羅潤，郭麗瓊**，林俊芳，韓飛，李瓊潔，康林芝

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)研究所，廣東廣州510640; 2.廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510640；3.廣東汕頭質(zhì)量與計量監(jiān)督檢測研究所，廣東汕頭515000)

金針菇耐高溫新菌株的誘變選育*

羅潤1，2，郭麗瓊1，2**，林俊芳1，2，韓飛3，李瓊潔1，2，康林芝1

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)研究所，廣東廣州510640; 2.廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510640；3.廣東汕頭質(zhì)量與計量監(jiān)督檢測研究所，廣東汕頭515000)

以黃色金針菇（Flammulina velutipes）菌株FV7為材料，采用紫外線誘變、氯化鋰誘變和甲基磺酸乙酯（EMS）誘變等多種誘變方法對金針菇的菌絲細(xì)胞進(jìn)行誘變，誘變后的菌絲細(xì)胞經(jīng)過菌絲體生長階段33℃高溫初篩和子實(shí)體發(fā)育階段20℃中溫復(fù)篩，并經(jīng)過多輪篩選獲得耐高溫突變菌株FV7EMS。研究結(jié)果表明，采用甲基磺酸乙酯對金針菇菌絲細(xì)胞的誘變效果明顯，突變菌株FV7EMS能在20℃溫度出菇，且生長速度快、菌柄較長，生物學(xué)效率比親本FV7提高了28.82%，與親本間存在較大的遺傳差異。金針菇耐高溫新品種的培育，對于降低工廠化栽培能耗、多季節(jié)栽培金針菇有重要的科學(xué)研究價值。

金針菇；誘變育種；誘變劑；高溫品種

金針菇（Flammulina velutipes）富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素以及礦物質(zhì)，其中賴氨酸、精氨酸等人體必需氨基酸對促進(jìn)兒童的生長發(fā)育有重要作用，在國外有“增智菇”的美譽(yù)[1]，而金針菇菌體內(nèi)多糖在抗炎、抗疲勞、耐缺氧及提高巨噬細(xì)胞吞噬功能方面作用顯著[2]。目前廣泛用于工廠化栽培的金針菇有黃色和白色兩個品種，其中黃色金針菇比白色金針菇酚類物質(zhì)等活性成份的含量更高[3]。

金針菇屬低溫結(jié)實(shí)性真菌，菌絲體在5℃～32℃范圍內(nèi)均能生長，最適溫度為22℃～25℃，子實(shí)體生長期對溫度要求較為嚴(yán)格，需在8℃～14℃的低溫范圍內(nèi)才可正常生長[4-5]。已有研究表明，溫度是金針菇子實(shí)體形成的關(guān)鍵因素之一，金針菇菌絲不經(jīng)過低溫刺激，在23℃條件下無法形成原基子實(shí)體[6]。因此，培育耐高溫的金針菇新品種，對于降低工廠化反季節(jié)栽培的能耗、多季節(jié)栽培金針菇以及提高栽培的經(jīng)濟(jì)效益等方面有重要的研究和商業(yè)價值[7]。自然選育是獲得優(yōu)良菌株最基本的方法，但因其自發(fā)突變率低、耗時長等缺點(diǎn)，已經(jīng)不能滿足人們的需要。誘變育種能夠在較短的時間內(nèi)，通過改變遺傳特性，快速獲得理想菌株，彌補(bǔ)自然選育的不足，已經(jīng)成為目前食用菌菌種培育的一個主要途徑，常用的誘變方法根據(jù)誘變劑的不同可分為化學(xué)誘變、物理誘變和復(fù)合誘變[8-9]。本研究以黃色金針菇菌株FV7為實(shí)驗(yàn)材料，通過誘變劑誘變和不同的篩選方法相結(jié)合，培育出耐高溫、生長快、具有更高生物學(xué)效率的金針菇新菌株。

1　材料與方法

1.1菌株和培養(yǎng)基

黃色金針菇（F.velutipes）菌株FV7，購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)菌株中心。

