姚柱煒 蒙劍鋒 欒宏權(quán)

廣東深圳市龍崗區(qū)第五人民醫(yī)院神經(jīng)外科 深圳 518111

?

·論著·

異丙酚對大鼠抑郁模型電休克治療后認(rèn)知功能和海馬Glu濃度及Tau蛋白磷酸化程度的影響

姚柱煒 蒙劍鋒△欒宏權(quán)

廣東深圳市龍崗區(qū)第五人民醫(yī)院神經(jīng)外科 深圳 518111

目的 探討異丙酚對電休克治療后抑郁大鼠認(rèn)知功能及海馬Glu濃度和Tau蛋白磷酸化的影響。方法 選擇雌性SD(Sprague Dawley)大鼠建立大鼠抑郁模型，利用曠場試驗選擇得分30～80分大鼠20只，隨機分為4組(n=5)：A組注射生理鹽水，B組給予異丙酚，C組給予電休克治療，D組給予電休克和異丙酚注射聯(lián)合處理，E組正常小鼠，注射生理鹽水。處理后3 d進(jìn)行Morris水迷宮試驗，記錄逃避潛伏期(s)、經(jīng)過原平臺位置次數(shù)(次)、原平臺所在象限停留時間(s)。隨后檢測海馬Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度。結(jié)果 與A組相比較，C組逃避潛伏期(s)延長、經(jīng)過原平臺位置次數(shù)(次)、原平臺所在象限停留時間(s)減少，海馬Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度增高(P<0.05)；與C組相比，D組逃避潛伏期(s)縮短，經(jīng)過原平臺位置次數(shù)(次)、原平臺所在象限停留時間(s)增加，海馬Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度減低(P<0.05)。結(jié)論 ECT通過增高Glu濃度促進(jìn)Tau蛋白磷酸化，影響抑郁大鼠認(rèn)知功能，而異丙酚可以調(diào)節(jié)ECT引起的Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度，進(jìn)而改善大鼠認(rèn)知功能。

異丙酚；電休克療法；認(rèn)知功能；谷氨酸；Tau蛋白

神經(jīng)外科手術(shù)后導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙仍困擾著廣大臨床醫(yī)生。術(shù)后抑郁癥主要影響患者的海馬結(jié)構(gòu)。對于一些精神障礙患者，電休克療法(electroconvulsive therapy，ECT)是有效的軀體干預(yù)治療方式，但同時也可導(dǎo)致神經(jīng)心理功能障礙等不良反應(yīng)。目前我們已知Tau 蛋白和Glu都是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，對認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)受自身磷酸化程度和突觸間隙劑量影響[1-2]。ECT治療后的患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙機制有多種，其中包括誘導(dǎo)Glu過度釋放，誘導(dǎo)Glu依賴的LTP過程[3]，而N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)拮抗劑則可以避免ECT引起的LTP抑制作用，阻斷Glu大量釋放造成的GluR過度興奮[2，4]。在此我們通過構(gòu)建抑郁后ECT大鼠模型，檢測大鼠海馬Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度，探討異丙酚是否通過影響Glu濃度調(diào)節(jié)Tau蛋白磷酸化程度，并用水迷宮評價是否影響大鼠認(rèn)知功能。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 Harvard嚙齒類動物ECT儀，上海移數(shù)信息科技有限公司的Morris水迷宮(中國)，AstraZeneca公司的異丙酚(意大利)；實驗動物：清潔級(國家標(biāo)準(zhǔn)GB：14925-2001)雌性SD(Sprague Dawley)大鼠，鼠齡24周，體質(zhì)量(275±25)g。

1．2 方法

1．2．1 制作大鼠抑郁模型：將大鼠各自單獨飼養(yǎng)于一籠，用輕度慢性不可刺激構(gòu)建大鼠抑郁模型。以1次/s的頻率在水平方向搖晃鼠籠，共15 min；持續(xù)1 d將鼠籠傾斜45°；用夾子夾鼠尾1 min；1 d內(nèi)不予飲水、進(jìn)食；在45 ℃熱水中、4 ℃冰水中游泳5 min；1 d內(nèi)將大鼠處于白天無光、夜間燈照環(huán)境使其晝夜顛倒；予1 d潮濕墊料，每天給予不同刺激，相鄰兩天不用同種刺激，共28 d。適應(yīng)性培養(yǎng)1周后在20：00點進(jìn)行曠場試驗，大鼠在曠箱內(nèi)四肢全落在1個格子里視為水平活動1次，反映其活動度，為水平計分，兩爪騰空或爬在箱壁上視為豎直活動1次，反映大鼠好奇程度，為豎直計分。2次/周，共1周。2次結(jié)果取平均值，選水平得分和垂直得分的總分30～80分的大鼠20只[5]。

