羅 寧，楊娟娟，郭 靜，陳 麗，程忠平

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院婦產(chǎn)科 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院婦科微創(chuàng)醫(yī)學(xué)研究所，上海 200090；2.蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院，江蘇 蘇州 215200)

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沉默肌瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞FAP基因可抑制雌激素的細(xì)胞增殖效應(yīng)

羅 寧1，楊娟娟2，郭 靜1，陳 麗1，程忠平1

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院婦產(chǎn)科 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院婦科微創(chuàng)醫(yī)學(xué)研究所，上海 200090；2.蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院，江蘇 蘇州 215200)

目的 觀察成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)表達(dá)在雌激素對(duì)子宮肌瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化和促增殖中的作用。方法 采用免疫磁珠法分離成纖維細(xì)胞并檢測(cè)雌激素受體(ER-α/ER-β)表達(dá)情況。以雌激素分別刺激子宮正常平滑肌基質(zhì)成纖維細(xì)胞及子宮肌瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞(TAF)，并檢測(cè)FAP、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、生長(zhǎng)因子的分泌情況和細(xì)胞增殖活力的改變，以及檢測(cè)細(xì)胞增殖通路相關(guān)信號(hào)分子的改變；使用RNAi技術(shù)沉默TAF的FAP基因，觀察雌激素刺激對(duì)TAF上述指標(biāo)表達(dá)水平的影響。結(jié)果 TAF的FAP、ER-α/ER-β的表達(dá)水平高于成纖維細(xì)胞(n=10，P<0.05)。經(jīng)雌激素刺激，成纖維細(xì)胞和TAF的 FAP、ECM(Fibronectin、Laminin、Collgen I)和生長(zhǎng)因子(TGF-β、IGF-1)表達(dá)水平，細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞增殖通路相關(guān)信號(hào)分子(AKT、ERK、c-Fos、MEK)的磷酸化水平均上調(diào)；RNAi沉默F(xiàn)AP基因可抑制雌激素介導(dǎo)的上述生物學(xué)作用。結(jié)論 FAP基因表達(dá)是E2活化及促進(jìn)子宮肌瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖過(guò)程中的關(guān)鍵，其可能在子宮肌瘤發(fā)病機(jī)制中具有重要作用并且可能成為治療子宮肌瘤的新靶點(diǎn)。

子宮肌瘤；成纖維細(xì)胞；腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞；雌激素；成纖維細(xì)胞活化蛋白

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的良性腫瘤，常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)為子宮異常出血，腹部腫塊及壓迫癥狀，不孕與流產(chǎn)等，嚴(yán)重影響女性健康[1]。子宮肌瘤生長(zhǎng)表現(xiàn)為激素依賴(lài)性，雌激素在子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中有重要作用[2-3]。

有研究表明，腫瘤微環(huán)境為腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展提供了一個(gè)良好的環(huán)境，成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中最主要的基質(zhì)細(xì)胞[4]。不同于正常組織中的成纖維細(xì)胞，腫瘤組織中的成纖維細(xì)胞約有80%處于持續(xù)活化狀態(tài)，也稱(chēng)為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(tumor association fibroblasts，TAF)[5]?；罨某衫w維細(xì)胞特征性改變表現(xiàn)為表達(dá)成纖維細(xì)胞活化蛋白(fibroblasts activation protein，F(xiàn)AP)。FAP不僅是成纖維細(xì)胞活化后特異表達(dá)的標(biāo)記物，還參與了腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)控[6]。因此，F(xiàn)AP有望成為抗腫瘤藥物研究的靶點(diǎn)。

目前，成纖維細(xì)胞與子宮肌瘤發(fā)生的關(guān)系存在諸多未知，雌激素促子宮肌瘤發(fā)生的作用機(jī)制也有待進(jìn)一步探究。本研究分離子宮肌瘤組織中的成纖維細(xì)胞，觀察其活化水平；采用雌激素刺激，比較刺激前后成纖維細(xì)胞活化、增殖活力的改變及細(xì)胞增殖通路信號(hào)分子的表達(dá)情況，同時(shí)采用RNAi干擾技術(shù)抑制FAP基因表達(dá)，觀察雌激素對(duì)FAP基因抑制后TAF的活化效應(yīng)。通過(guò)多種生物學(xué)技術(shù)方法，探索雌激素對(duì)子宮基質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化作用及FAP表達(dá)在雌激素對(duì)肌瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化和促增殖中的作用。

