何小慶， 　尹　珍， 　楊均均， 　李佳俊， 　陳　力， 　黃文祥

·論著·

廣泛耐藥鮑曼不動桿菌ST238克隆株毒力及適應(yīng)性特征

何小慶， 尹珍， 楊均均， 李佳俊， 陳力， 黃文祥

目的 通過檢測廣泛耐藥鮑曼不動桿菌流行克隆ST238的毒力和環(huán)境適應(yīng)性，探討該克隆株在當(dāng)?shù)爻掷m(xù)流行的機制。方法 比較ST238克隆株與鮑曼不動桿菌ATCC 19606的體外生長曲線及競爭指數(shù)（competition index，CI），試管法測定菌株內(nèi)明膠酶活性；微量法進行D -甘露糖抵抗紅細(xì)胞凝集試驗；運動平板法測定蹭行運動能力；結(jié)晶紫染色法定量分析生物膜形成能力。小鼠動物模型檢測體內(nèi)致病力。結(jié)果 ST238克隆株與標(biāo)準(zhǔn)株間體外生長能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。培養(yǎng)24 h時ST238克隆株與鮑曼不動桿菌ATCC 19606在體外競爭能力無明顯差異（CI = 0.29，P＞0.05）。明膠酶活性在ST238克隆株與敏感株間分布無差異（P＞0.05）。血凝結(jié)果與菌株來源之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。敏感株的運動能力及生物膜形成能力均強于ST238克隆株（P＜0.05）。ST238克隆株與標(biāo)準(zhǔn)株的LD50分別為6.9和6.7 log CFU/ mL。接種9.3 log CFU/mL菌液的小鼠平均死亡時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 ST238克隆株獲得廣泛耐藥性后，其環(huán)境適應(yīng)性無明顯下降，同時該克隆株的毒力也無明顯改變。這種生物學(xué)特性可能是該克隆株在當(dāng)?shù)亻L期流行的原因之一。

廣泛耐藥； 鮑曼不動桿菌； ST238克隆株； 適應(yīng)性； 毒力

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2004―2013年細(xì)菌監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，鮑曼不動桿菌在我院的臨床分離率呈逐年上升趨勢。至2009年鮑曼不動桿菌占當(dāng)年細(xì)菌感染的17.9 %，成為不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌第1位致病菌。2010年鮑曼不動桿菌在革蘭陰性菌中比例達(dá)24.6 %，超過大腸埃希菌，成為醫(yī)院感染第1位致病菌。流行病學(xué)研究證實我院存在廣泛耐藥（XDR）鮑曼不動桿菌A、B、C 3個克隆的流行。多位點序列分型（MLST）分析發(fā)現(xiàn)，B克隆與C克隆均為ST238型，而A克隆與其相比僅有一個管家基因（gpi）的差異，也屬于ST238型。ST238克隆株與全球流行的CC92群有較高同源性，但與中國報道的主要克隆株ST22、ST381、ST208和ST92不同。各個國家和地區(qū)均未見有關(guān)ST238克隆株暴發(fā)流行的報道，僅巴西曾在PubMLST注冊過1株ST238克隆株，但沒有相關(guān)文獻。我院流行的ST238克隆株僅對多黏菌素和替加環(huán)素敏感。為了尋找該克隆在我院長期流行的原因，探討其流行性與致病性的相關(guān)性，為進一步控制鮑曼不動桿菌所致的醫(yī)院感染提供指導(dǎo)，本課題擬對我院XDR鮑曼不動桿菌ST238克隆株的毒力及生存適應(yīng)能力進行研究。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源及鑒定 收集2009年1月至2013年12月我院臨床分離的鮑曼不動桿菌，每年隨機抽取60株，共300株，剔除同一患者相同部位的重復(fù)菌株。采用VITEK 2-compact全自動細(xì)菌鑒定儀進行生化鑒定并保存，剔除其中失活及污染的標(biāo)本，分離出277株保存完好的鮑曼不動桿菌。采用瓊脂稀釋法對臨床分離的277株鮑曼不動桿菌進行藥敏試驗，并對篩選出的157株XDR菌株用脈沖場凝膠電泳（PFGE）進行同源性分析，分別成功分離出XDR鮑曼不動桿菌 A、B、C克隆47株、32株、19株。選取分離出的98株僅對多黏菌素和替加環(huán)素敏感的XDR鮑曼不動桿菌ST238克隆株作為實驗菌株，同時隨機選取21株敏感菌株作為毒力對比菌株。質(zhì)控菌株：鮑曼不動桿菌ATCC 19606為俞云松教授饋贈，銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌ATCC 25922為本實驗室保存。