1．2．2 動物分組：利用隨機分組方法將模型動物分成4組，A組予生理鹽水經(jīng)腹腔注射，B組予異丙酚經(jīng)腹腔注射，C組進(jìn)行電休克處理，D組予異丙酚經(jīng)腹腔注射后行電休克治療，E組為正常大鼠作對照并注射生理鹽水。B、D組注射異丙酚80 mg/kg，A、C、E組均予等體積生理鹽水。先行腹腔藥物注射后行ECT，在C、D組大鼠雙耳上夾休克儀電極(正弦波，50 mA，50 Hz)，通電1 s誘使大鼠出現(xiàn)強直-陣攣抽搐發(fā)作，A、B、E組大鼠雙耳夾電極但不通電。各組處理均1次/d，7 d，于15：00～17：00進(jìn)行。

1．2．3 水迷宮試驗：利用Morris水迷宮試驗對大鼠認(rèn)知功能進(jìn)行評價。圓柱形恒溫水池作為水迷宮，將水池分為4個象限，以方向為坐標(biāo)(NE、SE、NW和SW)，NE象限中央水面下1 cm放置平臺。池壁池水均為黑色，水溫24～25 ℃，室內(nèi)避光、安靜，各物品擺放位置固定。定位航行試驗，共6 d，每天在固定時間段行4次試驗。背向池壁將大鼠隨機從各個象限放入水池，2 min內(nèi)記錄大鼠尋到平臺的時間，若2 min后大鼠仍未尋到平臺則引導(dǎo)大鼠至平臺，并記為120 s，此即為水迷宮試驗逃避潛伏期(s)、原平臺所在象限停留時間(s)，同時記錄經(jīng)過原平臺位置次數(shù)(次)。將后3 d結(jié)果取平均值用于大鼠記憶功能的評估。每次實驗完后擦干大鼠并休息3 min，隨后進(jìn)行第2次實驗?？臻g探索實驗第7天撤去平臺，背向池壁從距離平臺最遠(yuǎn)處將大鼠放入水中，1 min內(nèi)記錄大鼠逃避潛伏期(s)、原平臺所在象限停留時間(s)、經(jīng)過原平臺位置次數(shù)(次)。

1．2．4 大鼠海馬取材：水迷宮試驗完成后，經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥使大鼠麻醉，并迅速斷頭取出雙側(cè)海馬組織，右側(cè)海馬組織固定于10%多聚甲醛中，左側(cè)海馬組織先稱質(zhì)量，隨后將1 mL甲醇-水離心液加入，在低溫下攪拌并獲得勻漿，控制溫度在4 ℃時取部分勻漿液以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，離心后分離獲取上清，并行進(jìn)一步過濾后在-80 ℃低溫下保存。以μg·g-1作為單位計算組織中的含量。

1．2．4．1 海馬Glu濃度測定：儀器及試劑：Eppendof公司的centrifuge5810R低溫高速離心機，Waters公司的HPLC色譜系統(tǒng)；Dima公司的C18-ODS色譜柱。流動相A、B分別為0.1 mol/L醋酸鉀及甲醇。采用二元梯度洗脫方法，洗脫步驟為：(T，B%)(0，45%)(1，65%)(6，75%)(20，45%)，其中T代表時間(單位：min)，B%代表B流動相占總洗脫過程百分比。利用孔徑為0.45 μm的微孔過濾膜過濾流動相，隨后用超聲脫氣。流速為1.0 mL/min，所激發(fā)的波長為250 nm，發(fā)射的波長為410 nm，并根據(jù)Glu峰面積進(jìn)行定量估算。制備標(biāo)準(zhǔn)液：標(biāo)準(zhǔn)溶液為100 μmol·L-1，采用Glu標(biāo)準(zhǔn)品制備而成，并在稀釋后測定。制備衍生化試劑：將20 mg OPA加至500 μL甲醇中并在超聲作用下溶解，隨后將500 μL β-巰基乙醇加入，最后再加入pH 10．0的硼酸緩沖液9 mL，避光并密封，保存溫度在0～4 ℃。衍生及分析：將100 μL標(biāo)準(zhǔn)液和100 μL衍生化試劑加至EP管中予2 min反應(yīng)時間，隨后進(jìn)樣20 μL。

