唐雙雙，王韋崗

（鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗中心，江蘇鎮(zhèn)江212132）

GC-MS/MS測定鎮(zhèn)江香醋中的氨基甲酸乙酯

唐雙雙，王韋崗

（鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗中心，江蘇鎮(zhèn)江212132）

鎮(zhèn)江香醋中的氨基甲酸乙酯(EC)通過乙酸乙酯提取，用N-丙基乙二胺(PSA)分散固相萃取的方法凈化，采用氣相色譜-串聯(lián)質譜(GC-MS/MS)法測定。結果表明，氨基甲酸乙酯(EC)的回收率達到96.7%，標準曲線的相關系數(shù)R2為0.999 7，最低檢出限為1 μg/kg。該方法簡單、快速、靈敏，能有效減少雜質干擾。測定二十份不同廠家生產(chǎn)的鎮(zhèn)江香醋，均檢出氨基甲酸乙酯（EC）。表明鎮(zhèn)江香醋在生產(chǎn)發(fā)酵過程中，不可避免的會發(fā)生EC污染，應采取措施進行控制。

鎮(zhèn)江香醋；氨基甲酸乙酯；氣相色譜-串聯(lián)質譜；分散固相萃取

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是發(fā)酵食物和酒精飲品在發(fā)酵和貯存過程中天然產(chǎn)生的污染物，在發(fā)酵食物中廣泛存在[1-2]，被國際癌癥研究機構評定為2A類對人類可能的致癌物[3]，因此其對健康的影響而受到關注。醋是中國人日常生活中常用的調味品，許多人每天都會食用，而鎮(zhèn)江香醋作為我國的四大名醋，我國食醋行業(yè)唯一的原產(chǎn)地保護產(chǎn)品，深受廣大消費者青睞?，F(xiàn)行的國家標準GB 5009.223—2014《食品中氨基甲酸乙酯的測定》[4]和中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T 0285—2012《出口酒中氨基甲酸乙酯殘留量檢測方法氣相色譜-質譜法》[5]EC的檢測主要是針對酒類產(chǎn)品和醬油，還無食醋適用的標準。作為一種重要的釀造食醋，其中不可避免的含有EC，雖然每次通過食醋攝入的含量比較低，不會對健康造成太大影響，但常年累積的總量還可能對健康構成風險，有必要對其中EC含量進行監(jiān)測。

文獻報道食品中EC的檢測通常采用氣相色譜（gas chromatography，GC）[6]、氣相色譜-質譜聯(lián)用（gaschromatography-mass spectrometer，GC-MS）[7-9]法和高效液相色譜-熒光檢測法（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD）[10]。液相色譜法需要進行衍生，而運用GC或GC-MS法進行直接檢測，當遇到復雜基質的時候，干擾比較大，低濃度時的定性確證存在爭議[11]，且檢出限高，目標物與雜質分離度差，造成定量不準確。采用氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜法（gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[12]和超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法（ultra high performance liquid chromatography-electrospray tandem quadrupole mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）[13]法可以解決這類問題。

本研究采用氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜法（GC-MS/ MS）檢測鎮(zhèn)江香醋中的氨基甲酸乙酯，建立一種測定鎮(zhèn)江香醋中EC的方法。通過本研究可以監(jiān)測鎮(zhèn)江香醋中EC的污染情況，幫助企業(yè)了解食品安全風險，指導消費者合理飲食，控制膳食攝入風險。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

氨基甲酸乙酯標準品（純度＞99%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯（色譜純）：美國TEDIA公司；氯化鈉、無水硫酸鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）填料（40～60 μm，60A）：上海安譜科學儀器有限公司；鎮(zhèn)江香醋（符合GB/T 18623—2011《地理標志產(chǎn)品鎮(zhèn)江香醋》[14]標準要求）：來自不同鎮(zhèn)江香醋生產(chǎn)廠家。

1.2儀器與設備

7890B/7000C三重四級桿氣質聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；AL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TDZ5-WS臺式低速自動平衡離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司；HP-5016氮氣吹干儀：上海濟成分析儀器有限公司；WH-2渦旋混合器：南京楚強醫(yī)療器械有限公司；DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）：美國J&W Scientific公司。