棉籽殼培養(yǎng)料：棉籽殼78%、麩皮20%、蔗糖1%、碳酸鈣1%，料水比為1∶1.6。

1.2試劑

0.01mol·L-1磷酸緩沖液：稱取NaCl 7.9 g、KCl 0.2 g、KH2PO40.24 g和K2HPO41.8 g，溶于800 mL蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，最后加蒸餾水定容至1 L。

氯化鋰（LiCl）誘變液：用0.01 mol·L-1磷酸緩沖液配制所需濃度（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.5%、2%、2.5%），現(xiàn)配現(xiàn)用，過濾除菌。

甲基磺酸乙酯（EMS）誘變液：用0.01 mol·L-1磷酸緩沖液配置0.1 mol·L-1的甲基磺酸乙酯誘變液，現(xiàn)配現(xiàn)用，過濾除菌。

1.3FV7菌株對溫度的敏感性檢測

1.3.1菌株FV7菌絲體對溫度的敏感性檢測

菌株FV7經(jīng)過PDA平板25℃活化培養(yǎng)后，接種于PDA平板上（直徑90 mm），接種菌塊大小一致（約2 mm3），接種后分別置于0、5℃、18℃、20℃、23℃、25℃、30℃和33℃下恒溫培養(yǎng)，每個溫度重復(fù)3次，8 d后測量菌落直徑，計算菌絲生長速度，測定FV7菌絲的最高抑制溫度值，以便確定突變株菌絲階段篩選的溫度。

1.3.2菌株FV7子實(shí)體形成對溫度的敏感性檢測

菌株FV7在PDA平板25℃培養(yǎng)7 d后，切取4 mm3～6 mm3的菌塊接種于裝有300 g棉籽殼培養(yǎng)基的17 cm×32 cm×0.005 cm聚丙烯塑料折角袋中，25℃培養(yǎng)至菌絲長滿栽培袋后，分別置于16℃、18℃、20℃和22℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個溫度重復(fù)10袋，記錄其生長趨勢、原基數(shù)和生物學(xué)效率。通過出菇情況，統(tǒng)計得出菌株子實(shí)體形成的最高溫度。

1.4誘變處理和突變株的篩選

1.4.1紫外線對金針菇菌絲的誘變試驗(yàn)

采用PDA平板培養(yǎng)金針菇菌絲，將金針菇菌絲體用內(nèi)徑為0.5 cm的無菌圓柱空心棒進(jìn)行切割，轉(zhuǎn)接于新的PDA平板上，每個板接約40個菌塊。把轉(zhuǎn)接好的平板置于15 W的紫外燈下30 cm處，用不同的時間（0、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min、270 min、300 min、360 min、420 min、480 min、540 min）進(jìn)行紫外線輻射處理，各處理重復(fù)3次。經(jīng)紫外輻射處理后，用錫箔紙嚴(yán)密包裹平板，防止光線照射使菌絲復(fù)活，然后置于25℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，7 d后觀察并計算菌絲致死率。在確定紫外線對金針菇菌絲細(xì)胞致死率的基礎(chǔ)性上，選取致死率在80%左右的紫外輻射劑量對金針菇菌絲細(xì)胞進(jìn)行誘變處理，每個板接種約40個菌塊，平行重復(fù)5次。相對致死率（P）公式為：

式中：N1表示紫外處理后死亡菌塊數(shù)；N2表示未處理死亡菌塊數(shù)；N表示接種總數(shù)。

1.4.2氯化鋰對金針菇菌絲的誘變試驗(yàn)