1材料與方法

1.1材料

選擇因子宮肌瘤需行子宮切除術(shù)患者10例，排除子宮肉瘤、多囊卵巢綜合征等婦科腫瘤及內(nèi)分泌疾病，術(shù)前6個(gè)月無(wú)使用激素類(lèi)藥物治療史，術(shù)后病理證實(shí)為子宮肌瘤。取患者子宮肌瘤和子宮平滑肌組織各5g。

1.2原代細(xì)胞分離及培養(yǎng)

取子宮平滑肌和子宮肌瘤組織(各約2g)分別置于加雙抗(青霉素：1 000IU/mL，鏈霉素：1 000μg/mL)的漢克斯平衡鹽溶液(Hanks balanced salt solution，HBSS)里轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室；取適量平滑肌和肌瘤組織(各約2g)分別進(jìn)行下述處理：用眼科剪剪碎后加0.4%混合膠原酶8～10mL(含20μg/mL DNaseⅠ)、0.05%胰酶2mL，37℃搖床消化2～3h，過(guò)單細(xì)胞濾網(wǎng)(30μm)，去除死細(xì)胞(Dead Cell Removal Kit，#130-090-101)，細(xì)胞計(jì)數(shù)；離心(300g)10min，棄上清液，重懸每107細(xì)胞于80μL緩沖液；每107細(xì)胞加20μL結(jié)合抗成纖維細(xì)胞抗體的磁珠(#130-050-601)，室溫孵育30min；每107細(xì)胞加1～2mL緩沖液清洗，離心(300g)10min，棄上清液；重懸最多108細(xì)胞于500μL緩沖液，置于分選器磁場(chǎng)中的分選柱，收集未標(biāo)記的細(xì)胞，將柱子轉(zhuǎn)移至收集試管，洗出標(biāo)記的成纖維細(xì)胞。

1.3Western blot檢測(cè)

細(xì)胞收集后采用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解，4℃下離心(12 000g)15min，抽提蛋白，采用蛋白定量分析試劑盒(BCA)定量，儲(chǔ)存于-80℃。蛋白經(jīng)沸水煮5min，每孔加20μg蛋白，進(jìn)行凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜，加入含3%牛血清白蛋白(BSA)的等滲鹽溶液(TBST)溶液室溫封閉60min，加入相應(yīng)一抗室溫孵育2h，洗滌后加入二抗室溫封閉1h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)法進(jìn)行發(fā)光，采用ImageQuant LAS4000測(cè)定條帶測(cè)灰度值。

1.4細(xì)胞免疫熒光

細(xì)胞采用4%多聚福爾馬林室溫固定15min，磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次，加入封閉液(PBS，3% BSA，0.1% Triton-X 100)室溫封閉30min。加入一抗抗FAP抗體(1:200，ab28244，Abcam)/ ER-α抗體(1:100，ab9269，Abcam)，置濕盒內(nèi)，4℃過(guò)夜，細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后加入二抗(Alexa Fluor標(biāo)記山羊抗兔抗體及FITC標(biāo)記山羊抗鼠抗體)室溫孵育1h，PBS洗滌10min，熒光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.5實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)

采用SYBR Green I 熒光定量PCR檢測(cè)ER-α和ER-β的基因表達(dá)水平。采用Trizol從冰凍的組織中提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，ER-α上游引物：5′-TCCT￣GCCAGCTCATTTCCTTC-3′，反向引物：5′-TCACCTGGGTC￣ATTGGCTAAC-3′，ER-β上游引物：5′-GACA￣TGCTC￣CTGGCAACTAC-3′，反向引物：5′-ATGCCGCTCTTGGCAATC-3′，GAPDH 作為參照基因，上游引物:5′-GCACCGTC￣AAGGCTGAGAAC-3′，反向引物：5′-GCCTTCT￣CCATGGTGG￣TGAA-3′。將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：50℃下變性2min，95℃下變性5min，95℃下變性15s和60℃下變性35s，循環(huán)40次。