1.3方法

1.3.1氨基甲酸乙酯標準曲線的制作

準確稱取0.01 g（精確到0.000 1 g）氨基甲酸乙酯標準品，用甲醇溶解，定容到10 mL，配制成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液；取0.1mL儲備液，用乙酸乙酯定容至100mL，配制成質量濃度為1 000 μg/L的中間液；分別吸取0.01 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.60 mL、3.20 mL中間液，用乙酸乙酯定容至10 mL，配制成質量濃度為1 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、320 μg/L的氨基甲酸乙酯標準系列溶液。

1.3.2樣品前處理

稱取2g鎮(zhèn)江香醋樣品放入離心管中，加入0.3g氯化鈉，5mL乙酸乙酯，在渦旋混合器上混勻1min，然后4000r/min離心5 min，吸取上清液過無水硫酸鈉，下層用5 mL乙酸乙酯重復提取兩次，合并提取液，室溫下用氮氣緩緩吹至約0.5mL（不可以吹干），用乙酸乙酯定容至2mL，加入100mg PSA，漩渦混勻，離心后，取上清液供儀器分析。

1.3.3儀器分析條件

7890B/7000C三重四級桿氣質聯(lián)用儀，進樣口溫度220℃；色譜柱DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm），初始溫度50℃，保持0 min，以10℃/min升至120℃，保持0 min，再以3℃/min升溫至150℃，保持0 min，最后以20℃/min升至230℃，保持3min；進樣量1μL；載氣為高純氦氣（He），流速1 mL/min，不分流進樣；接口溫度250℃，離子源230℃，四級桿Ⅰ150℃，四級桿Ⅱ150℃；猝滅氣（He）和碰撞氣（N2）流速分別2.25 mL/min和1.5 mL/min；多反應監(jiān)測（multi-reaction monitoring，MRM）模式，碰撞能20 eV，監(jiān)測離子對m/z62/44（定量離子對），m/z62/44.9；電離方式：電子電離（electronionization，EI）源，電離能量70eV；溶劑延遲10min。

1.3.4定性定量方法

定性方法：以m/z 62為母離子經(jīng)二次碰撞后得到的碎片離子是m/z 44、m/z 44.9，豐度比為100∶33.5。樣品與標準品在相同保留時間處出峰，且對應碎片離子豐度比與標準品符合（允許±25%偏差），可定性確證為目標分析物。

定量方法：采用外標校準曲線法定量測定。以碎片離子中豐度較高的m/z44為定量離子。進樣系列濃度的標準溶液，以m/z44的豐度為縱坐標，標準溶液質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，樣品中定量離子的豐度與標準曲線比較定量。

2　結果與分析

2.1碰撞能優(yōu)化及標準曲線

運用單四級桿質譜得到EC的特征離子有m/z 44、62、74、89。實際樣品處理后進樣，m/z 44、74存在較大的基體干擾，而m/z 89豐度較低，所以選用豐度大，干擾較小的m/z 62作為母離子，進行碰撞能優(yōu)化實驗。取一定量標準溶液，分別在碰撞能10 eV、20 eV、30 eV、40 eV、50 eV下進樣。結果如表1所示。從表1可以看出，在碰撞能為20 eV的時候，能夠得到最大的豐度，碎片離子分別為m/z 44和44.9，豐度比100∶33.5。豐度大可以提高靈敏度，降低檢出限，所以選用20 eV的碰撞能進行樣品試驗。

表1　碰撞能實驗Table 1 Collision energy experiments

在上述優(yōu)化條件下，將標準系列溶液依次進樣，以氨基甲酸乙酯質量濃度（x）為橫坐標，以定量離子m/z 44豐度（y）為縱坐標，采用外標法繪制氨基甲酸乙酯標準曲線，結果見圖1，氨基甲酸乙酯標準品MRM模式下色譜圖見圖2。由圖1可知，氨基甲酸乙酯（EC）在1～320μg/L的范圍內呈良好的線性關系，其標準曲線回歸方程為y=20.506x+ 19.731，相關系數(shù)為R2=0.999 7。當鎮(zhèn)江香醋樣品的取樣量為2 g時，檢出限可以達到1 μg/kg。

圖1　氨基甲酸乙酯標準曲線Fig.1 Standard curve of ethyl carbamate

圖2　氨基甲酸乙酯標準品MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of ethyl carbamate standard