1.1.3實驗動物 小白鼠為體質(zhì)量18～22 g的SPF級雌性昆明系小白鼠，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SYXK（渝）2007—0001，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1體外生長曲線測定[1]調(diào)整菌液濃度至108CFU/mL，取20 μL菌液加入96孔微量板中，接種14個時間點，每一時間點各做3個重復(fù)孔，另外每一時間點均做3孔不加細(xì)菌只含有生理鹽水的空白對照，補入MH肉湯180 μL，使細(xì)菌終濃度為107CFU/mL。將96孔微量板置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。于每一時間點將MTT（5 mg/ mL）20 μL加至待檢測的96孔微量板中，然后每孔加入DMSO 100 μL，震蕩10 min，于570 nm處測定吸光度（D）值。

1.2.2體外競爭試驗[2]調(diào)節(jié)菌液濃度為106CFU/ mL，各取100 μL ST238克隆株、ATCC 19606以及上述兩者的等量混合菌液接種于MH肉湯2 mL中，37 ℃靜置培養(yǎng)。再于2 h、 4 h、8 h、16 h、24 h 5個時間點從各培養(yǎng)液取100 μL，經(jīng)1∶105稀釋，稀釋液分別用含有亞胺培南（8 mg/ L）的固體培養(yǎng)基和空白固體培養(yǎng)基進行細(xì)菌計數(shù)，37 ℃培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。

1.2.3明膠酶活性檢測[3]挑取單個復(fù)活菌落穿刺接種于含120 g/L明膠的LB培養(yǎng)液高層中，37 ℃孵育，每間隔24 h放置于4 ℃冷卻1 h后倒置試管，觀察是否出現(xiàn)液體流動，至15 d為終點。銅綠假單胞菌ATCC 27853為陽性對照，大腸埃希菌ATCC 25922為陰性對照，LB明膠培養(yǎng)基作為空白對照。

1.2.4D -甘露糖抵抗紅細(xì)胞凝集試驗[4]無菌 PBS緩沖液制備新鮮菌懸液（起始濃度為1010CFU/mL）及1 %新鮮人O型、AB型紅細(xì)胞懸液（加入含或不含1 % D -甘露糖各1份）。將菌懸液于96孔U型微量板中系列倍比稀釋為50 μL/孔，然后再分別于每一系列孔中加入含或不含1 %甘露糖的O型或AB型1 %紅細(xì)胞懸液各50 μL，震蕩混勻后置4℃孵育2 h后觀察各孔是否發(fā)生紅細(xì)胞凝集。紅細(xì)胞聚集成小圓點為陰性，紅細(xì)胞遍布整個孔底為陽性。PBS 50 μL加入紅細(xì)胞懸液50 μL作為陰性對照，大腸埃希菌ATCC 25922為陽性對照。

1.2.5蹭行運動能力測定[5]用無菌槍頭挑取單個復(fù)活菌落穿刺接種于厚約3 mm的LB培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿接觸面，37 ℃孵育24 h，觀察生長菌落周圍有無透明菌暈形成，并測量其長徑。以3次獨立試驗菌暈平均直徑＞10 mm者為陽性。銅綠假單胞菌ATCC 27853為陽性對照，鮑曼不動桿菌ATCC 19606為陰性對照。

1.2.6生物被膜形成能力定量分析[3]調(diào)節(jié)菌液濃度為109CFU/mL，取200 μL菌液加入96孔微量板中，200 μL/孔、3孔/株。37 ℃培養(yǎng)36 h，于595 nm處測定D值。PBS 200 μL/孔輕柔清洗3次后晾干，10 %甲醇固定5 min，1 %結(jié)晶紫染色15 min，滅菌蒸餾水沖洗至陰性對照無色。室溫晾干，200 μL無水乙醇溶解結(jié)晶紫30 min，570 nm處讀取D值。D570/D595校正各孔D值以排除菌液濃度差異對結(jié)果的影響。以3個復(fù)孔的校正后D值的平均值作為該株菌的D值，獨立重復(fù)試驗3次。鮑曼不動桿菌ATCC 19606為生物被膜形成陽性對照菌株，含0.25 %葡萄糖的TSB肉湯為陰性對照。生物被膜形成能力判讀標(biāo)準(zhǔn)[6]：測定陰性對照（培養(yǎng)液）D值25次，以其平均D + 3S定義為Dc，將待測菌株D與Dc進行比較分為4類：陰性（-）：D≤Dc；弱陽性（1+）： Dc＜D≤2Dc；陽性（2 +）：2Dc＜D≤4Dc；強陽性（3+）：D＞4Dc。