1.6 MTT比色法檢測(cè)

成纖維細(xì)胞，正常平滑肌細(xì)胞(SMC)及肌瘤細(xì)胞(UFC)按5 000個(gè)/孔接種于96孔板，分別在24h、48h及72h時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行MTT檢測(cè)。每組每孔加入20μL MTT溶液(0.5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔再加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值，計(jì)算增長(zhǎng)速率。

1.7 RNA干擾

成熟的反義序列是5′-TTCTAGGATATTGTTCATCGC-3′，用慢病毒(載體或包含F(xiàn)AP shRNA的載體)感染成纖維細(xì)胞48h后，再分別培養(yǎng)48h、72h，檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力、ECM(Fibronectin、Laminin、Collgen Ⅰ)、生長(zhǎng)因子(TGF-β、IGF-1)及細(xì)胞增殖通路相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件，組間分析采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1子宮肌瘤組織存在活化的成纖維細(xì)胞

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示CD90在TAF及成纖維細(xì)胞中表達(dá)較高，而在子宮肌瘤及周?chē)交〗M織中分離的平滑肌細(xì)胞中表達(dá)低，表明免疫磁珠法可分離得到純度高的成纖維細(xì)胞，可用于后續(xù)的研究，見(jiàn)圖1A。細(xì)胞免疫熒光及Western blot檢測(cè)結(jié)果均顯示，F(xiàn)AP在TAF中的表達(dá)強(qiáng)于成纖維細(xì)胞，表明TAF處于活化狀態(tài)(n=10，P<0.05)，見(jiàn)圖1B、圖1C。

注：A.采用結(jié)合有抗CD90的免疫磁珠分選成纖維細(xì)胞(10例)，并采用抗CD90抗體檢驗(yàn)分離純度；B.western blot法檢測(cè)子宮平滑肌和肌瘤組織來(lái)源成纖維細(xì)胞FAP的表達(dá)水平；C.細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)子宮平滑肌和肌瘤組織來(lái)源成纖維細(xì)胞FAP的表達(dá)水平。

圖1 子宮肌瘤組織來(lái)源成纖維細(xì)胞處于活化狀態(tài)

Fig.1 Fibroblasts in activation state in uterine fibroid

2.2子宮肌瘤組織中活化成纖維細(xì)胞的雌激素受體表達(dá)增加

細(xì)胞免疫熒光、western-blot和PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，正常平滑肌組織成纖維細(xì)胞和子宮肌瘤TAF均表達(dá)ER-α和ER-β，且TAF ER-α、ER-β的表達(dá)高于平滑肌組織來(lái)源成纖維細(xì)胞)，表明雌激素能作用于子宮肌瘤TAF及平滑肌組織來(lái)源成纖維細(xì)胞(n=10，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

注：A.子宮肌瘤TAF及平滑肌組織來(lái)源成纖維細(xì)胞ER-α、ER-β的表達(dá)水平;B.Western blot檢測(cè)子宮肌瘤TAF及平滑肌組織來(lái)源成纖維細(xì)胞的雌激素受體表達(dá)水平。C.細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)子宮肌瘤TAF及平滑肌組織來(lái)源成纖維細(xì)胞的ER-α、ER-β表達(dá)水平。

圖2 兩種組織來(lái)源成纖維細(xì)胞雌激素受體的表達(dá)

Fig.2 Expressions of estrogen receptors in fibroblasts from two kinds of tissues

2.3雌激素促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖

選擇雌激素作用的兩個(gè)有效濃度(10ng/mL、50ng/mL)，外加雌激素至培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞及TAF，采用MTT法檢測(cè)成纖維細(xì)胞及TAF的增殖能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)雌激素刺激48h、72h后，成纖維細(xì)胞及TAF的增殖活力顯著增強(qiáng)(n=5，P<0.05)，見(jiàn)圖3。表明，雌激素能增強(qiáng)成纖維細(xì)胞及TAF的增殖活力。

注：A.成纖維細(xì)胞的增殖活力；B.TAF的增殖活力。

圖3 雌激素能增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的增殖活力

Fig. 3 Effect of estrogen on proliferation of Fib and TAF cell.

