伍園園，滕曉明

(同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院生殖中心，上海 210204)

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年輕腫瘤患者凍融卵巢皮質(zhì)自體移植安全性研究進(jìn)展

伍園園，滕曉明

(同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院生殖中心，上海 210204)

直接冷凍卵巢皮質(zhì)能保存大量原始卵泡，腫瘤緩解后凍融卵巢皮質(zhì)自體移植，可以恢復(fù)年輕女性患者的生殖功能和內(nèi)分泌功能，是目前解決癌癥患者生育能力最有希望的方法。但是，癌癥患者冷凍保存的卵巢組織中可能殘留惡性腫瘤細(xì)胞，移植后可能導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。該文綜述近年來凍融卵巢皮質(zhì)自體移植后安全性方面的研究進(jìn)展。

卵巢組織冷凍；卵巢組織移植；惡性腫瘤；安全性

隨著診斷與治療技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，年輕女性癌癥患者的生存率得到明顯提高。兒童及青少年惡性腫瘤患者抗癌治療后的生存率達(dá)到70%～95%，對(duì)一些化療高度敏感的的婦科惡性腫瘤，化療可以達(dá)到治愈的效果[1-2]。大劑量的化療及放療殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也直接通過凋亡作用破壞生殖細(xì)胞，帶來了卵巢早衰問題, 這使得許多生育年齡的腫瘤患者在重獲新生的同時(shí)，又陷入另一個(gè)痛苦的深淵，嚴(yán)重影響其身心健康及社會(huì)角色[3]。為這部分女性患者提供有效的生育力保護(hù)技術(shù)顯得非常有必要。因此，對(duì)于年輕患者，在積極治療惡性腫瘤的同時(shí)，如何保護(hù)卵巢功能、維持生育能力成為研究者迫切需要解決的問題。到目前為止，有數(shù)種方法為有可能出現(xiàn)卵巢早衰和生育力喪失的女性保存生殖功能，包括胚胎冷凍、卵子冷凍及卵巢組織冷凍保存等。唯一符合美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)規(guī)范建立的方法是胚胎冷凍，但是這種方法要求患者是青春期以后的，有伴侶或使用供精，還要能耐受一個(gè)周期的卵巢刺激，當(dāng)化療必須立即開始或腫瘤的類型不允許卵巢刺激的時(shí)候此方法不能使用。卵母細(xì)胞冷凍過程中，成熟人卵母細(xì)胞冷凍后容易損傷，而未成熟卵子冷凍后體外培養(yǎng)成熟率低，受精率也低。直接冷凍卵巢皮質(zhì)能保存大量原始卵泡，卵母細(xì)胞體積小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，代謝率低，無透明帶，細(xì)胞內(nèi)對(duì)低溫敏感的亞細(xì)胞器較少，不易受到冷凍傷害，并且不需要卵巢刺激及等待卵子成熟，不會(huì)延誤患者的放化療[4]。等腫瘤緩解穩(wěn)定后再行卵巢皮質(zhì)自體移植，可以恢復(fù)患者的生殖功能和內(nèi)分泌功能，并且不存在倫理問題，是目前解決癌癥患者生育能力最有希望的方法。

1996年Hovatta報(bào)道第一例人類卵巢組織成功凍存，2004年Donnez等首次報(bào)道1例IV期霍奇金淋巴瘤患者，在化療前將卵巢皮質(zhì)冷凍，6年后凍融卵巢組織原位移植，自然妊娠產(chǎn)下一名健康的女嬰，證實(shí)了人卵巢組織冷凍保存技術(shù)可以保存惡性腫瘤患者的生育功能。從已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)來看，全世界范圍已經(jīng)有約60名嬰兒通過凍融卵巢組織自體原位移植獲得活胎妊娠的分娩[5]。隨著該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用和認(rèn)可，將越來越多地在全世界范圍內(nèi)開展。在凍融卵巢組織冷凍保存后臨床應(yīng)用取得令人鼓舞的成績(jī)的同時(shí)，還有一些問題亟待解決。凍融卵巢組織自體移植是為了恢復(fù)腫瘤患者的生育力，但某些惡性腫瘤患者卵巢中可能存在微小殘余癌灶，使惡性腫瘤細(xì)胞植入并導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)，這是最值得關(guān)注的安全問題?，F(xiàn)就近年來年輕腫瘤患者凍融卵巢皮質(zhì)自體移植安全性方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1凍融卵巢皮質(zhì)移植后安全性研究現(xiàn)況

