丁 芳，羅 濤，王明玲，鄭利民

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036)

?

異氟烷對(duì)發(fā)育期大腦的神經(jīng)毒性及細(xì)胞周期的影響

丁 芳，羅 濤，王明玲，鄭利民

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036)

目的 探討異氟烷對(duì)發(fā)育期大腦的神經(jīng)元毒性和細(xì)胞周期的影響及其相關(guān)作用機(jī)制。方法 將32只7日齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組自主吸入空氣，異氟烷2 h組吸入1.3%異氟烷2 h，異氟烷4 h組吸入1.3%異氟烷4 h，異氟烷6 h組吸入1.3%異氟烷6 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后6 h，取對(duì)照組和異氟烷6 h組小鼠腦組織，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表達(dá)情況，F(xiàn)JB方法檢測(cè)神經(jīng)元變性情況。另取4組小鼠新鮮海馬組織提取蛋白，利用Western blot免疫印跡方法檢測(cè)其細(xì)胞周期蛋白CyclinB1的表達(dá)情況。結(jié)果 異氟烷6 h組海馬區(qū)Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及FJB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。異氟烷4 h組、6 h組CyclinB1表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論 異氟烷可通過(guò)影響細(xì)胞周期蛋白CyclinB1表達(dá)進(jìn)而引起發(fā)育期大腦海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡，并且具有一定的時(shí)間依賴(lài)性。

異氟烷；發(fā)育期；神經(jīng)毒性；CyclinB1；細(xì)胞周期

異氟烷是目前臨床常用的吸入麻醉藥之一，具有起效快、麻醉效能高及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在兒科麻醉中使用十分廣泛。但Jevtovic-Todorovic等[1]研究發(fā)現(xiàn)以異氟烷為代表的吸入麻醉藥可以引起發(fā)育期大腦神經(jīng)元的過(guò)度凋亡，減少神經(jīng)元密度，從而影響認(rèn)知功能。近年來(lái)的基礎(chǔ)研究證實(shí)，吸入麻醉藥也可以引起非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物發(fā)育期大腦的神經(jīng)退行性改變，甚至可以造成動(dòng)物持續(xù)至成年后認(rèn)知功能障礙[2-3]。另外在新生動(dòng)物如新生大鼠腦發(fā)育高峰期，使用麻醉藥如七氟烷、異氟烷等作用一定時(shí)間后可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)毒性，表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織病理學(xué)的改變，如神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多、抑制軸突發(fā)育等[4-5]。然而異氟烷引起神經(jīng)毒性及神經(jīng)元凋亡的具體機(jī)制尚未明確。本研究擬通過(guò)觀察發(fā)育期小鼠在吸入異氟烷后其大腦海馬區(qū)細(xì)胞周期蛋白CyclinB1的表達(dá)量及神經(jīng)元凋亡情況，探討其可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7日齡C57BL/6J品系健康SPF 級(jí)小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證號(hào)No:44007200018611)，雌雄不限，體質(zhì)量(4±1)g。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 異氟烷(百特公司)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3) 一抗(CST公司)；FJB(南京科佰生物科技有限公司)；Cyclin B1一抗(CST公司)，羊抗兔二抗(Proteintech公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)、正常羊血清、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、4%多聚甲醛等輔助試劑均購(gòu)自碧云天公司，低溫恒冷凍切片機(jī)。

1.3 分組及麻醉模型建立 將上述小鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組10只，異氟烷2 h組6只，異氟烷4 h組6只，異氟烷6 h組10只。對(duì)照組放置室溫環(huán)境，自主吸入空氣；異氟烷2 h、4 h、6 h組分別暴露于1.3%異氟烷中2 h、4 h、6 h。實(shí)驗(yàn)方法：使用德國(guó)德?tīng)柛衤樽頇C(jī)將密閉麻醉箱中充滿麻醉氣體，使用氣體監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)異氟烷的濃度為1.3%，等氣體濃度穩(wěn)定后放入實(shí)驗(yàn)小鼠，并保持溫度36～37 ℃。麻醉過(guò)程中， 觀察小鼠皮膚顏色和呼吸，直至麻醉結(jié)束。異氟烷2 h組麻醉過(guò)程中死亡1只。