2.2前處理條件

鎮(zhèn)江香醋樣品基質比較復雜，要測定其中的氨基甲酸乙酯含量需要先對樣品進行凈化處理。多數(shù)文獻采用固相萃取（solid-phase extraction，SPE）柱法進行凈化[7-8，10-12]。近年來也有文獻和行業(yè)標準采用基質分散固相萃取（dis persive solid phase extraction，d-SPE）的凈化方法[5，9]。本實驗分別比較了兩種方法，固相萃取法參照GB 5009.223—2014執(zhí)行。結果發(fā)現(xiàn)，兩種方法都能達到良好的凈化效果，可以有效除去醋中大量的氨基酸、有機酸和色素等成分且回收率相近。但是硅藻土固相萃取法需要使用到正己烷、乙酸乙酯、乙醚等大量有機溶劑進行洗脫，成本較高，操作步驟多。而基質分散固相萃取法簡單、快速、重復性好。所以選用基質分散固相萃取法進行樣品實驗。

2.3回收率試驗

稱取氨基甲酸乙酯標準品，用蒸餾水配制成質量濃度為50 μg/mL的溶液，吸取0.1 mL樣品加入到食醋樣品中，使該樣品的總質量為100.00 g。該樣品中加標質量濃度為50 μg/kg。準確稱取2.00 g樣品，處理后測定，計算回收率。重復6次，得到平均回收率。結果如表2所示。由表2可知，樣品的平均回收率為96.7%，在90%～110%范圍內；相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.37%＜5%，表明該方法準確可靠。

表2　加標回收率試驗結果Table 2 Results of addition standard recovery experiments

2.4樣品的測定

選取20份不同廠家生產(chǎn)的鎮(zhèn)江香醋樣品進行檢測，在上述氣質色譜條件下，得到的陽性樣品色譜圖清晰，與雜質分離度良好，其中樣品12的色譜圖分析結果見圖3。根據(jù)樣品譜圖、對照標準品的出峰時間及碎片離子，以m/z 44定量，m/z 44.9定性，在對應保留時間下，豐度比100∶33.5（±25%）判定為陽性樣品，檢測結果見表3。由表3可知，20份樣品全部含有氨基甲酸乙酯，含量從21.18～73.57 μg/kg。我國目前雖然制定了酒類和醬油中EC檢測的標準，但還沒規(guī)定其限值。國際上多個國家已經(jīng)制定了部分食品中氨基甲酸乙酯的限量標準。如加拿大規(guī)定了各類酒中的限量值，其中佐餐葡萄酒30 μg/L；美國佐餐葡萄酒15 μg/L，餐后甜葡萄酒60 μg/L。聯(lián)合國糧農組織也在2002年規(guī)定飲料中氨基甲酸乙酯的含量不得超過20 μg/L。參照這些國際標準，本次實驗測得鎮(zhèn)江香醋中氨基甲酸乙酯含量都在20 μg/kg以上，表明鎮(zhèn)江香醋中的氨基甲酸乙酯含量較高。

圖3　鎮(zhèn)江香醋樣品中氨基甲酸乙酯MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of ethyl carbamate in Zhenjiang vinegar samples

表3　 20份鎮(zhèn)江香醋樣品氨基甲酸乙酯含量Table 3 Ethyl carbamate content of 20 Zhenjiang vinegar samples

3　結論

本實驗建立了氣相色譜-串聯(lián)質譜（GC-MS/MS）法測定鎮(zhèn)江香醋中氨基甲酸乙酯含量的方法。該方法回收率96.7%，檢出限1 μg/kg，相關系數(shù)R2為0.999 7，表明該方法能滿足鎮(zhèn)江香醋中氨基甲酸乙酯檢測的需要。相比單四級桿氣質聯(lián)用法，該方法可以有效的減少雜質干擾，降低檢出限，增加定量準確性，同時該方法也可以推廣到其他釀造食醋中EC的檢測，可以為標準制定提供依據(jù)。已經(jīng)有研究分析黃酒等酒類中氨基甲酸乙酯的形成機理及控制方法[15-16]，而本研究中20份樣品全部檢出氨基甲酸乙酯，表明氨基甲酸乙酯污染在鎮(zhèn)江香醋中普遍存在，所以下一步應在食醋當中做相應的研究，加強生產(chǎn)過程中的監(jiān)控，規(guī)范和改善工藝條件，使該污染盡可能的維持在較低的水平。我國尚無標準規(guī)定食醋中氨基甲酸乙酯的限量，應盡快制定相應的國家標準，以標準促生產(chǎn)，才能更好地保護人身健康。

[1]吳世嘉，王洪新.發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的研究進展[J].化學與生物工程，2009，26（9）：15-19.