2.4雌激素能激活成纖維細(xì)胞增殖信號(hào)通路、促進(jìn)生長(zhǎng)因子及ECM的分泌

Western blot檢測(cè)了雌激素刺激成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞增殖信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的改變。結(jié)果顯示雌激素能促進(jìn)成纖維細(xì)胞及TAF細(xì)胞的增殖信號(hào)通路分子MEK、ERK1/2及AKT的磷酸化水平，且在50nM濃度的作用較為顯著，見(jiàn)圖4。ELISA法檢測(cè)雌激素分別刺激成纖維細(xì)胞及TAF后，TAF及成纖維細(xì)胞的TGF-β、IGF-1的分泌量均顯著增加(n=5，P<0.05)，見(jiàn)圖5A、圖5B。western-blot檢測(cè)顯示在雌激素的作用下，成纖維細(xì)胞及TAF的FAP、ECM，如CollgenⅠ，F(xiàn)ibronectin、Laminin表達(dá)強(qiáng)度高(n=5，P<0.05)，見(jiàn)圖5C、圖5D，上述結(jié)果提示雌激素能刺激成纖維細(xì)胞活化，釋放生長(zhǎng)因子并促進(jìn)ECM的表達(dá)。

圖4 雌激素能激活成纖維細(xì)胞增殖信號(hào)通路

Fig.4 Effect of estrogen on activating cell proliferation pathway

注：A.成纖維細(xì)胞及TAF的TGF-β的表達(dá)水平。B.成纖維細(xì)胞及TAF的IGF-1表達(dá)水平；C.成纖維細(xì)胞及TAF的Collagen1表達(dá)水平；D.成纖維細(xì)胞及TAF的FAP、Fibronectin及Laminin表達(dá)水平。

圖5 雌激素能促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子及ECM成分

Fig.5 Effect of estrogen on promoting secretion of growth factor and ECM in fibroblast

2.5沉默F(xiàn)AP的表達(dá)能抑制Fib活化及細(xì)胞增殖通路

采用RNAi的方法，抑制FAP的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上用雌激素對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行刺激，結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞在FAP抑制后，細(xì)胞的增殖活性下降，活化水平不如非抑制狀態(tài)下顯著，但未完全阻斷，因此結(jié)果提示雌激素是部分通過(guò)FAP途徑來(lái)活化成纖維細(xì)胞的，見(jiàn)圖6A。且FAP經(jīng)抑制表達(dá)后，細(xì)胞增殖信號(hào)通路分子的磷酸化部分下降，表明FAP在細(xì)胞增殖信號(hào)通路活化中的促進(jìn)作用，見(jiàn)圖6B。成纖維細(xì)胞ECM成分(Fibronectin、Laminin、Collgen Ⅰ)的表達(dá)水平亦下降，表明FAP也影響雌激素介導(dǎo)的ECM活化通路(n=5，P<0.05)，見(jiàn)圖6C。

注：A.TAF的增殖活力;B.細(xì)胞增殖通路信號(hào)分子AKT, MEK, ERK1/2及c-FOS的磷酸化水平;C. TAF的Fibronectin及Laminin的表達(dá)水平。

圖6 沉默F(xiàn)AP基因表達(dá)能抑制成纖維細(xì)胞活化及其細(xì)胞增殖通路

Fig.6 Effect of silencing FAP gene on prohibiting fibroblast activation and its proliferation pathway

3討論

3.1成纖維細(xì)胞活化蛋白表達(dá)對(duì)雌激素調(diào)控的影響

FAP屬于絲氨酸蛋白酶家族，能通過(guò)降解ECM、抑制免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)及激活細(xì)胞信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。但目前為止，F(xiàn)AP在子宮肌瘤中的調(diào)控尚未見(jiàn)有相關(guān)研究。雌激素在子宮肌瘤的發(fā)病過(guò)程中具有重要作用；多種生長(zhǎng)因子，如vEGF、TGF-β、bFGF、IGF-1、EFG也被證實(shí)參與了子宮肌瘤的發(fā)病。近來(lái)有研究表明，肌瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及其之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能也參與了子宮肌瘤的發(fā)病過(guò)程[7]。然而到目前為止，關(guān)于子宮肌瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化情況、活化因素及活化的成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能尚缺乏研究。本課題對(duì)子宮肌瘤與正常平滑肌組織中成纖維細(xì)胞純化分離并進(jìn)行研究，檢測(cè)了子宮肌瘤組織來(lái)源成纖維細(xì)胞的活化水平并驗(yàn)證了其生物學(xué)活性，同時(shí)探索了FAP表達(dá)對(duì)雌激素調(diào)控子宮正常平滑肌組織與肌瘤組織成纖維細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響。

