands: balancing immunity and tolerance[J].Nat Rev Immunol, 2008, 8(5): 362-371.

PRELIMINARY STUDY ON EFFECT OF SCHISTOSOMA JAPONICUM CALRETICULIN PROTEIN ON ACTIVATION OF MACROPHAGOCYTES

MA Li-zhen1, LI Dan-dan1,2, YUAN Chun-Xiu1, AI Min1, SHI Xiao-na1,2, TA Na1, FENG Xin-gang1
(1.Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

The objective of the present study was to investigate into the functions that Schistosoma japonicum calreticulin protein (SjCRT) activated mouse macrophagocytes.Insect cells Sf9 were used to express SjCRT.Macrophagocytes were stimulated with SjCRT for 72 h.The expression levels of macrophagocyte surface chemokine receptor CCR7 were assayed with fl ow cytometry.The expression levels of COX-2, cPLA2, TNF-α and IL-1β mRNAs were assayed in RT-PCR.The ELISA was used to assay the concentration of TNF-α and Griess to assay the concentration of NO in the surpernatant samples.The fl ow cytometry results show that SjCRT signifi cantly promoted up-regulation of the CCR7 expression (P＜0.05) in macrophagocytes.RT-PCR results indicated that SjCRT upregulated mRNA levels of COX-2, cPLA2, TNF-α and IL-1β.According to the results of ELISA and Griess, SjCRT signifi cantly stimulated macrophagocytes to secret NO.In brief, SjCRT activated mouse macrophagocytes that might be involved in the response to schistosomiasis vaccination.

Schistosoma japonicum; calreticulin protein; macrophagocyte; chemochines recepters; cytokine

S852.735

A

1674-6422（2016）02-0047-06

2016-12-18

中國農業(yè)科學院創(chuàng)新團隊基金

馬麗貞，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

馮新港，E-mail：xingangf62@yahoo.com.cn