1.4 免疫組化染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元Caspase-3表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后6 h，分別從對(duì)照組和異氟烷6 h組取4只小鼠，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛深度麻醉后，迅速開(kāi)胸，分離出心臟，用一次性頭皮靜脈針插管至左心室，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，經(jīng)左心室先灌入4 ℃預(yù)冷0.9% NaCl溶液進(jìn)行快速灌洗，待右心耳流出液慢慢變得透亮，肝臟及四肢顏色發(fā)白時(shí)改用4 ℃預(yù)冷4%多聚甲醛緩慢灌注約 30 min。斷頭后剪開(kāi)頭皮去除周?chē)M織，打開(kāi)小鼠顱骨，小心取出完整大腦置于4%多聚甲醛中固定24 h，再轉(zhuǎn)入20%蔗糖溶液中脫水至沉底。-80 ℃ OCT包埋劑速凍5 min后行冰凍切片，片厚25 μm。室溫下干燥大腦切片，0.1 mol/L PBS溶液洗3次，每次5 min。0.01 TritonX-100破膜30 min。PBS洗3次，每次5 min，羊血清封閉1 h后，Caspase-3一抗(1∶100)4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，每次5 min，羊抗鼠二抗(1∶200)室溫下孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色5 min，晾干、脫水、透明，中性樹(shù)脂封片后拍照，用Image pro軟件進(jìn)行分析。

1.5 Fluoro-Jade B(FJB)染色檢測(cè)神經(jīng)元變性情況 取制作好的小鼠大腦海馬區(qū)冰凍切片室溫放置10 min，PBS洗3次，每次5 min。然后將載玻片放入染色盤(pán)，無(wú)水乙醇漂洗5 min，70%無(wú)水乙醇漂洗2 min，ddH2O漂洗2 min，0.06%高錳酸鉀漂洗10 min(此時(shí)取出FJB染液)，ddH2O漂洗1 min，0.000 1% FJB漂洗10 min，反應(yīng)時(shí)應(yīng)盡量避免強(qiáng)光照射，ddH2O漂洗3次，每次1 min，吸水紙除去多余水分，用錫箔紙覆蓋載玻片，部分干燥8～10 min，二甲苯漂洗1 min，用DPX封片。熒光顯微鏡下采用藍(lán)色濾色片(激發(fā)光波長(zhǎng)為450～490 nm)觀察并采集圖像。每只小鼠大腦海馬區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)FJB 陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.6 Western blot法檢測(cè)CyclinB1表達(dá)量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后6 h，分別從4組中隨機(jī)選取6只小鼠，腹腔注射10 %水合氯醛深度麻醉后，斷頭剪開(kāi)頭皮去除周?chē)M織，打開(kāi)顱骨小心取出小鼠大腦。去除腦膜及血管后，取出大腦海馬區(qū)組織，于低溫條件下迅速提取蛋白質(zhì)。蛋白變性后，經(jīng)SDS-PAGE系統(tǒng)電泳分離，利用蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉(0.1% TBST稀釋)室溫下封閉1 h，TBST洗滌3次，5 min/次，兔抗鼠CyclinB1單克隆抗體(1∶500)4 ℃孵育過(guò)夜，第2天取出室溫放置30 min，TBST洗滌3次，5 min/次，孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫1 h，TBST洗滌3次，10 min/次，滴加ECL發(fā)光試劑，顯影、攝片。然后用Image J程序進(jìn)行條帶灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組和異氟烷6 h組Caspase-3表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束6 h后，對(duì)照組大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)僅有極少量Caspase-3 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，見(jiàn)圖1；異氟烷6 h組大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)有較多Caspase-3 陽(yáng)性細(xì)胞(鏡下呈棕褐色)，見(jiàn)圖2。對(duì)照組海馬區(qū)Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(5.500±1.323)個(gè)，異氟烷6 h組海馬區(qū)Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(27.250±3.198)個(gè)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 對(duì)照組海馬區(qū)及皮質(zhì)Caspase-3表達(dá)情況

圖2 異氟烷6 h組海馬區(qū)及皮質(zhì)Caspase-3表達(dá)情況

2.2 對(duì)照組和異氟烷6 h組FJB染色神經(jīng)元變性情況 在熒光顯微鏡下，F(xiàn)JB陽(yáng)性染色的神經(jīng)元呈亮黃綠色，染色背景淺， FJB陽(yáng)性染色的變性神經(jīng)元主要分布在小鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)，其中對(duì)照組有少量的陽(yáng)性細(xì)胞，異氟烷6 h組陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，見(jiàn)圖3及圖4。對(duì)照組海馬區(qū)FJB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(5.000±0.912 9)個(gè)，異氟烷6 h組海馬區(qū)FJB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(59.75±8.290)個(gè)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 對(duì)照組海馬區(qū)變性神經(jīng)元FJB染色表現(xiàn)