在要求卵巢組織冷凍保存的患者中，血液系統(tǒng)惡性腫瘤占了很大一部分?；羝娼鹆馨土鍪亲畛Ｒ姷模缓笫前籽『头腔羝娼鹆馨土?。對(duì)白血病的患者來說，惡性腫瘤細(xì)胞可能出現(xiàn)在血液中，所以卵巢組織中也有可能含有惡性腫瘤細(xì)胞[6]。Meirow第一個(gè)報(bào)道在病人的冷凍卵巢組織中檢測(cè)到慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞，通過RT-PCR方法檢測(cè)BCR-ABL融合基因陽性，于是放棄移植冷凍的卵巢組織。Dolmans等對(duì)該中心行卵巢移植的患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在6例慢性粒細(xì)胞白血病(CML)患者中，2例患者血中發(fā)現(xiàn)BCR-ABL白血病標(biāo)記物陽性，結(jié)果顯示這兩例患者凍融的卵巢組織中BCR-ABL融合基因也是陽性。在12例急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者中，2例由于沒有可用的分子標(biāo)記物未行PCR分析。在剩下的10例中，7例冷凍保存的卵巢組織中分子標(biāo)記物陽性，1例BCR-ABL陽性，1例為t(1;9)(q23;p23.3)，5例為Ig和/或TCRr重排基因。在這7例ALL標(biāo)記物陽性患者中，4例在卵巢皮質(zhì)冷凍前未進(jìn)行過化療，有3例接受了一個(gè)療程的化療。卵巢組織冷凍前的化療是否有助于清除卵巢組織中的惡性細(xì)胞？ALL患者由于治療時(shí)間的緊迫，患者通常在冷凍卵巢組織前已經(jīng)進(jìn)行了生殖毒性的化療。其研究數(shù)據(jù)顯示，10例患者中，4例是取卵巢組織前未進(jìn)行過任何化療的患者，這些患者的卵巢組織中用RCR方法檢測(cè)到白血病分子標(biāo)記物呈陽性。其余6例冷凍卵巢組織前已經(jīng)開始化療的患者中，3例的卵巢組織中白血病標(biāo)記仍然陽性，而且，這其中包括1例接受過6次完整化療的患者，所以，要徹底清除白血病細(xì)胞，一個(gè)療程的化療是不夠的。而Greve等[7]的研究則發(fā)現(xiàn)，在急性白血病的活動(dòng)期取的卵巢組織中確實(shí)存在有活性的惡性細(xì)胞，但是在那些保存卵巢組織前化療過的患者則不存在。Jahnukainen等[8]用RT-qPCR方法對(duì)那些由于白血病已經(jīng)去世的患者的冷凍卵巢組織進(jìn)行檢測(cè)，這些組織中有些是從急性期的時(shí)候取的，有些是在完全緩解的患者取的。10例完全緩解的患者中，有2例的卵巢皮質(zhì)中能檢測(cè)到微量的白血病細(xì)胞，而對(duì)于急性期患者，所有患者均用RT-qPCR方法檢測(cè)到惡性細(xì)胞。但是這些惡性細(xì)胞的量達(dá)到多少就可能會(huì)通過卵巢移植導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)尚不清楚。

霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤是常見的行卵巢皮質(zhì)冷凍保存的適應(yīng)證。Shaw報(bào)導(dǎo)將患淋巴瘤的AKR小鼠的卵巢組織移植到健康小鼠，導(dǎo)致健康小鼠患淋巴瘤，這個(gè)實(shí)驗(yàn)引起了科學(xué)家們對(duì)腫瘤細(xì)胞再植風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)注。多數(shù)研究認(rèn)為對(duì)霍奇金淋巴瘤患者，卵巢組織冷凍后移植是安全的。文獻(xiàn)報(bào)道的15例自體移植的霍奇金淋巴瘤病例中，沒有1例在移植后發(fā)生淋巴瘤復(fù)發(fā)，6例非霍奇金淋巴瘤患者卵巢組織自體移植病例中，也沒找到淋巴瘤復(fù)發(fā)的證據(jù)。Kim將13例霍奇金淋巴瘤和5例非霍奇金淋巴瘤的卵巢組織異種移植到SCID小鼠，也未發(fā)現(xiàn)小鼠有腫瘤復(fù)發(fā)的證據(jù)。

乳腺癌目前已成為女性惡性腫瘤的第一高發(fā)腫瘤，且乳腺癌的發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，發(fā)病人群中5%的患者小于40歲。在乳腺癌中，卵巢轉(zhuǎn)移的發(fā)生率在13.2%～37.8%之間，通常見于晚期乳腺癌患者。Sanchez-Serrano等[9]分析乳腺癌患者冷凍保存卵巢皮質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，不論是組織學(xué)還是免疫組織化學(xué)，均未發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞的再植。對(duì)于乳腺癌早期患者，凍融卵巢皮質(zhì)自體移植是安全的(除外部分乳腺癌患者系遺傳性BRCA基因突變所致，不適合行卵巢皮質(zhì)組織凍融移植)。對(duì)于晚期乳腺癌患者，不能排除卵巢轉(zhuǎn)移。Luyckx等[10]報(bào)道了13例進(jìn)展期乳腺癌，其中5例用定量PCR方法檢測(cè)到MBG2基因陽性，但卵巢組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色均未發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞，將卵巢組織異種移植到小鼠也未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的跡象。目前認(rèn)為乳腺癌患者凍融卵巢皮質(zhì)自體移植是安全的，但是還需要更進(jìn)一步的證據(jù)，如PCR評(píng)估和異種移植后的長(zhǎng)期追蹤，對(duì)于評(píng)價(jià)乳腺癌患者卵巢皮質(zhì)移植的安全性是非常有必要的。

據(jù)報(bào)道，宮頸鱗癌中0.7%～2.5%轉(zhuǎn)移到卵巢，宮頸腺癌中轉(zhuǎn)移到卵巢的比率約為0～6.8%。宮頸腺癌比宮頸鱗癌更傾向于波及到卵巢，因而理論上宮頸腺癌患者卵巢組織冷凍移植后腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較宮頸鱗癌要大一些。Schmidt等[11]和Donnez等[12]各報(bào)道1例宮頸癌患者卵巢組織冷凍保存后自體移植，這兩例均未發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)的表現(xiàn)。而Kim[13]報(bào)道了3例宮頸癌患者術(shù)后行卵巢組織冷凍后移植，其中1例在卵巢組織移植后發(fā)現(xiàn)盆腔轉(zhuǎn)移。

原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤，包括髓母細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤。發(fā)生在兒童的神經(jīng)母細(xì)胞瘤和白血病屬于容易向卵巢轉(zhuǎn)移的腫瘤。Abir等[14]分析了8例尤文氏肉瘤患者的卵巢標(biāo)本，采用組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、RT-PCR等方法進(jìn)行檢測(cè)，其中1例患者的標(biāo)本經(jīng)RT-PCR方法檢測(cè)到尤文氏肉瘤腫瘤細(xì)胞陽性。而Donnezt等[15]報(bào)道1例轉(zhuǎn)移的神經(jīng)外胚層腫瘤，進(jìn)行卵巢組織冷凍保存后移植，在移植前卵巢組織組織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

