薛曉東，代培紅，吾買爾夏提·塔漢，周桂玲

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052 )

?

不同居群大賴草醇溶蛋白分析

薛曉東1，代培紅2，吾買爾夏提·塔漢1，周桂玲1

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052 )

【目的】研究新疆大賴草[Leymusracemosus(Lam.) Tzvel]不同居群種子醇溶蛋白，探討大賴草種質(zhì)在居群間和居群內(nèi)的差異及遺傳多樣性?！痉椒ā坎捎盟嵝跃郾０纺z電泳(A-PAGE)技術(shù)對(duì)采集到的5個(gè)居群間及居群內(nèi)大賴草種子醇溶蛋白進(jìn)行遺傳多樣性研究?！窘Y(jié)果】5份居群間材料共分離出19條帶紋，只有2條是共有帶，多態(tài)率為89.47%。居群內(nèi)共分離出17條譜帶，7條為共同帶，多態(tài)率為58.82%，小于居群間；材料間的Shannon指數(shù)范圍是0.346 7～0.400 0，平均值為0.372 7。Nei-Li遺傳相似系數(shù)(GS)的變異范圍為1.583 7～1.738 5，平均值1.659 4。相似系數(shù)GS值變異范圍是0.429～0.733，平均為0.554。進(jìn)一步聚類分析表明，在GS值為0.62的水平上供試材料可聚成3個(gè)大類，生境相似的居群聚為一類，表現(xiàn)出一定的分布規(guī)律。【結(jié)論】大賴草種子遺傳多樣性在居群間差異明顯，而居群內(nèi)不明顯。醇溶蛋白凝膠電泳可以作為指紋圖譜，用于研究同一物種不同居群間及居群內(nèi)的差異是可行的。

大賴草；不同居群；醇溶蛋白；遺傳多樣性；聚類分析

0 引 言

【研究意義】麥醇溶蛋白是麥類植物種子胚乳中的主要貯藏蛋白，其電泳圖譜常被用作品種、種質(zhì)及品質(zhì)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)[1-3]。醇溶蛋白因極其復(fù)雜的多態(tài)性和不受一般環(huán)境條件影響的遺傳穩(wěn)定性，被稱為品種的生化指紋。大賴草[Leymusracemosus(Lam.) Tzvel]為禾本科小麥族植物。主要分布在新疆準(zhǔn)噶爾盆地古爾班通古特沙漠沿額爾齊斯河兩岸的沙丘上及俄羅斯東南部的一些沙漠中[4-6]。大賴草因其地上、地下生殖構(gòu)件強(qiáng)，所以對(duì)沙丘的固定起著重要的作用。同時(shí)，它穗大、多花、稈強(qiáng)，并且具有抗干旱、寒冷、鹽堿和多種病蟲害等特點(diǎn)，使得國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者在小麥育種及轉(zhuǎn)基因工作中對(duì)大賴草的優(yōu)良種質(zhì)進(jìn)行了大量的應(yīng)用[7-9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，醇溶蛋白電泳分析應(yīng)用廣泛，研究發(fā)現(xiàn)醇溶蛋白在麥類近緣屬植物的種間、種內(nèi)不同來源材料間也存在著明顯差異。采用此方法對(duì)沙生冰草[10]、垂穗披堿草[11]、節(jié)節(jié)麥[12]和大麥[13]等植物的遺傳多樣性及起源與進(jìn)化的研究均有報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】采用醇溶蛋白技術(shù)對(duì)大賴草的遺傳多樣性研究還未見報(bào)道。研究分析新疆大賴草不同居群種子醇溶蛋白，以及其居群間和居群內(nèi)的差異和多樣性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用麥醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)分布于新疆阿勒泰地區(qū)的大賴草進(jìn)行居群間和居群內(nèi)的分析，研究大賴草種質(zhì)在居群間和居群內(nèi)的差異及遺傳多樣性，為大賴草種質(zhì)資源的開發(fā)、利用及保護(hù)提供重要的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用大賴草均分布于新疆阿勒泰地區(qū)額爾齊斯河沿岸的沙丘上，共采集了5個(gè)居群，它們是：福海縣加勒合孜胡德克村(P1)，哈巴河縣185團(tuán)拜鐵祿村(P2)，布爾津縣喀臘幸格勒村(P3)，哈巴河縣阿克多尕拉克村(P4)，阿勒泰市喀拉干德闊拉村(P5)。列出材料的編號(hào)、采集地及生境等。表1