3.2成纖維細(xì)胞的活化程度顯著高正常子宮平滑肌組織

TAF主要來(lái)自組織中成纖維細(xì)胞的活化，TAF的標(biāo)記蛋白包括α-SMA、FAP、成纖維細(xì)胞特異蛋白1(fibroblast specific protein 1，F(xiàn)SP1)等[8]。FAP特異表達(dá)于組織損傷愈合過(guò)程及90%以上的上皮惡性腫瘤的基質(zhì)成纖維細(xì)胞中，包括結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌，在正常組織成纖維細(xì)胞中通常不表達(dá)，可作為一個(gè)確定的成纖維細(xì)胞激活表型的標(biāo)記物[9]。本文研究發(fā)現(xiàn)，TAF FAP的表達(dá)水平明顯高于成纖維細(xì)胞。結(jié)果表明，子宮肌瘤組織中成纖維細(xì)胞的活化程度顯著高正常子宮平滑肌組織。

鑒于活化的成纖維細(xì)胞在腫瘤發(fā)病過(guò)程中的重要作用及雌激素在子宮肌瘤發(fā)病機(jī)制中的作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了雌激素對(duì)成纖維細(xì)胞的活化作用。眾所周知，雌激素主要通過(guò)ER介導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。到目前為止，尚未有關(guān)于子宮肌瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞ER的表達(dá)情況的研究。本課題通過(guò)免疫磁珠法分別分離出子宮正常平滑肌組織和子宮肌瘤組織中的成纖維細(xì)胞，并檢測(cè)ER的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TAF及Fib均表達(dá)雌激素受體(ER-α、ER-β)，且在TAF上的表達(dá)水平明顯高于Fib，提示TAF較Fib對(duì)雌激素刺激可能具有更高的敏感性。然而，經(jīng)過(guò)雌激素刺激，肌瘤與平滑肌組織來(lái)源成纖維細(xì)胞究竟會(huì)有什么樣的生物學(xué)行為改變，及其可能在子宮肌瘤生發(fā)過(guò)程中的作用，目前也未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究采用雌激素刺激TAF及Fib，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雌激素刺激后，TAF及Fib的增殖活力較刺激前增強(qiáng)；FAP、ECM成分(Collagen I、Fibronectin、Laminin)、生長(zhǎng)因子(TGF-β、IGF-1)的表達(dá)水平均發(fā)生顯著上調(diào)，且表現(xiàn)為濃度依賴(lài)性；此外，兩種組織來(lái)源成纖維細(xì)胞的增殖通路信號(hào)分子(p-AKT，p-MEK，p-ERK及p-c-Fos)的磷酸化水平也上調(diào)；提示雌激素能活化兩種組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞，并促進(jìn)其分泌ECM成分、細(xì)胞因子及增殖活力的增強(qiáng)。

