杜偉鋒，張瑞瑞，周思，黃金鳳，王永華*，何敏恒，黃榮榮

（1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510006；2.廣州質量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州511400）

高效液相色譜同時測定植物飲料中7種植物毒素

杜偉鋒1，2，張瑞瑞2，周思2，黃金鳳2，王永華1*，何敏恒2，黃榮榮2

（1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510006；2.廣州質量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州511400）

建立了同時檢測植物飲料中原百部堿、香豆素、黃連素、山道年、細辛腦、長葉薄荷酮和蘆薈苷A 7種植物毒素含量的高效液相色譜法。試樣經(jīng)HLB固相萃柱富集凈化，甲醇洗脫，氮吹濃縮后用流動相起始梯度定容至1.0 mL，經(jīng)Welch Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）分離，以甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液（pH=3）為流動相梯度洗脫，通過紫外檢測器進行檢測。7種植物毒素化合物在0.20～100.00 mg/L范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)均＞0.99，方法的檢出限分別為0.2～6.5 μg/kg，定量限為0.8～21.6 μg/kg。分別對3種植物飲料樣品進行加標回收率實驗，回收率為67.1%～104.0%，相對標準偏差（n=6）為1.08%～5.12%。該方法操作簡單，具有較高的準確度和精密度，適用于植物飲料中7種植物毒素含量的檢測。

植物毒素；植物飲料；高效液相色譜法

近年來，隨著人們健康養(yǎng)生意識的提高，植物飲料受到越來越多人的青睞，涼茶等天然植物飲料銷量迅速增長，產(chǎn)銷量直追包裝水、碳酸類飲料等傳統(tǒng)飲品。植物飲料的安全性成為食品安全領域中不可回避的問題，其中以植物毒素的監(jiān)測尤為突出。目前，我國暫時還無相關的標準和法規(guī)出臺，只對植物飲料原輔料的要求中提到不得使用或添加非食品用原料[1-2]，國際方面《歐盟食品中化學污染物限量規(guī)定》對飲料中的植物相關毒素規(guī)定如下：原百部堿為1 mg/kg，香豆素為2 mg/kg，黃連素為0.1 mg/kg，山道年為1 mg/kg，細辛腦為0.1 mg/kg，長葉薄荷酮為250 mg/kg和蘆薈苷為0.1 mg/kg。鑒于我國作為植物性飲料的生產(chǎn)和消費大國，在專門針對植物飲料的相關檢測方法及標準的建立上比較滯后，暫無相關報道。因此，開展植物飲料中的植物毒素的檢測研究，建立相關檢測方法，對保障植物飲料質量安全、規(guī)范飲料生產(chǎn)市場、進行相關安全隱患調(diào)查及風險評估具有積極意義。

目前關于植物毒素的檢測方法主要有傳感器法、電化學方法[3-4]、化學發(fā)光[5]、氣相色譜法（gas chromatogra phy，GC）[5]、液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[6-9]、氣相色譜-電子轟擊離子化質譜法（gas chromatography-electronic ionization-mass spectrometer，GC-EI-MS）[10]、超高壓液相色譜法（ultra performance liquidchromatography，UPLC）[11]、氣相色譜-串聯(lián)質譜（gas chro matography-tandem mass spectrometer，GC-MS/MS）法[10]、高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質譜法（high performance liquid chromatography-triple quadroploe massspectrometry，HPLC-TQ/MS）[12-13]、液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜（liquid chromatography-quadrupole-time of flight，LC-Q-TOF）[14]等。鑒于GC-MS/MS、HPLC-MS/MS、LC-Q-TOF儀器昂貴，使用成本高，且7種植物毒素多為不易揮發(fā)性類物質，因此本試驗通過比較選擇固相萃取柱、洗脫溶劑，確定氮吹溫度、優(yōu)化儀器參數(shù)和條件，建立了高效液相色譜法同時檢測植物飲料中7種植物毒素類化合物含量的方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

原百部堿（純度98%）：上海源葉生物技術有限公司；香豆素（純度98.0%）：上海哈靈生物科技有限公司；黃連素標準品（純度99.0%）：美國Sigma-Aldrich公司；山道年標準品（純度99.8%）：湖北遠成賽創(chuàng)科技有限公司；細辛腦標準品（純度70.9%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；長葉薄荷酮標準品（純度93.5%）：美國Chroma Dex公司；蘆薈苷A標準品（純度99.0%）：上海安譜實驗科技有限公司。7種植物毒素用甲醇分別配制成1.0 g/L標準儲備液，4℃保存。

甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正己烷（均為色譜純）：德國Merck公司；甲酸（色譜純）：美國Sigma公司；超純水（18.2 MΩ·cm）：實驗室自制。HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL）、C18固相萃取柱（500 mg，6 mL）、NH2固相萃取柱（500 mg，6cc）：沃特世科技（上海）有限公司；Carbon-GCB固相萃取柱（250 mg，6 mL）：上海安譜科學儀器有限公司。