[2]石維妮，劉曉毅，趙玉琪，等.發(fā)酵型食品中的氨基甲酸乙酯含量調研[J].中國釀造，2009，28（11）：124-126.

[3]SAKANO K,OIKAWA S,HIRAKU Y,et al.Metabolism of carcinogenic urethane to nitric oxide is involved in oxidative DNA damage[J]. Free Radical Biol Med,2002,33(5)：703-714.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 5009.223—2014食品中氨基甲酸乙酯的測定[S].北京：中國標準出版社，2014.

[5]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 0285—2012出口酒中氨基甲酸乙酯殘留量檢測方法氣相色譜-質譜法[S].北京：中國標準出版社，2012.

[6]張雪娜，葉長文，鄒更，等.基于基質修飾的多次頂空固相微萃取-氣相色譜法檢測酒精飲料中的氨基甲酸乙酯[J].色譜，2011，29（8）：701-705.

[7]譚文淵，袁東，付大友，等.氣相色譜-質譜聯(lián)用測定白酒中的氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯[J].食品科學，2011，32（16）：305-307.

[8]沈鵬，黃敏欣，白衛(wèi)東，等.客家釀酒中氨基甲酸乙酯回歸分析[J].中國釀造，2013，32（5）：153-156.

[9]陳達煒，苗虹，趙云峰.分散固相萃取/氣相色譜-質譜法測定醬油及食醋中氨基甲酸乙酯[J].分析測定學報，2014，33（1）：108-111.

[10]王霈虹.黃酒生產(chǎn)過程中氨基甲酸乙酯的研究[D].無錫：江南大學，2014.

[11]PARK S K,KIM C T,LEE J W,et al.Analysis of ethyl carbamate in Korean soy sauce using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection or tandem mass spectrometry and gas chromatographywith massspectrometry[J].Food Control,2007,18(8)：975-982.

[12]徐小民，何華麗，阮宇迪，等.氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜法同時測定調味品中的氨基甲酸乙酯和氯丙醇[J].色譜，2013，31（11）：1129-1133.

[13]王麗娟，柯潤輝，王冰，等.超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法直接測定黃酒和葡萄酒中氨基甲酸乙酯[J].色譜，2012，30（9）：903-907.

[14]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 18623—2011地理標志產(chǎn)品鎮(zhèn)江香醋[S].北京：中國標準出版社，2011.

[15]白衛(wèi)東，沈鵬，錢敏.黃酒中氨基甲酸乙酯形成機理及控制方法研究進展[J].中國釀造，2012，31（7）：6-10.

[16]劉俊，趙光鰲，徐巖.黃酒中氨基甲酸乙酯直接減除技術的研究[J].食品與生物技術學報，2012，31（2）：171-176.

Determination of ethyl carbamate in Zhenjiang vinegar by GC-MS/MS

TANG Shuangshuang,WANG Weigang
(Zhenjiang Institute of Supervision and Inspection of Product Quality,Zhenjiang 212132,China)

Ethyl carbamate(EC)in Zhenjiang vinegar was extracted by ethyl acetate,the solution was purified by primary secondary amine dispersion solid-phase extraction method,then was determined by GC-MS/MS.The results showed that the recovery rate of EC was up to 96.7%,correlation coefficientR2of standard curve was 0.999 7,the lowest limit of detection was 1 μg/kg.The method was simple,fast and sensitive,which could effectively reduce the interference of impurities.EC was detected in 20 Zhenjiang vinegar products from different manufacturers,which indicated that EC pollution was unavoidable during the process of Zhenjiang vinegar fermentation,and measures should be taken to control.

Zhenjiang vinegar;ethyl carbamate;GC-MS/MS;dispersive solid phase extraction

TS264

0254-5071（2016）08-0159-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.036

2016-03-30

唐雙雙（1982-），女，工程師，碩士，主要從事食品添加劑及食品中污染物檢測工作。