以上綜述了女性患病率較高的幾類腫瘤中卵巢組織冷凍保存后再移植過程惡性腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，Sonmezer和Oktay將腫瘤再植風(fēng)險(xiǎn)分為幾類：低風(fēng)險(xiǎn)、中等風(fēng)險(xiǎn)及高風(fēng)險(xiǎn)，見表1：

表1 各類型腫瘤中卵巢轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)

Table 1 Risk of ovarian metastasis according to cancer type

高風(fēng)險(xiǎn)中等風(fēng)險(xiǎn)低風(fēng)險(xiǎn)白血病乳腺癌(Ⅳ期)乳腺癌(Ⅰ～Ⅱ期)神經(jīng)母細(xì)胞瘤結(jié)腸癌宮頸鱗癌Burkitt淋巴瘤宮頸腺癌霍奇金淋巴瘤非霍奇金淋巴瘤骨源性癌尤文氏肉瘤橫紋肌肉瘤Wilms腫瘤

2卵巢組織冷凍前后的評(píng)估

對(duì)于癌癥患者來說，卵巢組織自體移植存在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛在風(fēng)險(xiǎn)。為了保證移植卵巢組織的安全性，在卵巢組織冷凍保存前后進(jìn)行惡性腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估至關(guān)重要。首先，腫瘤的病理類型對(duì)于卵巢移植時(shí)再種植的潛在危險(xiǎn)性起著重要的作用，對(duì)一些來源于易侵犯卵巢的腫瘤患者的卵巢組織則不宜進(jìn)行自體移植。卵巢組織移植前，建議對(duì)來源于腫瘤患者的卵巢組織進(jìn)行一系列檢測(cè)，以排除微小殘余病灶的可能。目前，聚合酶鏈反應(yīng)、熒光原位雜交等分子遺傳學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)方法的臨床應(yīng)用將有效降低卵巢移植時(shí)將腫瘤細(xì)胞帶入受者體內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)[16]。在慢性粒細(xì)胞白血病中使用 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)BCR-ABL融合基因來確定卵巢組織中是否有白血病細(xì)胞，人abl基因位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂，bcr基因位于22號(hào)染色體長(zhǎng)臂，90%以上的CML患者的血細(xì)胞中出現(xiàn)Ph1染色體，t(9；22)(q34；q11)，9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上C-abl原癌基因易位至22號(hào)染色體長(zhǎng)臂的斷裂點(diǎn)集中區(qū)(bcr)，形成bcr/abl融合基因。由于這個(gè)特點(diǎn)，對(duì)CML病常用分子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)卵巢皮質(zhì)中是否有白血病細(xì)胞。急性淋巴細(xì)胞白血病ALL的遺傳學(xué)標(biāo)志不是經(jīng)常能被檢測(cè)到，對(duì)于沒有染色體異常的患者，常常通過檢測(cè)克隆免疫球蛋白和T細(xì)胞受體基因來確定卵巢組織中是否有白血病細(xì)胞。由此看出，聯(lián)合使用術(shù)前影像學(xué)、術(shù)后新鮮組織病理分析和凍融后惡性細(xì)胞敏感標(biāo)記物檢測(cè)等各種檢查手段，可以有效地發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞殘留，減少腫瘤種植的機(jī)率，增加移植的安全性。但不論是術(shù)后活組織病理分析，還是特異性的標(biāo)志物標(biāo)記，都只能對(duì)隨機(jī)選取的組織的一部分進(jìn)行研究，無法完全排除整個(gè)組織塊中沒有腫瘤細(xì)胞殘留的可能。

3人卵巢皮質(zhì)移植今后的方向

結(jié)合腫瘤患者的身體狀況和移植過程中腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性，卵巢移植技術(shù)并不適用于所有腫瘤患者。因此，發(fā)展一些卵巢移植技術(shù)的補(bǔ)充技術(shù)，如卵巢中卵泡的分離、體外卵泡的培養(yǎng)或卵母細(xì)胞冷凍保存等技術(shù)，是十分必要的。