分析樣品（20種植物飲料）：市售。

1.2儀器與設備

Agilent 1260DAD VL高效液相色譜/二極管陣列檢測器系統(tǒng)：美國安捷倫公司；MS3 basic漩渦混合器：德國IKA公司；Turbo LV濃縮工作站：美國Biotage公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器：美國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相A為甲醇，流動相B為10 mmol/L乙酸銨水溶液（pH=3）；梯度洗脫程序：0～12.0 min，10%A～55%A；12.0～27.0 min，55%A；27.0～27.1 min，55%A～90%A；27.1～29.9min，90%A；29.9～30.0min，90%A～10%A；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；后運行5 min；檢測波長：260 nm（原百部堿、香豆素、黃連素、山道年、細辛腦、長葉薄荷酮），355 nm（蘆薈苷A）；進樣量50 μL。

1.3.2樣品預處理

樣品搖勻后（如樣品存在固體或者果肉沉淀，則需要均質），準確稱取10.0g樣品于25mL高速離心管中，15 000 r/min高速離心3 min后吸取上清液到HLB固相萃取柱（使用前用6 mL甲醇，6 mL去離子水活化）中，在離心管中加入3 mL去離子水洗滌殘渣，高速離心后上柱，重復一次。用5 mL 25%（V/V）甲醇-水淋洗HLB柱，棄去流出液。用5 mL甲醇洗脫，接收洗脫液于60℃水浴氮吹濃縮至近干，使用流動相A∶B=10∶90（V/V）定容至1.00 mL，渦旋復溶，待HPLC分析。

2　結果與分析

2.1標準品的高效液相色譜檢測

由于原百部堿和黃連素為生物堿，化合物的堿性較強、極性大，在進行高效液相色譜檢測時，易出現(xiàn)色譜峰形較差、拖尾等現(xiàn)象。因此，采用在流動相中添加乙酸銨緩沖液（pH=3）以改善峰形和分離效果。將7種植物毒素標準溶液按1.3.1所示的色譜條件進行檢測，得到標準品色譜圖，結果如圖1。

圖1　 7種植物毒素的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of seven kinds of phytotoxins

由圖1可知，該色譜條件既可加快以上7種植物毒素的分析時間，又能達到較好的分離效果及響應需求。

2.2固相萃取柱、淋洗液及洗脫劑的選擇

2.2.1固相萃取柱的選擇

HLB、C18、NH2柱和Carbon-GCB 4種固相萃取柱，分別添加相同質量濃度的7種植物毒素標準溶液進行回收率實驗，在其他實驗條件相同的情況下，考察不同固相萃取柱對加標回收率的影響，結果見圖2。

由圖2可知，使用HLB固相萃取柱富集凈化時，7種植物毒素的回收率均為最高，回收率范圍為74.9%～105%。因此，選擇HLB固相萃取柱進行萃取植物毒素。

圖2　固相萃取柱對回收率的影響Fig.2 Effect of solid phase extraction column on recoveries

2.2.2淋洗液的選擇

在淋洗過程中，分別選擇10%、15%、20%、25%，30%、35%（V/V）甲醇-水淋洗上樣后的萃取柱，收集流出液使用HPLC進行分析，考察淋洗液甲醇含量對洗脫率的影響，結果見圖3。

圖3　淋洗液甲醇含量對洗脫率的影響Fig.3 Effect of leacheate methanol concentration on elution rates

由圖3可知，淋洗液甲醇含量＞25%時，流出液中可以檢測出黃連素、香豆素、山道年、蘆薈苷A，所以選擇使用25%（V/V）甲醇-水作為淋洗液。

2.2.3洗脫劑的選擇

圖4　洗脫溶劑對回收率的影響Fig.4 Effect of elution solvent on recoveries

選用甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、丙酮5種溶劑，分別對3種陰性樣品進行高、低2個水平的加標回收實驗。3類樣品在每種溶劑下做2個平行，測定不同溶劑對加標回收率的影響，結果見圖4。

由圖4可知，用甲醇洗脫時，7種植物毒素的回收率均最高，在86%～105%之間。所以選擇甲醇作為洗脫劑。

2.3氮吹溫度及氮吹程度的確定

分別設定氮吹溫度為30℃、40℃、50℃、60℃和70℃，在3種陰性樣品中添加一定質量濃度的植物毒素標準溶液做回收率實驗，每個樣品做2個平行，考察不同氮吹溫度對回收率的影響，結果見圖5。

圖5　氮吹溫度對7種植物毒素回收率的影響Fig.5 Effect of nitrogen blowing temperature on recoveries of seven phytotoxins