《兒科阿奇霉素注射使用的快速建議指南》實施方案介紹…………………………………………………… 周鵬翔等（4）：436

1.2.7小鼠腹膜炎模型[2,7-8]復(fù)蘇菌種后增菌，收集細(xì)菌，調(diào)節(jié)菌液濃度為9.3、8.3、7.3、6.3、5.3、4.3 log CFU/mL。將小鼠隨機分為13組，每組10只。按每只0.2 mL進行小鼠腹腔注射，對照組注射等量生理鹽水。接種后每3 h觀察并記錄死亡情況，連續(xù)觀察10 d，繪制存活率曲線，計算LD50。

1.2.8統(tǒng)計方法 采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，計量資料均以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，判斷組間生長能力是否有統(tǒng)計學(xué)意義；Fisher確切概率法，比較ST238克隆株與敏感株明膠酶活性、血凝結(jié)果陽性率、蹭行運動能力是否有分布差異；Mann-Whitney檢驗，判斷ST238克隆株與對照菌株體外競爭能力、生物被膜形成能力及小鼠平均死亡時間是否有統(tǒng)計學(xué)意義；Probit法，計算小鼠LD50。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1體外生長曲線

隨機選取10株ST238克隆株及標(biāo)準(zhǔn)株1株。在測定的14 h內(nèi)，D值隨著培養(yǎng)時間的延長而增大，即細(xì)菌數(shù)隨著培養(yǎng)時間延長而增多，組間生長能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1　鮑曼不動桿菌生長曲線Figure 1 Growth curve of A. baumannii

2.2體外競爭試驗

將ST238克隆株及標(biāo)準(zhǔn)株進行體外競爭試驗。培養(yǎng)24 h時，混合生長菌液中的ST238克隆株與標(biāo)準(zhǔn)株的菌液濃度分別為7.04和7.78 log CFU/ mL，ST238克隆株菌液濃度較標(biāo)準(zhǔn)株低0.74 log CFU/mL，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（CI=0.29，P＞0.05），見圖2。

圖2　鮑曼不動桿菌體外競爭曲線Figure 2 In vitro competitive growth curves of A. baumannii

2.3明膠酶活性

僅有1株來源于傷口滲出液的ST238克隆株在觀察第2天即出現(xiàn)明確明膠液化現(xiàn)象，余菌株均呈陰性表現(xiàn)，明膠酶活性在組間分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。陽性對照菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853于孵育24 h后即表現(xiàn)明顯明膠液化能力。

2.4D- 甘露糖抵抗紅細(xì)胞凝集活性

在無甘露糖存在條件下，O型與AB型人紅細(xì)胞凝集活性相同，ST238克隆組與敏感組的凝集活性分別為2.0 %和9.5 %，組間陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在D -甘露糖存在條件下，人O型和AB型紅細(xì)胞凝集陽性率均升高，ST238克隆組與敏感組分別有15.3 %和19.0 %菌株可使O型紅細(xì)胞發(fā)生凝集，同時有28.6 %和19.0 %菌株可使AB型紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象，血凝結(jié)果與菌株來源之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1　不同組間血凝陽性菌株的分布結(jié)果Table 1 The A. baumannii strains positive in hemagglutination assay between groups

2.5蹭行運動能力

98株臨床分離的ST238克隆株蹭行運動能力均為陰性，而在隨機選取的21株敏感株中蹭行運動陽性率達(dá)33.3 %，提示敏感株的運動能力強于ST238克隆株（P＜0.001）。

2.6生物被膜形成能力

25孔陰性對照平均D+3S為0.112 5+3×0.053 4，故在Dc = 0.273水平對菌株生物被膜形成能力進行分析。敏感組生物被膜形成能力強于ST238克隆組（P＜0.05），生物被膜形成能力及分布見表2及圖3。

表2　不同組間生物被膜形成能力Table 2 Biofi lm formation ability of A. baumannii in different groups

圖3　鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力D值分布Figure 3 Biofi lm formation ability of different A. baumannii strains in terms of D value