圖4 異氟烷6 h組海馬區(qū)變性神經(jīng)元FJB染色表現(xiàn)

2.3 各組CyclinB1表達(dá)情況 對(duì)照組CyclinB1表達(dá)量為100.00±17.54，異氟烷2 h組為105.3±15.78，異氟烷4 h組為148.2±23.80，異氟烷6 h組為164.9±15.35。異氟烷4 h組、6 h組CyclinB1表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，而異氟烷2 h組CyclinB1表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

ctrl為對(duì)照組， Iso2h為異氟烷2 h組, Iso4h為異氟烷4 h組, Iso6h為異氟烷6 h組

3 討 論

從全麻藥開(kāi)始應(yīng)用于臨床到現(xiàn)在已經(jīng)歷了將近160年，臨床上吸入麻醉藥因其安全、可靠、穩(wěn)定、易于控制等特性而廣泛應(yīng)用于產(chǎn)科及兒科。但研究發(fā)現(xiàn)吸入麻醉藥對(duì)發(fā)育期的哺乳動(dòng)物大腦有潛在危害，對(duì)于幼齡動(dòng)物而言，全麻藥的神經(jīng)毒性作用在大腦發(fā)育激增期時(shí)最敏感[6]。在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中，大腦發(fā)育激增期主要為動(dòng)物出生后14 d之內(nèi)，相當(dāng)于人類(lèi)孕晚期至出生后兩三年[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)以出生7 d的小鼠作為研究對(duì)象, 通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)小鼠大腦海馬區(qū)Caspases-3的表達(dá)情況，使用FJB染色進(jìn)行變性神經(jīng)元的計(jì)數(shù),從而觀察異氟烷是否可以引起小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡；并通過(guò)Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白CyclinB1表達(dá)情況，觀察異氟烷對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞周期的影響。

Caspase-3作為蛋白水解酶可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在正常情況下，胞質(zhì)中的Caspases-3并無(wú)活性，是以Caspase-3前體形式存在，當(dāng)收到凋亡信號(hào)后被激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。由于Caspase-3的激活是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟[8]，不論在外源性凋亡途徑，還是在內(nèi)源性凋亡途徑中，均需經(jīng)過(guò)Caspases-3的激活才能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷6 h組新生小鼠海馬區(qū)Caspases-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，說(shuō)明1.3%異氟烷暴露6 h可以激活神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Caspases-3，從而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。