由圖5可知，不同氮吹溫度對原百部堿、香豆素、黃連素、山道年和蘆薈苷的回收率無顯著影響。由于長葉薄荷酮和細辛腦不穩(wěn)定，受光、熱、時間影響較大，易發(fā)生降解[15]，因此不同的氮吹溫度和氮吹時間對長葉薄荷酮及細辛腦的回收率影響很大，低溫氮吹時，所需的氮吹時間相對較長，進而使其最終回收率較低；70℃高溫氮吹時，長葉薄荷酮和細辛腦受熱發(fā)生分解，從而使其回收率較低。經(jīng)系列實驗表明，氮吹溫度為60℃時7種植物毒素的回收率均最高，為79.2%～104%之間。氮吹過程中發(fā)現(xiàn)最終吹干和近干對樣品的回收率有顯著的影響，吹干后長葉薄荷酮與細辛腦損失嚴重，可能由于長葉薄荷酮和細辛腦的溶解性及熱穩(wěn)定差[15]，吹干會造成降解；實驗發(fā)現(xiàn)近干對7種植物毒素的回收率無顯著影響，綜合考慮，最終確定60℃條件下氮吹至近干后采用流動相A∶B=10∶90（V/V）復溶定容。

2.4線性范圍與檢出限

分別對上述系列濃度的混合標準工作溶液進行測定，以7種植物毒素的色譜峰面積（y）對其質量濃度（x）進行線性回歸，得到7種植物毒素在0.20～100.00 mg/L范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)R均＞0.99（見表1）。以3倍信噪比（S/N）計算儀器檢出限（instrument detection limit，IDL），結合前處理濃縮倍數(shù)（10倍）和回收率情況，計算得到7種植物毒素的方法檢出限（methoddetectionlimit，MDL）和方法定量限（method quantitation limit，MLQ），見表1?？梢?，IDL為2.4～65 μg/kg，由于前處理方法中樣品濃縮了10倍，所以MLQ為0.8～21.6 μg/kg。表明本方法靈敏，適用于植物飲料中7種植物毒素的定量分析。

表1　 7種植物毒素的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、方法檢出限和方法定量限Table 1 Linear ranges,regression equations,correlation indexes,detection limits and quantitation limits of 7 phytotoxins

2.5方法回收率與精密度

選取陰性植物飲料，分別添加3個質量濃度水平的植物毒素混合標準溶液，混合均勻后，按照本方法進行前處理和色譜檢測，每個濃度水平平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差；選取中間添加水平，連續(xù)測試5 d，計算日間精密度。結果表明：該方法測定植物飲料中7種植物毒素的回收率為67.1%～104.0%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD，n=6）為1.08%～5.12%，日間精密度為0.4%～4.3%，表明方法的重復性良好，準確度符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》要求。

表2　回收率和精密度測定結果(n=6)Table 2 Determination results of recoveries and precision tests(n=6)

2.6實際樣品的測定

采用本方法對從市場購買的20種植物飲料樣品進行分析，所有樣品均未檢出7種目標化合物。

3　結論

建立了一種同時檢測植物飲料中原百部堿、香豆素、黃連素、山道年、細辛腦、長葉薄荷酮和蘆薈苷A7種植物毒素含量的高效液相色譜分析方法，植物飲料樣品經(jīng)HLB固相萃取柱富集凈化后，用甲醇洗脫，氮吹至近干用流動相定容，以高效液相色譜檢測定量，實際樣品分析表明本方法具有簡單方便、定量準確、靈敏快速的特點，檢測儀器是實驗室廣泛普及的常規(guī)HPLC，滿足歐盟相關規(guī)定限量要求，適用于植物飲料中上述7類化合物的快速確認和準確定量分析。

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Simultaneous detection of seven phytotoxin compounds in plant beverage by HPLC

DU Weifeng1,2,ZHANG Ruirui2,ZHOU Si2,HUANG Jinfeng2,WANG Yonghua1*,HE Minheng2,HUANG Rongrong2
(1.School of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China; 2.Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute,Guangzhou 511400,China)

A new method was developed for the simultaneous detection of seven phytotoxin compounds(protostemonine,coumarin,berberine,santonin,β-asarone,R-(+)-pulegone,aloin A)in plant beverage by HPLC.The samples were purified with HLB solid phase extraction column,eluted by methanol,concentrated by nitrogen blowing,and separated by gradient elution in a Welch Ultimate XB-C18column(4.6 mm×150 mm,5 μm)with methanol-ammonium acetate(10 mmol/L,pH=3)as mobile phase(initial volume 1.0 ml),and then detected by UV detector.Under the optimal conditions,the calibration curves for the seven analytes were linear within the range of 0.20-100.0 mg/L and the correlation coefficients were higher than 0.99.The detection limits and quantitation limits of the method were in the range of 0.2-6.5 μg/kg and 0.8-21.6 μg/kg,respectively.The mean recoveries for three sample matrixes were in the range of 67.1%-104.0%,with the relative standard deviations(n=6)ranged from 1.08%to 5.12%.This method was simple and accurate,which could be applied to the detection of seven phytotoxin compounds in plant beverage.

phytotoxin;palnt beverage;HPLC

O652.63

0254-5071（2016）08-0169-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.038

2016-04-01

國家質檢總局科技計劃項目（2014QK052；2015QK161）

杜偉鋒（1986-），男，工程師，碩士研究生，研究方向為食品及食品相關產(chǎn)品分析技術。

王永華（1973-），女，教授，博士，研究方向為工業(yè)酶與生物脂質及食品安全。