2.7LD LD5050結(jié)果

將ST238克隆株及標(biāo)準(zhǔn)株進行動物體內(nèi)實驗。2種菌株經(jīng)腹腔接種均可使小鼠感染致死。ST238克隆株的LD100、LD50和LD0分別為5.0、6.9和9.7 log CFU/mL，而相應(yīng)的鮑曼不動桿菌ATCC 19606則是4.5、6.7和 9.9 log CFU/mL。接種濃度為9.3 log CFU/mL菌液的小鼠，ST238克隆株及鮑曼不動桿菌ATCC 19606小鼠平均死亡時間分別為（35.7±4.8） h和（34.5±4.74） h，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），生存率曲線見圖4。對照組小鼠正常生長，活動自如，無一例死亡。

圖4　小鼠生存率曲線Figure 4 Survival curves of mice after challenging with A. baumannii strains

3　討論

近年來，鮑曼不動桿菌由于迅速發(fā)展的耐藥能力成為世界廣泛關(guān)注的醫(yī)院感染病原菌[9]。既往研究一直認(rèn)為抗菌藥物的選擇壓力及克隆傳播可能是ST238克隆株在我院長期存在的主要原因，但近年來我院加強對抗菌藥物使用的管理，各類抗生素的使用量（尤其是碳青霉烯類）較2009年均有明顯下降，然而我院XDR鮑曼不動桿菌的分離率仍逐年上升，其中以ST238克隆株為主。推測除了抗菌藥物的選擇作用，可能還存在其他因素導(dǎo)致ST238克隆株在我院長期流行。本研究發(fā)現(xiàn)，ST238克隆株與標(biāo)準(zhǔn)株體外生長能力及競爭能力無明顯差異，提示廣泛耐藥性的獲得并未導(dǎo)致ST238克隆株體外生存能力的減弱。僅1株ST238克隆株明膠酶檢測呈陽性，與SECHI等[10]未檢測出陽性菌株的實驗結(jié)果相似，提示XDR鮑曼不動桿菌 ST238克隆株仍是一種低毒力的病原菌。在有無甘露糖存在條件下，ST238克隆株與敏感株的紅細(xì)胞凝集能力均無明顯差異，然而D -甘露糖的存在可使其紅細(xì)胞凝集能力增強，提示鮑曼不動桿菌的菌毛多屬于甘露糖抵抗型，對細(xì)胞的黏附存在甘露糖抵抗現(xiàn)象，這是造成菌株定植的危險因素。蹭行運動由Ⅳ型菌毛介導(dǎo)，是生物被膜形成的一個相關(guān)因素，兩者間有一定關(guān)聯(lián)，本研究中蹭行運動和生物被膜形成能力結(jié)果一致與其相符。既往研究表明，生物被膜作為普遍存在的毒力因子，其形成能力在世界各流行克隆中分布存在差異[11]，其中ST2、ST25、ST78克隆株的形成能力明顯強于其他流行克隆[12]。本研究中ST238克隆株生物膜形成能力弱于敏感株，但其他毒力因子未見明顯下降，尚不能確定ST238克隆株生物被膜能力是固有形成能力較弱還是與其獲得廣泛耐藥性后致弱有關(guān)，需進一步研究證實。ST238克隆組與敏感組的LD50在同一數(shù)量級，且接種9.3 log CFU/mL菌液濃度的小鼠平均死亡時間無明顯差異，提示ST238克隆株與敏感株的體內(nèi)致病性差異不大，間接提示ST238克隆株在獲得廣泛耐藥性后并沒有導(dǎo)致體內(nèi)致病能力的減弱。