采用PDA平板預(yù)先培養(yǎng)金針菇菌絲體，將金針菇菌絲體用內(nèi)徑為0.5 cm的無菌圓柱空心棒進(jìn)行切割，然后轉(zhuǎn)接于不同濃度（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.5%、2%、2.5%）的LiCl培養(yǎng)板中，各處理重復(fù)3次。每個LiCl培養(yǎng)皿中接種約40個菌塊，25℃黑暗培養(yǎng)7 d后，觀察計算菌絲致死率。在確定LiCl對金針菇菌絲細(xì)胞致死率的基礎(chǔ)性上，選取致死率在80%左右的LiCl濃度對金針菇菌絲細(xì)胞進(jìn)行誘變處理，每個板接種約40個菌塊，平行重復(fù)5次。相對致死率（P1）公式為：

式中：N3表示氯化鋰處理后死亡菌塊數(shù)；N4表示未處理死亡菌塊數(shù)；N表示接種總數(shù)。

1.4.3甲基磺酸乙酯（EMS）對金針菇菌絲的誘變試驗(yàn)

采用PDA平板25℃恒溫活化培養(yǎng)金針菇菌絲體7 d，將金針菇菌絲體用內(nèi)徑為0．5 cm的無菌圓柱空心棒進(jìn)行切割，放入0．1 mol·L-1EMS誘變液浸泡處理不同的時間（0、0．5 h、1 h、1．5 h、2 h、3 h、4 h和5 h），將處理后的菌絲分別轉(zhuǎn)接于新的PDA平板中，每個平板中接種約40個菌塊，25℃黑暗培養(yǎng)7 d后，觀察計算菌絲致死率。選取致死率達(dá)80%的最短時間作為誘變處理時間，進(jìn)行誘變處理，各處理重復(fù)3次。在確定EMS對金針菇菌絲細(xì)胞致死率的基礎(chǔ)性上，選取致死率在80%左右的EMS處理時間對金針菇菌絲細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)行誘變處理，每個板接種約40個菌塊，平行重復(fù)5次。相對致死率（P）2公式為：

式中：N5表示EMS處理后死亡菌塊數(shù)；N6表示未處理死亡菌塊數(shù)；N表示接種總數(shù)。

1．4．4突變菌株菌絲階段的篩選（初篩）

把經(jīng)過誘變處理后存活的金針菇菌塊轉(zhuǎn)接于PDA平板上，先置于30℃暗培養(yǎng)24 h后再放置于33℃中繼續(xù)暗培養(yǎng)15 d，挑選出能繼續(xù)生長且具有正常菌落形態(tài)的突變株做進(jìn)一步的子實(shí)體形成（出菇）篩選。

1．4．5突變菌株子實(shí)體形成階段的篩選（復(fù)篩）

把菌絲階段高溫篩選得到的突變菌株，選擇菌落形態(tài)正常、生長旺盛的菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上培養(yǎng)7 d后，切取4 mm3～6 mm3的菌塊接種于裝有300 g培養(yǎng)料的栽培袋中，每個菌株接種15袋，同時接種原始菌株FV7為對照；接種后置于25℃培養(yǎng)至菌絲長滿栽培袋后再置于20℃菇房培養(yǎng)，記錄其出菇時間和原基數(shù)；出菇后80%～90%子實(shí)體菌柄長度在13 cm～15 cm成熟時，測量菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度、菌柄直徑等性狀，并測算菌株的生物學(xué)效率。各菌株試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用15袋的平均值，應(yīng)用DSP數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對所測數(shù)據(jù)應(yīng)用LSD法進(jìn)行統(tǒng)計分析。生物學(xué)效率為子實(shí)體鮮重除以栽培料干重乘以100%（僅測算第1潮菇）。

1.5拮抗性測定和突變株的穩(wěn)定性分析

突變株經(jīng)過3次～5次傳代培養(yǎng)活化后，從親本和突變株P(guān)DA平板上，取大小相同的菌塊接種于同一PDA培養(yǎng)板上，25℃培養(yǎng)8 d后，觀察親本FV7和突變株間的拮抗反應(yīng)。為了驗(yàn)證突變株的性狀穩(wěn)定性，將經(jīng)過3次傳代培養(yǎng)后的親本和突變株同時進(jìn)行高溫出菇實(shí)驗(yàn)，觀察其出菇情況。

