劉曉紅

河北邯鄲市中心醫(yī)院新生兒科 邯鄲 056001

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新生兒缺氧缺血性腦病TLRs表達(dá)及分析

劉曉紅

河北邯鄲市中心醫(yī)院新生兒科 邯鄲 056001

目的 分析新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，探索免疫系統(tǒng)在HIE發(fā)病過程中的作用。方法 收集入住我院66例HIE患兒，根據(jù)病情分為輕度、中度和重度3組，選取32例正常新生兒為對(duì)照組，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)IL-2、IL-4、TNF-α、TLR-4、TLR-9的表達(dá)水平。結(jié)果 HIE患兒IL-2、TNF-α、TLR-4、TLR-9表達(dá)增加(P<0.05)，且隨著病情嚴(yán)重程度而明顯增加(P<0.01)；IL-4在重度HIE中表達(dá)顯著減少(P<0.01)。 結(jié)論 新生兒缺氧缺血性腦病免疫應(yīng)答主要以Th1誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答為主；TLRs可作為治療靶點(diǎn)，為HIE的防治提供理論基礎(chǔ)。

新生兒缺氧缺血性腦??；Toll樣受體；細(xì)胞因子；免疫應(yīng)答

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是圍生期由于窒息引起的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，會(huì)導(dǎo)致腦組織缺氧缺血性損傷。新生兒缺氧缺血性腦病臨床癥狀多見新生兒出現(xiàn)意識(shí)障礙、肌張力改變以及驚厥等神經(jīng)精神障礙，嚴(yán)重者發(fā)生腦癱、癲癇等HIE后遺癥，甚至威脅新生兒的生命[1-2]。HIE發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，神經(jīng)系統(tǒng)可通過分泌神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌激素以及自身細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，而免疫系統(tǒng)則通過細(xì)胞免疫應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答和固有免疫應(yīng)答，以及免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子反饋?zhàn)饔糜谏窠?jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)，從而構(gòu)成精密的神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)[3-4]。近年來隨著對(duì)神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)研究的深入，免疫系統(tǒng)功能異常在HIE的發(fā)生中的作用備受關(guān)注。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)家族在機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)中有重要作用，但目前對(duì)其在新生兒HIE中的表達(dá)研究較少。本研究分析HIE患兒血清TLR-4及TLR-9及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，探索免疫系統(tǒng)在HIE發(fā)病過程中的作用，為進(jìn)一步防治新生兒缺氧缺血性腦病提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 研究對(duì)象 選取2013-01—2013-12入住我院兒科新生兒重癥監(jiān)護(hù)室的HIE患兒66例，男36例，女30例；胎齡37～42(38±2)周；出生體質(zhì)量2 200～2 500 g 10例，>2 500～4 000 g 38例，>4 000～4 500 g 18例；日齡1～3 d；母乳喂養(yǎng)11例，配方奶喂養(yǎng)36例，混合喂養(yǎng)19例；自然分娩26例，剖宮產(chǎn)40例；羊水清亮者9例，Ⅰ度糞染19，Ⅱ度糞染21例，Ⅲ度糞染17例。所有患兒符合足月新生兒HIE診斷標(biāo)準(zhǔn)。臨床分度：輕度21例，中度28例，重度17例。所有入選患兒符合2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)新生兒學(xué)組修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除感染性疾病、肝腎功能受損等并發(fā)癥患者。隨機(jī)選擇同期入住我院產(chǎn)科正常新生兒32例為對(duì)照組，男18例，女14例；胎齡37～42(38±2)周；日齡1～3 d。2組性別、胎齡、體質(zhì)量、產(chǎn)式等一般資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。2組新生兒無其他先天性疾病、感染病史、宮內(nèi)發(fā)育遲緩。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象的直系親屬均簽署相關(guān)知情同意書。

1．2 研究方法

1．2．1 標(biāo)本采集與處理：分別于出生1～3 d內(nèi)對(duì)HIE組和對(duì)照組新生兒于08：00采集股靜脈血2 mL，靜置30 min后，在室溫條件下，以2 000 r/min的速度勻速離心 15 min后，留取上清液。對(duì)所取血清編號(hào)后，立即置于-80 ℃冰箱中凍存待用。

1．2．2 檢測(cè)方法：采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)檢測(cè)各細(xì)胞因子和TLRs的表達(dá)水平。IL-2、IL-4、TNF-α、TLR-4、TLR-9 ELISA檢測(cè)試劑盒分別購自R&D System公司。實(shí)驗(yàn)操作步驟按照ELISA試劑盒說明進(jìn)行。主要操作步驟包括：取出96孔板，加50 μL依次稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品于相應(yīng)的反應(yīng)孔中，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。加50 μL待檢樣品于反應(yīng)孔中。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔。洗板5次，即棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。輕輕晃動(dòng)混勻，37 ℃溫育30 min。洗板5次。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。以空白孔調(diào)零，在450 nm波長下應(yīng)用Labsystem Version1.3.1 酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的吸光度值(OD值)。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

2 結(jié)果

2．1 TLR-4、TLR-9檢測(cè) 應(yīng)用ELISA法檢測(cè)Toll樣受體(TLRs)TLR-4和TLR-9在不同程度HIE患兒血清中的表達(dá)。各組HIE患兒TLR-4和TLR-9分別與正常對(duì)照組比較，輕度HIE患兒組TLR-4表達(dá)量有所增加，但與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中度和重度HIE患兒組中TLR-4表達(dá)量明顯增加，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著病情的嚴(yán)重程度增加，TLR-4表達(dá)量增加更加明顯(P<0.01)。TLR-9在不同程度HIE患兒組中表達(dá)量變化與TLR-4相似，即在輕度HIE患兒組中表達(dá)增加，與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但在中度和重度HIE患兒中TLR-4表達(dá)量明顯增加，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同程度HIE患兒血清TLRs表達(dá)變化