3.1卵泡培養(yǎng)和卵泡的體外成熟

為了避免惡性細(xì)胞的傳播，體外培養(yǎng)卵巢組織及卵泡成熟是一個(gè)很有吸引力的方法。原始卵泡的啟動(dòng)、早期生長(zhǎng)、竇前卵泡發(fā)育至竇卵泡，卵母細(xì)胞的最后成熟，都是卵泡發(fā)育過程的重要階段?？茖W(xué)家們一直嘗試建立一套適合原始卵泡正常生長(zhǎng)至成熟的竇卵泡體外培養(yǎng)系統(tǒng)。到目前為止，只有小鼠始基卵泡完全在體外培養(yǎng)出生后代的報(bào)道。在人類原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)到次級(jí)卵泡生長(zhǎng)，整個(gè)過程超過100天，在卵泡發(fā)育的每個(gè)階段都需要不同的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)。這個(gè)體外培養(yǎng)體系需要滿足卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)不同時(shí)期的生長(zhǎng)需要，研究者們正在考慮如何更好地優(yōu)化卵泡培養(yǎng)的條件，最終得到具備完全發(fā)育潛能的卵母細(xì)胞[17]。

3.2人工卵巢

卵巢組織結(jié)構(gòu)中，卵泡周圍圍繞著基底膜，將卵泡與間質(zhì)分離開來，間質(zhì)成分包括毛細(xì)血管、白細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞成分，所以將卵泡與間質(zhì)分離開來，移植分離的卵泡可以防止腫瘤細(xì)胞通過卵巢移植導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。1997年Oktay第一次用溫和的膠原酶聯(lián)合機(jī)械分離得到較多的分離的原始卵泡。將經(jīng)膠原酶消化分離后得到的卵泡用不同的基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，均在24小時(shí)左右發(fā)生變性。Dolmans等將分離的卵泡異種移植后，對(duì)卵泡進(jìn)行了觀察，最長(zhǎng)觀察到異種移植后5個(gè)月，原始卵泡發(fā)育到竇卵泡階段，異種移植后5個(gè)月仍然保存發(fā)育潛能，但是移植后存活率低。此后，研究者又嘗試將分離的卵泡與人工的載體結(jié)合，以再造有利于卵泡生存的環(huán)境，再血管化后載體可以降解[18-19]。該技術(shù)仍在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中。

基于臨床患者的迫切需求，以及近年來卵巢移植及其安全性方面的研究，相信該技術(shù)必將獲得重大發(fā)展，更好地為臨床服務(wù)，為癌癥患者保存生育能力提供光明的前景。

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[專業(yè)責(zé)任編輯： 楊筱鳳]

Safety studying of frozen-thawed ovarian cortex antotransplantaion on young cancer patients

WU Yuan-yuan, TENG Xiao-ming

(Shanghai First Maternity and Infant Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 210204, China)

Reimplantation of frozen-thawed ovarian tissue after tumor remission has emerged as a most potential option to restore both the reproductive function and endocrine function of young women. But the ovary tissue may harbor malignant cells in some type of malignant diseases and the possibility of reintroducing tumor cells into cancer patients by autotransplantation of ovarian tissue cannot be excluded. This review emphasized the progress of the safety after frozen-thawed ovarian cortex autotransplantation in recent years

ovarian tissue cryopreservation; ovarian tissue transplantation; malignant tumor; safety

2016-06-10

伍園園(1973-)，女，副主任醫(yī)師，博士，主要從事女性內(nèi)分泌疾病，不孕不育的診斷、治療及輔助生殖技術(shù)等方面的工作及研究。

滕曉明，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.041

R318.53;R711

A

1673-5293(2016)10-1290-03