2　結(jié)果與分析

2.1溫度篩選

金針菇原始菌株FV7在不同溫度下的菌絲生長速度見圖1。

圖1　金針菇原始菌株FV7菌絲在不同溫度下的生長速度Fig．1Growth rate of the original strain FV7 of F.velutipes at different temperatures

從圖1可以看出，菌絲在18℃～30℃范圍內(nèi)，菌絲生長速度快，且呈不斷上升的趨勢，但30℃時生長速度達(dá)到頂峰后極速下降，在33℃時菌絲停止生長。所以，選擇33℃作為誘變菌株菌絲階段高溫初篩的溫度。菌株FV7在不同溫度下子實(shí)體生長情況見表1。

表1　不同溫度對金針菇菌株FV7子實(shí)體形成的影響Tab．1Effect of different temperatures on fruiting body formation of original strain FV7 of F.velutipes

從表1可知，在溫度20℃條件下基本不形成原基，所以將20℃設(shè)定為子實(shí)體階段中溫復(fù)篩的溫度。

2.2誘變處理致死曲線

不同誘變處理金針菇原始菌株FV7菌絲致死率曲線見圖2。本研究選擇致死率在80%左右的致死劑量作為誘變處理?xiàng)l件。

圖2　誘變處理金針菇FV7菌絲的致死率曲線Fig.2Lethality curve of F.velutipes strain FV7 mycelia during mutagenesis

從圖2A和圖2C可知，隨著紫外線輻射時間和1%EMS處理時間增加，菌絲致死率也相應(yīng)提高，所以最終選擇紫外輻射時間2 h（致死率96.25%），1% EMS處理2 h（致死率約為80%），作為最終的誘變處理時間。從圖2B曲線圖可以看出，隨著LiCl濃度的增加，菌絲致死率相應(yīng)提高，所以，選擇1% LiCl（致死率87%）作為最終的誘變處理?xiàng)l件。

2.3突變菌株菌絲體培養(yǎng)階段高溫篩選結(jié)果

原始菌株FV7菌絲體經(jīng)過多次紫外線輻射、LiCl誘變和EMS三種誘變處理之后，能在PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)生長的菌塊為擬突變菌株。隨機(jī)選擇擬突變菌株各120株左右，先置于30℃暗培養(yǎng)24 h，后放置于33℃中繼續(xù)暗培養(yǎng)15 d，能正常生長的菌絲即為耐高溫的突變菌株。篩選結(jié)果表明，紫外線輻射和LiCl誘變的處理在33℃溫度下均沒有獲得突變菌株，只有EMS誘變劑獲得4個誘變個體，結(jié)果見圖3（圖未全附）。

圖3　EMS誘變的擬突變菌株在33℃下培養(yǎng)的平板圖Fig.3Mutant strains cultured at 33℃temperature after the EMS mutagenesis

從圖3可以看出，大部分誘變處理后的擬突變菌株在33℃高溫下與對照一樣不能生長（圖1），只有約3%的擬突變株能夠在33℃的溫度下生長（圖3箭頭所示），說明這些突變菌株的基因組序列發(fā)生了改變，通過了高溫的篩選。

2.4突變菌株子實(shí)體形成階段中溫篩選結(jié)果

為了獲得能夠在20℃形成子實(shí)體（出菇）的新菌株，將在菌絲階段篩選得到的4株突變株和親本一起在20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行第2次篩選，試驗(yàn)結(jié)果表明，4株的突變菌株中只有FV7EMS能夠形成正常的子實(shí)體，而且生物學(xué)效率最高（圖4、表2）。

從圖4可以看出，4株突變株在子實(shí)體形成階段的原基數(shù)量均明顯多于親本，且突變株FV7EMS生長最為旺盛。從表2可以看出，突變株FV7EMS和原始菌株相比，具有生長勢強(qiáng)、生育期短、原基數(shù)多、菌柄直立且較長等特點(diǎn)，生物學(xué)效率達(dá)35.38%，比親本菌株的生物學(xué)效率提高5倍多，這表明突變菌株FV7EMS比親本FV7具有更好的高溫耐受性，能在20℃出菇，且具有更好的性狀優(yōu)勢。