在神經(jīng)科學(xué)的有關(guān)研究中，對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞變性壞死的檢測(cè)往往是一種必不可少的方法，在過(guò)去常使用鍍銀染色、TUNEL染色等方法檢測(cè)變性及凋亡的神經(jīng)元。FJB染色與TUNEL染色有著良好的相關(guān)性，但是相較于TUNEL染色方法，F(xiàn)JB染色適用性更佳[10]。因此，F(xiàn)JB可用于標(biāo)記變性的神經(jīng)元，這為檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞變性壞死提供了新的技術(shù)手段。本研究中FJB染色結(jié)果顯示異氟烷6 h組的新生小鼠海馬區(qū)變性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，說(shuō)明1.3%異氟烷暴露6 h對(duì)新生小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞具有明顯的損傷作用，證實(shí)了一定濃度的異氟烷暴露一定時(shí)間可以誘導(dǎo)發(fā)育期大腦海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞周期是指能持續(xù)分裂的真核細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束后再到下一次分裂結(jié)束的循環(huán)過(guò)程，包括分裂間期和分裂期2個(gè)階段。細(xì)胞周期的狀態(tài)直接反映了細(xì)胞所處的狀態(tài)，細(xì)胞周期的調(diào)控與DNA的損傷與修復(fù)關(guān)系十分密切，細(xì)胞周期蛋白主要包括周期蛋白(Cyclins)、周期蛋白依賴(lài)激酶(CDKs)、周期蛋白依賴(lài)激酶抑制劑(CKIs)。Cyclins與CDKs結(jié)合形成復(fù)合物，作用于特異的底物從而對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行精密的調(diào)節(jié)與控制。目前已知的Cyclin家族有8個(gè)成員，即CyclinA～CyclinH。在正常情況下，細(xì)胞周期蛋白(如Cyclins、CDKs 以及CKIs)均有各自出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)并且嚴(yán)格按照細(xì)胞周期的進(jìn)程程序性表達(dá)。CyclinB表達(dá)于G2初期，在G2/M限制點(diǎn)達(dá)高峰，在M期末被泛素化分解去除[11]。CyclinB1是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白，是CyclinB家族中的成員之一，屬于高度保守的蛋白家族。在神經(jīng)細(xì)胞中，活性CyclinB1/CDK1復(fù)合物是啟動(dòng)有絲分裂的關(guān)鍵, 它們積累于分裂間期, 活化于分裂前期[12]。有研究證實(shí)神經(jīng)元內(nèi)的細(xì)胞周期蛋白的激活增多,不能引導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行正常的有絲分裂，而是導(dǎo)致細(xì)胞周期的異常, 進(jìn)而引起神經(jīng)元凋亡[13]。目前已有大量研究表明，在阿爾茲海默病、腦缺血、癲癇等病理情況下，神經(jīng)元的細(xì)胞周期能夠重新被激活，但是其結(jié)局不是分裂增殖而是凋亡[14]。大部分的神經(jīng)元因?yàn)槟撤N因素的作用下，從靜止強(qiáng)迫進(jìn)入細(xì)胞周期的最終結(jié)局是凋亡。胚胎時(shí)期海馬區(qū)有絲分裂后神經(jīng)元中CDKIs的表達(dá)，可能表明了神經(jīng)元正處于細(xì)胞周期停滯或是細(xì)胞分裂被阻止的狀態(tài)[15]，不同于正常的增殖細(xì)胞的程序性表達(dá)，神經(jīng)元細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)或激活不是規(guī)律和必要的，它們的表達(dá)和激活的過(guò)程是紊亂的。如神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST)，在應(yīng)對(duì)損傷性刺激時(shí)，細(xì)胞周期蛋白的激活引起神經(jīng)元的細(xì)胞周期紊亂可以啟動(dòng)自身凋亡程序，但是對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，細(xì)胞周期蛋白的激活卻介導(dǎo)了其細(xì)胞分裂增殖。以上說(shuō)明細(xì)胞周期正常情況下能引起有絲分裂細(xì)胞增殖，但在神經(jīng)元的細(xì)胞中則會(huì)出現(xiàn)截然相反的結(jié)局。目前關(guān)于其具體機(jī)制并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在吸入1.3%異氟烷2 h時(shí)CyclinB1的表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在吸入1.3%異氟烷4 h、6 h時(shí)CyclinB1的表達(dá)量均明顯增高,提示異氟烷促進(jìn)CyclinB1的表達(dá)具有時(shí)間依賴(lài)性。與前面細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果相呼應(yīng)，提示在一定程度上發(fā)育期小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡與異氟烷引起細(xì)胞周期的異常有關(guān)。

綜上所述，異氟烷通過(guò)激活細(xì)胞周期蛋白造成細(xì)胞周期的異常運(yùn)行，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡越明顯。但是由于神經(jīng)元凋亡的復(fù)雜性，細(xì)胞周期異常引起凋亡具體機(jī)制并未十分明確。從預(yù)防的角度來(lái)看，及時(shí)干預(yù)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)可能會(huì)降低神經(jīng)元凋亡的風(fēng)險(xiǎn)，這也為后續(xù)防治異氟烷等吸入麻醉藥引起發(fā)育期大腦神經(jīng)元凋亡的研究提供了新思路。

[1] Jevtovic-Todorovic V,Hartman RE,Izumi Y,et al. Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits[J]. J Neurosci,2003,23(3):876-882

[2] Brambrink AM,Evers AS,Avidan MS,et al. Isoflurane-induced neuroapoptosis in the neonatal rhesus macaque brain[J]. Anesthesiology,2010,112(4):834-841

[3] Creeley CE,Dikranian KT,Dissen GA,et al. Isoflurane-induced apoptosis of neurons and oligodendrocytes in the fetal rhesus macaque brain[J]. Anesthesiology,2014,120(3):626-638

[4] Sanchez V,Feinstein SD,Lunardi N,et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain[J]. Anesthesiology,2011,115(5):992-1002