既往研究表明，耐藥性的獲得可能導(dǎo)致鮑曼不動桿菌毒力和生存適應(yīng)能力明顯下降[2，7-8]，這可能由于耐藥性的獲得導(dǎo)致DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性下降，基因突變錯配修復(fù)系統(tǒng)的失活以及外排泵在排出抗生素的同時可能也排出毒力相關(guān)因子如黏附素、毒素、定植及侵襲相關(guān)蛋白質(zhì)等。研究還發(fā)現(xiàn)，生存適應(yīng)能力及毒力的下降程度與細(xì)菌獲得耐藥機制的數(shù)量有關(guān)，細(xì)菌獲得的耐藥機制越多，其相應(yīng)的毒力和生存適應(yīng)能力也下降得越多[13]。這種觀點提示耐藥菌的產(chǎn)生可能不會給感染的控制帶來太大的影響，首先耐藥菌由于其毒力和傳播能力的下降并不會引起其比例的上升，其次嚴(yán)格控制抗菌藥物使用后耐藥菌由于失去抗生素選擇優(yōu)勢將會逐漸消失。然而，耐藥性與毒力的關(guān)系仍在研究之中，目前尚沒有一個較為肯定的結(jié)論。在嚴(yán)格控制抗菌藥物使用后ST238克隆株仍能在我院長期流行。本研究發(fā)現(xiàn)，ST238克隆株在獲得廣泛耐藥性后，其環(huán)境生存適應(yīng)能力及毒力并無明顯下降，這種生物學(xué)特性可能與其能在我院長期流行有關(guān)。這種現(xiàn)象與最近的研究報道一致，對多黏菌素耐藥性的獲得并未引起鮑曼不動桿菌適應(yīng)能力和毒力的下降[14]，不同的耐藥機制可能對細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)性和毒力有著不同的影響[15]，因此耐藥性的獲得并不一定都會引起毒力的下降。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，傷寒沙門桿菌在獲得多重耐藥突變后失去使小鼠致病能力，然而失去致病能力的耐藥菌株很快在沒有引起耐藥水平改變的情況下出現(xiàn)補償突變修復(fù)了毒力[16]。值得注意的是，有研究報道認(rèn)為耐藥性的獲得不一定要以減弱生存適應(yīng)能力為代價，相反可能會增強病原菌的適應(yīng)性和毒力，而這可能導(dǎo)致耐藥菌的比例在降低抗菌藥物使用的情況下仍會持續(xù)上升，將給感染的控制帶來極大挑戰(zhàn)[17-18]。本研究已檢測的毒力因子中尚未發(fā)現(xiàn)ST238克隆株毒力有增強。然而，該克隆在我院長期流行的過程中可能也存在不斷的自我進化，出現(xiàn)一些特殊的毒力基因或者我們未檢測到的某些毒力因子毒力增強，這需要進一步研究。

綜上所述，我院存在XDR鮑曼不動桿菌ST238克隆株的流行，耐藥性的獲得并未導(dǎo)致其生存適應(yīng)能力及毒力的明顯下降，這可能是其在我院長期流行的原因之一。同時還不能完全排除其他潛在毒力因子的作用或其他致病機制并存的可能。

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An extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii ST238 isolate without loss of adaptability and virulence

HE Xiaoqing, YIN Zhen, YANG Junjun, LI Jiajun, CHEN Li, HUANG Wenxiang. （Department of Infectious Diseases, the First Affi liated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China）

Objective To study the virulence and environmental adaptability of extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii (XDRAB) ST238 clone, and explore the potential mechanisms of the persistent prevalence of this clone. Methods MTT method was employed to examine the in vitro growth of these strains. The competition index (CI) were determined by in vitro competition experiment to compare with A. baumannii ATCC 19606. The gelatinase activity, D-mannose related O/AB hemagglutination activity, twitching motility, and biofi lm formation were studied to analyze its virulence. The median lethal dose (LD50) was determined for mice in sepsis peritoneal infection model. Results The in vitro growth ( P＞0.05 ) or competition experiment (CI = 0.29, P ＞ 0.05) did not show significant difference between ST238 clone and the reference strain ATCC 19606. The gelatinase (P＞ 0.05) and hemagglutination activity (P＞0.05) did not show signifi cant difference between ST238 clone and the susceptible strain. However, the susceptible reference strain ATCC 19606 did show stronger motility and biofi lm formation ability than ST238 clone (P＜0.05). The LD50of ST238 clone and reference strain ATCC 19606 was 6.9 and 6.7 log CFU/mL, respectively. There was no signifi cant difference in the mean time to death of mice after challenging with 9.3 log CFU/mL (P＞0.05). Conclusions A. baumannii ST238 clone acquired extensively drug-resistant ability but without loss of environmental adaptability and virulence. This biological nature may contribute to its persistent prevalence in our hospital.

extensively drug-resistant; Acinetobacter baumannii; ST238 clone; adaptability; virulence

R378

A

1009-7708 ( 2016 ) 06-0779-06

10.16718/j.1009-7708.2016.06.018

重慶市自然科學(xué)基金項目（CSTC2008BB5393）；重慶市教育委員會科技項目（KJl00311）。

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，重慶 400016。

何小慶（1990—），女，碩士研究生，主要從事細(xì)菌毒力和致病性研究。

黃文祥，E-mail：wenxiang_huang@163.com。

2016-02-17

2016-03-07