2.5突變菌株和親本遺傳變異分析

突變菌株FV7EMS和親本FV7的拮抗性試驗(yàn)見圖5。

從圖5中可看出兩者之間有很明顯的拮抗線，

這說明突變菌株FV7EMS的基因組序列已經(jīng)發(fā)生了變化，形成了新的菌株。因?yàn)楫?dāng)一個新菌株與親本菌株在一起培養(yǎng)時，其菌絲體會產(chǎn)生自然屏障出現(xiàn)相互拮抗現(xiàn)象[10]，即拮抗線。結(jié)果表明突變菌株FV7EMS和親本FV7之間有較大的遺傳差異。

2.6突變菌株FV7EMS的穩(wěn)定性分析

突變菌株FV7EMS和親本FV7在多次繼代培養(yǎng)后，經(jīng)過33℃菌絲培養(yǎng)作為菌種，接種棉籽殼培養(yǎng)基質(zhì)上在20℃進(jìn)行出菇培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，出菇情況見圖6。

圖4　親本和4株突變菌株在20℃出菇情況Fig.4Fruiting experiment at 20℃of parent strain and 4 mutant strains

表2　突變菌株FV7EMS和親本FV7出菇性狀Tab.2Fruiting characters of mutant strain FV7EMS and parent strain FV7

圖5　突變菌株FV7EMS和親本FV7菌株之間的拮抗性Fig.5Determination of antagonism between mutants strain FV7EMS and parent strain FV7

圖6　突變株FV7EMS和FV7出菇情況Fig.6Fruiting experiment of mutant strain FV7EMS and FV7 descendant

從圖6可以看出，突變菌株FV7EMS能正常出菇，子實(shí)體整齊，長勢旺盛；而親本FV7在20℃溫度下雖然有少數(shù)原基形成，但基本上不能正常發(fā)育形成子實(shí)體，表明突變菌株能夠穩(wěn)定遺傳。

3　討論

金針菇的育種方法有自然育種、誘變育種、雜交育種和利用生物工程（細(xì)胞融合和基因重組）育種等。誘變育種是金針菇菌種選育的一個重要途徑。金針菇紫外線誘變育種工作的研究已經(jīng)取得了階段性的進(jìn)展[11]，成亞利等[12]采用紫外照射誘變處理金針菇原生質(zhì)體，獲得生長快、長勢好的優(yōu)良菌株，張淑霞[13]利用紫外線照射誘變金針菇，獲得耐堿性穩(wěn)定、長勢好、產(chǎn)量高的3個菌株。本研究采用了紫外線誘變、氯化鋰誘變和EMS誘變?nèi)N誘變方法，但只有EMS誘變獲得了耐高溫出菇的新菌株FV7EMS，紫外線和氯化鋰誘變處理在菌絲階段獲得了能夠耐高溫的突變菌株，但這些突變菌株均未能在20℃較高溫條件下順利形成原基，說明不同的誘變劑對金針菇基因組作用的突變位點(diǎn)不同。當(dāng)突變位點(diǎn)不涉及子實(shí)體形成的基因位點(diǎn)時，可能就不會改變子實(shí)體的發(fā)育。本研究的結(jié)果表明，對于黃色金針菇而言，EMS誘變劑能夠在控制金針菇子實(shí)體形成的基因位點(diǎn)上有效地發(fā)生突變，是一種較理想的誘變劑。同時，本研究所獲得的突變菌株將為研究金針菇子實(shí)體形成機(jī)理提供優(yōu)良的材料。本研究團(tuán)隊以白色金針菇品種FV1為出發(fā)菌株，采用紫外線、EMS誘變劑和紫外線、氯化鋰、EMS三種誘變劑復(fù)合誘變均獲得耐高溫的金針菇目標(biāo)突變菌株。其中復(fù)合誘變獲得的菌株，其生物轉(zhuǎn)化率最高[14]。研究表明了不同金針菇品種對誘變劑的敏感性不同，可能產(chǎn)生的突變位點(diǎn)也不同，對于不同誘變劑及誘變方法所產(chǎn)生的不同誘變效果的機(jī)理，有待進(jìn)一步的研究。