1．2．4．2 海馬Tau蛋白磷酸化程度測：通過免疫組化方法測定右側(cè)海馬組織中Tau蛋白磷酸化程度。行脫水透明、浸蠟包埋、切片(4 μm)、二甲苯脫蠟后用抗ptau-Ser202多克隆抗體，抗ptau-Ser396單克隆抗體(1：200)進(jìn)行免疫組化染色，任意選擇3張切片，在每張切片選擇CA1區(qū)、CA2區(qū)的隨機5個視野，用Image-Pro plus 6.0軟件分析陽性細(xì)胞平均吸光度值，去除各區(qū)5個視野中的最大值、最小值，計算剩余數(shù)的平均值，通過均值評價Tau-Ser202、Tau-Ser396磷酸化水平。

2 結(jié)果

2．1 大鼠學(xué)習(xí)記憶功能改變 處理后各組大鼠水迷宮試驗結(jié)果見表1。相較于A組，C、D組逃避潛伏期(s)延長，原平臺所在象限停留時間(s)及經(jīng)過原平臺位置次數(shù)(次)減少(P<0.05)；相較于C組，D組逃避潛伏期(s)縮短，原平臺所在象限停留時間(s)及經(jīng)過原平臺位置次數(shù)(次)增多(P<0.05)。

表1 各組Morris水迷宮試驗結(jié)果

2．2 海馬Glu濃度測定 A組Glu濃度51±11.2，B組為63±9.5，C組為170±21.4，D組為94±17.8，F(xiàn)組為72.6，C、D組海馬內(nèi)Glu濃度較A組高(P<0.05)；而D組海馬內(nèi)Glu濃度又較C組低(P<0.05)。

2．3 海馬Tau蛋白磷酸化程度改變 與A組相比，用ECT處理后的C組Tau蛋白磷酸化(ptau-ser202、ptau-ser396)水平升高(P<0.05)；與C組相比，D組Tau蛋白磷酸化(ptau-ser202、ptau-ser396)水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 海馬Tau蛋白磷酸化程度，平均吸光度值)

3 討論

Tau 蛋白是Weingarlen等[6]于1975年發(fā)現(xiàn)的在微管組裝過程中發(fā)揮重要作用的糖蛋白，同時也是重要的記憶相關(guān)蛋白。目前大量研究表明，Tau蛋白過度磷酸化可導(dǎo)致神經(jīng)元異常放電，使得微管組裝過程受阻，引起微管破壞、神經(jīng)毒性等，亦是阿爾茲海默病的早期事件[7]。Glu作為一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其過度活化能引起胞內(nèi)Ca2+超載，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡[8]，此外，尚能使多種蛋白激酶的活性受抑制，如Akt，而Akt通過一系列信號通路又能參與Tau蛋白磷酸化程度的調(diào)控[9]。ECT治療術(shù)后引起的認(rèn)知功能障礙仍是目前神經(jīng)外科術(shù)后值得關(guān)注的問題，本實驗中C組Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度與A組相比明顯升高，認(rèn)知功能也明顯降低。因此，我們認(rèn)為，ECT等應(yīng)激可引起Glu過度活化，一方面，其興奮性毒性經(jīng)一系列信號過程直接損傷神經(jīng)元；另一方面，通過促進(jìn)Tau蛋白磷酸化也可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，進(jìn)而影響到機體認(rèn)知功能。