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，**P<0.01

2．2 HIE患兒細(xì)胞因子表達(dá)變化 輕度HIE患兒組IL-2表達(dá)量略降低，但與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中度和重度HIE患兒組中IL-2表達(dá)量明顯增加，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著病情的嚴(yán)重程度增加，IL-2增加更加明顯(P<0.01)。IL-4在輕度和中度HIE患兒組中表達(dá)量無明顯變化，與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但在重度HIE患兒的IL-4表達(dá)量明顯降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而TNF-α在不同程度HIE患兒組中的表達(dá)與IL-2表達(dá)類似，區(qū)別于IL-4，各組HIE患兒血清中可檢測(cè)到TNF-α表達(dá)增加，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著病情的嚴(yán)重程度，TNF-α增加更加明顯(P<0.01)。見表2。

表2 不同程度HIE患兒血清細(xì)胞因子表達(dá)變化

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，**P<0.01

3 討論

新生兒由于免疫功能發(fā)育不完善，易受到包括低體質(zhì)量、窒息、早產(chǎn)、宮內(nèi)感染等多種因素影響，因此新生兒期是敏感時(shí)期。如新生兒在圍生期由于母胎血?dú)饨粨Q障礙，導(dǎo)致新生兒血氧濃度降低，易發(fā)生新生兒窒息，進(jìn)而引發(fā)HIE，重者遺留嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[5]。隨著對(duì)新生兒免疫機(jī)制的研究不斷深入，探索HIE免疫因素相關(guān)發(fā)病機(jī)制日益受到重視。

TLRs是一大類能識(shí)別病原體的模式分子，識(shí)別病原微生物高度保守的PAMPs，激活特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，連接機(jī)體固有免疫應(yīng)答與適應(yīng)性免疫應(yīng)答，不僅可以活化固有性免疫應(yīng)答，還可引起細(xì)胞因子釋放，上調(diào)并刺激分子的表達(dá)，而進(jìn)一步刺激并活化獲得性免疫應(yīng)答。在機(jī)體抗感染過程中發(fā)揮極為重要的作用。TLRs分子具有不同的識(shí)別譜，入侵病原體不同，引發(fā)一個(gè)或多個(gè)TLRs家族成員表達(dá)變化，免疫系統(tǒng)借此區(qū)別入侵的病原微生物，產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子，誘導(dǎo)不同免疫應(yīng)答形式清除病原體[6-7]。雖然近年研究中有TLRs在缺血缺氧性腦損傷中的報(bào)道[8-10]，但針對(duì)新生兒HIE的報(bào)道少見。

TLR-4分布廣泛，對(duì)革蘭陽性菌的肽聚糖、磷酸和革蘭陰性菌的鞭毛蛋白具有識(shí)別作用。既往研究證實(shí)，TLR-4在小鼠缺氧缺血性腦病中表達(dá)上調(diào)[9]。本研究得到類似結(jié)果，證實(shí)在不同程度新生兒HIE中相應(yīng)TLR-4表達(dá)增加，雖病情嚴(yán)重程度增加，表達(dá)增加更加明顯。TLR9是近年研究較多的TLRs家族成員，但對(duì)TLR-9在缺氧缺血性腦病中表達(dá)尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究表明，TLR-9在不同程度新生兒HIE中表達(dá)增加，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。我們進(jìn)一步檢測(cè)了TLRs的相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、TNF-α的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組HIE患兒IL-2和 TNF-α表達(dá)增加，而IL-4在輕度和中度HIE患兒組中表達(dá)量無明顯變化，但在重度HIE患兒的IL-4表達(dá)量明顯降低。

Th1/Th2細(xì)胞由Th0細(xì)胞分化而來，Th0細(xì)胞的分化方向受抗原的性質(zhì)(如不同的微生物)、局部環(huán)境及細(xì)胞因子及細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，如細(xì)胞因子IL-12、干擾素，轉(zhuǎn)錄因子STAT1、STAT4、IRF1促使Th0向Th1細(xì)胞分化。細(xì)胞因子IL-4、IL-10，轉(zhuǎn)錄因子STAT6、IRF4和GATA-3促使Th0向Th2細(xì)胞分化。Th1類細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫；Th2類細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-10等，介導(dǎo)體液免疫。Th1和Th2之間相互調(diào)節(jié)，相互制約，處于動(dòng)態(tài)平衡，因此可以維持機(jī)體正常的細(xì)胞免疫和體液免疫。Th1/Th2細(xì)胞平衡的失調(diào)尤其Th1細(xì)胞的數(shù)量增加和功能亢進(jìn)可能加劇了其炎癥的發(fā)生和發(fā)展[11]。Th1和Th2細(xì)胞因子互相抑制彼此表型的分化和功能，即Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生可下調(diào)Th2型免疫應(yīng)答，反之亦然。

本研究發(fā)現(xiàn)，新生兒HIE可引起TLRs表達(dá)增加，IL-2、TNF-α等Th1細(xì)胞因子上調(diào)明顯，占明顯優(yōu)勢(shì)，而TLR9也以誘導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)為主。作為Th2分泌的細(xì)胞因子——IL-4表達(dá)降低。因此，新生兒HIE可能激發(fā)Th1誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答為主，而TLR-4、TLR-9作為靶標(biāo)治療可能緩解新生兒HIE的發(fā)生和發(fā)展。

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(收稿2015-10-05)

R722.1

A

1673-5110(2016)19-0051-03