在誘變育種工作中，除了誘變方法外，高效、準(zhǔn)確的篩選方法同樣是決定育種成敗的關(guān)鍵。食用菌由于其生長分為營養(yǎng)生長階段（菌絲生長）和子實(shí)體發(fā)育生長階段的特殊性，決定了其育種篩選方法的特殊性，即一個性狀良好的突變體菌絲可能不形成子實(shí)體或子實(shí)體性狀不及親本。因此，本團(tuán)隊經(jīng)過大量的前期試驗(yàn)摸索，提出金針菇突變菌株的雙階段篩選方法，即菌絲階段的33℃高溫篩選和子實(shí)體階段的20℃中溫復(fù)篩，兩步方法相結(jié)合。結(jié)果表明在菌絲階段表現(xiàn)耐33℃高溫的突變菌株，在子實(shí)體復(fù)篩階段不能形成子實(shí)體或子實(shí)體產(chǎn)量與親本相當(dāng)，只有少數(shù)突變菌株能在復(fù)篩階段表現(xiàn)出預(yù)期性狀。本研究結(jié)果最終只成功獲得一個突變株FV7EMS，突變成功率只有0.25%。突變株FV7EMS與親本FV7相比，主要有原基數(shù)多、整齊度好、菌柄直立且較長、單叢菇朵數(shù)較多、生長勢較強(qiáng)、株型較好、生育期短等特點(diǎn)，生物學(xué)效率達(dá)35.38%，比親本FV7的生物學(xué)效率提高5倍多，兩者的拮抗性試驗(yàn)表明突變體FV7EMS和親本FV7之間有較大的遺傳差異。

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A Novel High-temperature-tolerant Strain of Flammulina velutipes by Mutagenesis

LUO Run1,2,GUO Li-qiong1,2,LIN Jun-fang1,2,HAN Fei3,LI Qiong-jie1,2,KANG Lin-zhi1
(1.College of Food Science,Institute of Food Biotechnology,South China Agricultural University,Guangzhou 510640,China; 2.Microecologics Engineering Center of Guangdong Province,Guangzhou 510640,China; 3.Guangdong Shantou Supervision Testing Institute of Quality and Metrology,Shantou 515000,China)

The mycelial fragments of Flammulina velutipes(strain FV7,yellow）were treated with ultraviolet light(UV),ethylmethane sulfonate(EMS)and lithium chloride(LiCl).Then the mycelial cell treated with mutation was screened at 33°C during mycelial growth period and at 20°C during fruiting body development period,and heat resistant mutant strain FV7EMS was obtained.The results showed that EMS had significant mutagenic effects on hypha cells,the mutant strain was high-temperature resistant varieties with long stipe,and it grew fast,compared with original strain FV7,the biological efficiency was higher with 28.82%,which presented apparent genetic differences to the original strain.The breeding of F.velutipes with high-temperature resistance was of great importance in factory energy consumption and its multi-season cultivation.

Flammulina velutipes;mutation breeding;mutagen;high-temperature-resistant varieties

S646.1

A

1003-8310（2016）04-0018-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.005

國家自然科學(xué)基金（31372116、31572178）；廣東省科技計劃項(xiàng)目（2012A020100010、2013B010404041）。

羅潤（1990-），女，在讀碩士研究生，主要從事食品微生物研究。E-mail:670125876@qq.com

**通信作者：郭麗瓊（1963-），女，博士，教授，主要從事食用菌天然產(chǎn)物研究。E-mail:guolq@scau.edu.cn

2016-05-20