3.3成纖維細(xì)胞活化蛋白參與了腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)控

FAP不僅是成纖維細(xì)胞活化后特異表達(dá)的標(biāo)記物，研究表明，F(xiàn)AP還參與了腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)控。FAP屬于絲氨酸蛋白酶家族，能降解脯氨酸與其他氨基酸之間的肽鍵，同時(shí)FAP還具有內(nèi)肽酶活性使其具有降解明膠、I型膠原蛋白的能力，重塑ECM，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲能力[10]，F(xiàn)AP陽(yáng)性細(xì)胞具有免疫抑制能力，能夠抑制免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)[11-12]，此外，有研究還表明，除了酶活性外FAP還具有激活細(xì)胞信號(hào)通路的能力，也能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[13-14]。但目前為止，F(xiàn)AP在子宮肌瘤中的調(diào)控尚未見(jiàn)有研究。本課題采用RNAi特異沉默TAF中FAP基因的表達(dá)，進(jìn)一步觀察抑制FAP表達(dá)對(duì)成纖維細(xì)胞活化及增殖調(diào)控相關(guān)事件的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TAF的FAP被抑制后，雌激素介導(dǎo)的促TAF分泌 ECM成分、生長(zhǎng)因子(TGF-β、IGF-1)及增強(qiáng)TAF的增殖活力的作用被抑制，細(xì)胞增殖通路上的相關(guān)信號(hào)分子(AKT、ERK、c-Fos、 MEK)的磷酸化水平也顯著降低。以上結(jié)果表明，F(xiàn)AP在雌激素促成纖維細(xì)胞活化的過(guò)程中具有重要作用。

本課題對(duì)子宮肌瘤成纖維細(xì)胞進(jìn)行了獨(dú)立研究，證明成纖維細(xì)胞在子宮肌瘤中處于活化狀態(tài)，雌激素能活化成纖維細(xì)胞，活化的成纖維細(xì)胞能夠分泌TGF-β，通過(guò)自分泌和(或)旁分泌途徑，放大活化效應(yīng)，介導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖效應(yīng)，而沉默F(xiàn)AP基因表達(dá)后則能抑制活化的成纖維細(xì)胞的上述生物學(xué)作用。本課題結(jié)果提示：基質(zhì)成纖維細(xì)胞活化在子宮肌瘤發(fā)病中具有重要作用；FAP在成纖維細(xì)胞促細(xì)胞增殖效應(yīng)中具有關(guān)鍵作用，可能成為今后的治療靶點(diǎn)。

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[專(zhuān)業(yè)責(zé)任編輯：呂淑蘭]

Inhibiting estrogen-mediated cell proliferation effect by silencing the expression of fibroblast cell FAP gene

LUO Ning1, YANG Juan-juan2, GUO Jing1, CHEN Li1, CHENG Zhong-ping1

(1. Department of Obstetrics and Gynecology, Yangpu Hospital Affiliated to Tongji University,Minimally Invasive Gynecology Lab, Medical College of Tongji University, Shanghai 200090, China;2.The First People’s Hospital of Wujiang District, Jiangsu Suzhou 215200, China)

Objective To explore the effect of fibroblast activation protein (FAP) expression on the estrogen-mediated activation and proliferation of uterine leiomyoma fibroblast cell. Methods Fibroblast cells from uterine smooth muscle (fib) and uterine leiomyoma or tumor associated fibroblast (TAF) were separated using immunomagnetic beads, and the expression of estrogen receptor (ER-α/ER-β) was measured. Normal uterine smooth muscle fibroblast and uterine lieomyoma fibroblast or tumor associated fibroblast (TAF) were stimulated with estrogen, and the changes of FAP, extracellular matrix (ECM), growth factor secretion, cell proliferation activity and signal molecular of cell proliferation pathway were measured. The expression of FAP gene in TAF was silenced by RNA interference and the influence of estrogen on expressions of the above TAF markers was analyzed. Results The expression levels of FAP and ER-α/ER-β in TAF were higher than those in fibroblast (n=10,P<0.05). After E2stimulation, the expressions of FAP, ECM(Fibronectin, Laminin, Collgen I)and growth factor(TGF-β, IGF-1), proliferation activity and phosphorylation level of signal molecular of cell proliferation pathway(AKT, ERK, c-Fos, MEK)increased . Silencing FAP expression with RNA interference could inhibit the E2-mediated biological effects. Conclusion FAP expression is the key to the E2-mediated activation and proliferation of fibroblast cells, which hints that FAP may play an important role in the pathogenesis of uterine leiomyoma, and can be targeted in future for the treatment of uterine leiomyoma.

uterine fibroid; fibroblast; tumor association fibroblast (TAF); estrogen; fibroblast activation protein (FAP)

2015-05-25

羅 寧(1986-)，男，住院醫(yī)師，碩士研究生，主要從事婦科微創(chuàng)技術(shù)、子宮肌瘤的研究。

程忠平，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.015

R737.33

A

1673-5293(2016)10-1210-05