Vossel等[10]發(fā)現(xiàn)，過度激活NMDAR可通過活化GSK-3β、酪蛋白激酶2等增加Tau磷酸化程度，從而導(dǎo)致神經(jīng)元受損。而NMDAR拮抗劑可與GluR結(jié)合進(jìn)而減輕Glu與其受體結(jié)合引起的過度興奮性反應(yīng)，有研究表明NMDAR拮抗劑可顯著抑制冷水應(yīng)激引起的磷酸化Tau蛋白水平升高[11-12]。本實驗數(shù)據(jù)表明，與A組大鼠相比，C組海馬出現(xiàn)Glu濃度增高，Tau蛋白磷酸化程度明顯增高(P<0.05)，而與C組相比，D組Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度又有明顯降低(P<0.05)。提示異丙酚作為NMDAR拮抗劑一種，可降低ECT引起的海馬Glu濃度增高，進(jìn)而下調(diào)Tau蛋白磷酸化水平，實現(xiàn)對認(rèn)知功能的改善。但Veaelis等[13]研究表明，異丙酚本身對病人的認(rèn)知功能亦有一定損傷，陳靜等[14]實驗亦發(fā)現(xiàn)異丙酚能夠下調(diào)海馬神經(jīng)元內(nèi)NF-κB活性及增加胞內(nèi)Ca2+濃度，進(jìn)而引起神經(jīng)元損傷。本實驗還發(fā)現(xiàn)，與A組相比，B組認(rèn)知功能并未得到明顯改善，同時Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度也未明顯下降，提示異丙酚本身并不會改善大鼠認(rèn)知功能，這點在黎平等[15]和Dong等[16]實驗中亦有證實。因此，ECT通過增高Glu濃度促進(jìn)Tau蛋白磷酸化，進(jìn)而影響抑郁大鼠認(rèn)知功能，而異丙酚可以調(diào)節(jié)ECT后引起的Glu濃度和Tau蛋白磷酸化程度，進(jìn)而改善大鼠認(rèn)知功能。

本研究選擇輕微慢性不可逆刺激構(gòu)建大鼠抑郁模型，一方面可以避免嗅球切除模型中可能出現(xiàn)的手術(shù)應(yīng)激和其余腦組織損傷；另一方面，耗時長，費時費力。利用曠場試驗評價建模是否成功，Morris水迷宮試驗用于評價大鼠認(rèn)知功能，選擇逃避潛伏期、經(jīng)過原平臺位置次數(shù)、原平臺所在象限停留時間作為評價指標(biāo)，是大鼠模型中常用的試驗。

[1] Kopeikina KJ，Carlson GA，Pitstick R，et al．Tau accumulation causes mitochondrial distribution deficits in neurons in a mouse model of tauopathy and in human Alzheimer's disease brain[J]．Am J Pathol，2011，179(4)：2 071-2 082．

[2] Allyson J，Dontigny E，Auberson Y，et al．Blockade of NR2A-containing NMDA receptors induces Tau phosphorylation in rat hippocampal slices[J]．Neural Plast，2010，2010：340 168．

[3] Andrade C，Singh NM，Thyagarajan S，et al．Possible glutamatergic and lipid signalling mechanisms in ECT-induced retrograde amnesia：experimental evidence for involvement of COX-2，and review of literature[J]．J Psychiatr Res，2008，42(10)：837-850．

[4] De Calignon A，F(xiàn)ox LM，Pitstick R，et al．Caspase activation precedes and leads to tangles[J]．Nature，2010，464(7 292)：1 201-1 204．

[5] 孫世光，王婧婧，李自發(fā)，等．曠場實驗：昆明小鼠行為學(xué)評價方法的重測信度檢驗[J]．中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2010，19(12)：1 093-1 095．

[6] Weingarten MD，Lockwood AH，Hwo SY，et al．A protein factor essential for microtubule assembly[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，1975，72(5)：1 858-1 862．

[7] 陳琛，張中豪，吳秋艷．APP/tau/PS1三轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠行為學(xué)、炎癥反應(yīng)及自噬水平的研究[J]．中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2015，14(2)：119-124．

[8] Liu Z，Li H，Zhang W，et al．Neuregulin-1beta prevents Ca(2+)overloading and apoptosis through PI3K/Akt activation in cultured dorsal root ganglion neurons with excitotoxicity induced by glutamate[J]．Cell Mol Neurobiol，2011，31(8)：1 195-1 201．