[5] Liang G,Ward C,Peng J,et al. Isoflurane causes greater neurodegeneration than an equivalent exposure of sevoflurane in the developing brain of neonatal mice[J]. Anesthesiology,2010,112(6):1325-1334

[6] 徐琳,唐淑新,趙為祿,等. 孕早期異氟醚麻醉對(duì)子代大鼠認(rèn)知功能的影響[J]. 中華麻醉學(xué)雜志,2012,32(1):45-47

[7] 夏淑軒,李玉娟,張靜,等. 異氟醚和七氟醚對(duì)新生大鼠海馬細(xì)胞增殖及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2表達(dá)的影響[J]. 中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志,2013,22(4):299-302

[8] D’Amelio M,Cavallucci V,Cecconi F. Neuronal caspase-3 signaling: not only cell death[J]. Cell Death Differ,2010,17(7):1104-1114

[9] 李穎,白波,黃宏興,等. 補(bǔ)腎健脾方干預(yù)去勢(shì)大鼠骨骼肌ca-spase-3和caspase-8的表達(dá)[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(46):8702-8705

[10] Schmued LC,Albertson C,Slikker WJ. Fluoro-Jade:a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration[J]. Brain Res,1997,751(1):37-46

[11] Hulleman E,Boonstra J. Regulation of G1 phase progression by growth factors and the extracellular matrix[J]. Cell Mol Life Sci,2001,58(1):80-93

[12] Jackman M,Lindon C,Nigg EA,et al. Active cyclin B1-Cdk1 first appears on centrosomes in prophase[J]. Nat Cell Biol,2003,5(2):143-148

[13] Di Giovanni S,Movsesyan V,Ahmed F,et al. Cell cycle inhibition provides neuroprotection and reduces glial proliferation and scar formation after traumatic brain injury[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(23):8333-8338

[14] Lee SS,Kim YM,Junn E,et al. Cell cycle aberrations by alpha-synuclein over-expression and cyclin B immunoreactivity in Lewy bodies[J]. Neurobiol Aging,2003,24(5):687-696

[15] Schmetsdorf S,Gartner U,Arendt T. Expression of cell cycle-related proteins in developing and adult mouse hippocampus[J]. Int J Dev Neurosci,2005,23(1):101-112

Effects of Isoflurane on neurotoxicity and cell cycle in developing brain

DING Fang, LUO Tao, WANG Mingling, ZHENG Limin

(Shenzhen Hospital of Peking University, Beijing 518036, China)

Objective It is to investigate the effects and mechanisms of isoflurane on neurotoxicity and cell cycle in developing brain. Methods 34 seven-day-old C57BL/6J mice were randomly divided into C, A1, A2, A3 four groups：The control group (group C) inhaled air independent, Exposure to 1.3% (volume fraction) of isoflurane 2 h (group A1)；Exposure to 1.3% (volume fraction) of isoflurane 4 h (groupA2); Exposure to 1.3% (volume fraction) of isoflurane 6 h (groupA3). After the end of anesthesia for 6 hours，five mice taken respectively from the control group and experimental group. The brain tissue after cardiac perfusion with 4% paraformaldehyde were gotten to detect the hippocampus of mouse cysteine aspartic proteinase 3 (Caspase-3) expression by immunohistochemistry. Detecting the degeneration of neurons in hippocampus by using the method of Fluoro-Jade B staining. 6 mice from each groups respectively were selected and killed to get rapid extraction of hippocampal protein. Using Western blot immunoblotting method to detect the cell cycle protein B1 (CyclinB1) expression in the hippocampus of mice. Results Compared with the control group, the number of Caspase-3 positive cells and the number of degenerated neurons of the hippocampus in hippocampus of group A3 mice increased obviously (P<0.05); Compared with the control group, the expression of Cyclin B1 in group A2 and group A3 increased obviously (P<0.05), while in group A1 there was no significant difference(P>0.05). Conclusion The study found that exposure to 1.3% isoflurane for a period can increase the expression of Cyclin B1 in hippocampal neurons, then caused the changes of neuronal cell cycle and lead to apoptosis.

Isoflurane; development; neurotoxicity; CyclinB1; cell cycle

丁芳，女，碩士，研究方向?yàn)槁樽韺W(xué)。

羅濤，E-mail:luotao_wh@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81271205)；深圳市衛(wèi)計(jì)委臨床技術(shù)研究及轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(201501025)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.31.003

R683.2

A

1008-8849(2016)31-3427-04

2016-04-10