[9] Lehtihet M，Webb DL，Honkanen RE，et al．Glutamate inhibits protein phosphatases and promotes insulin exocytosis in pancreatic beta-cells[J]．Biochem Biophys Res Commun，2005，328(2)：601-607．

[10] Vossel KA，Zhang K，Brodbeck J，et al．Tau reduction prevents Abeta-induced defects in axonal transport[J]．Science，2010，330(6 001)：198．

[11] Ying WF，F(xiàn)eng Q，Cheng M，et al．The Activation of Excitatory Amino Acid Receptors Is Involved in tau Phosphorylation Induced by Cold Water Stress[J]．Prog Biochem Biophys，2010，37(5)：510-516．

[12] Petroni D，Tsai J，Mondal D，et al．Attenuation of low dose methylmercury and glutamate induced-cytotoxicity and tau phosphorylation by an N-methyl-D-aspartate antagonist in human neuroblastoma(SHSY5Y)cells[J]．Environ Toxicol，2013，28(12)：700-706．

[13] Veselis RA，Reinsel RA，F(xiàn)eshchenko VA，et al．Information loss over time defines the memory defect of propofol：a comparative response with thiopental and dexmedetomidine[J]．Anesthesiology，2004，101(4)：831-841．

[14] 陳靜，利莉，梁羽冰，等．異丙酚對胎鼠離體海馬神經(jīng)元鈣離子濃度和NF-κB活性的影響[J]．中華麻醉學(xué)雜志，2014，34(3)：286-289．

[15] 黎平，閔蘇，魏珂，等．異丙酚聯(lián)合電休克治療對抑郁大鼠行為學(xué)和學(xué)習(xí)記憶功能的影響[J]．中華麻醉學(xué)雜志，2007，27(10)：940-943．

[16] Dong J，Min S，Wei K，et al．Effects of electroconvulsive therapy and propofol on spatial memory and glutamatergic system in hippocampus of depressed rats[J]．J ECT，2010，26(2)：126-130．

(收稿2015-10-02)

The impact of propofol on cognitive function and Glu concentration and extent of Tau phosphorylation in depressed rats after electroconvulsive therapy

YaoZhuwei，MengJiangfeng，LuanHongquan

DepartmentofNeurosurgery，LonggangDistrictFifthPeople'sHospitalofShenzhen，Shenzhen518000，China

Objective To discuss the impact of propofol on cognitive function，Glu concentration and extent of Tau phosphorylation in depressed rats after electroconvulsive therapy. Methods Female Sprague Dawley (SD) rats were selected to establish depression model and field test was used to select 20 rats，with scores 30 to 80.These SD rats were divided them into four groups randomly (n=5)：A group injected with saline；B group injected with propofol；C group treated with ECT；D group treated with ECT and propofol；E group selected normal rats in contrast and injected with saline. Three days after treatment，Morris water maze test was used to record escape latency(s)，the number of passing by the original platform position，the residence time of the original platform quadrant(s)，then Glu concentration and extent of Tau phosphorylation were also determined by relevant experiments. Results Compared to A group，the escape latency(s) prolonged，the number of passing by the original platform position，the residence time of the original platform quadrant(s) reduced，Glu concentration and extent of Tau phosphorylation in hippocampus raised in C group (P<0.05)；compared to C group，the escape latency(s) reduced，the number of passing by the original platform position，the residence time of the original platform quadrant (s) raised，Glu concentration and extent of Tau phosphorylation in hippocampus reduced in D group (P<0.05). Conclusion ECT can promote Tau phosphorylation through rising Glu concentration，and then influence cognitive function of depressed rats. Propofol can regulate Glu concentration and Tau phosphorylation that aroused by ECT，and then improve cognitive function of depressed rats.

Propofol；Electroconvulsive therapy；Cognitive function；Glu；Tau

深圳市科技計劃(JCYJ20150331095655740)

R-332

A

1673-5110(2016)19-0001-03

△通訊作者：蒙劍鋒，深圳市龍崗區(qū)第五人民醫(yī)院神經(jīng)外科，副主任醫(yī)師，Email：szmengjianfeng@sina.com