表1 供試材料采集地、編號(hào)和生境Table 1 The distribution region,serial number,habitat

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

從以上5個(gè)居群分別采集20個(gè)相互獨(dú)立(每株間隔最少15 m)成熟飽滿的果穗，然后每個(gè)居群從其中隨機(jī)取5個(gè)果穗上的種子進(jìn)行居群間實(shí)驗(yàn)，每穗隨機(jī)取兩粒種子。居群內(nèi)研究取樣：選擇居群4(面積大，植株多)，取5個(gè)結(jié)實(shí)的果穗，每穗之間間距至少15～20 m，尤其避免采集到克隆植株。將所取種子研碎后，采用ISTA(1986)頒布的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Acid polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱A-PAGE)(pH 3.1)標(biāo)準(zhǔn)程序(稍加改進(jìn))電泳分析醇溶蛋白[1,2,14]。電泳儀器為北京六一儀器廠的DYY-12型電源，電泳槽為DYCZ-24EN。具體方法參照魏秀華等[15]。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

參照小麥醇溶蛋白分別按遷移距離和分子量大小劃分的α、β、γ、ω四個(gè)區(qū)并計(jì)算大賴草醇溶蛋白的相對(duì)遷移率。數(shù)據(jù)處理中對(duì)醇溶蛋白譜帶采用“0-1”數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，有帶記為1，無帶記為0，獲得數(shù)據(jù)距陣。對(duì)不同居群間的數(shù)據(jù)聚類分析利用NTSYS-pc軟件按基于Nei-Li遺傳相似系數(shù)(GS，即Dice系數(shù))的不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法(UPAMA)進(jìn)行。按公式 GSij=2Nij/(Ni+Nj)計(jì)算(其中，Nij為材料i和j共有條帶數(shù)目，Ni、Nj分別為材料i、j的條帶數(shù)目)

1.2.3 計(jì)算

參照車永和等[16]及馬嘯等[11]的方法計(jì)算Shannon-weaver指數(shù)H和Simpson指數(shù)D(即Nei氏基因多樣性指數(shù))來估計(jì)各種質(zhì)及其生態(tài)地理類群間的遺傳多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 居群間醇溶蛋白分析

2.1.1 供試材料醇溶蛋白多態(tài)性

5個(gè)居群的種子醇溶蛋白分別用大麥和小麥兩種提取劑[17]進(jìn)行提取。多次試驗(yàn)表明，大麥提取液能更充分地提取出大賴草種子醇溶蛋白。因此，利用該提取液實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，5個(gè)居群的醇溶蛋白共分離出19條帶紋，每份材料可分離出6～15條帶紋。按遷移率由大到小可分為α、β、γ、ω共4個(gè)區(qū)，帶紋集中分布于ω區(qū)(6條)，β區(qū)也較多(5條)，α、γ區(qū)較少(各4條)。19條帶紋中，僅2條是所有材料共有的，其中β和ω區(qū)各有1條，其多態(tài)率為89.47%，而α、γ區(qū)沒有一條帶紋是所有居群共有的，其多態(tài)率均為100%。4個(gè)區(qū)的平均帶紋多態(tài)率為90.83%，平均Shannon指數(shù)為0.372 7，平均Simpson指數(shù)為1.659 4 。各電泳分區(qū)的Shannon指數(shù)H和Simpson指數(shù)D所揭示的遺傳多樣性的變化趨勢(shì)基本一致。圖1，表3

P：表示用大麥提取液，p：表示用小麥提取液

Note：P: extracting alcohol soluble protein with barley extract，p: extracting alcohol soluble protein with wheat extract

圖1 5個(gè)居群大賴草材料的醇溶蛋白電泳圖譜

Fig.1 Gliadin patterns of 5Leymusracemosus(Lam.) Tzvel populations A-PAGE

2.1.2 相似系數(shù)

對(duì)醇溶蛋白電泳結(jié)果采用Nei-Li相似系數(shù)(GS)的計(jì)算方法，得到供試材料相似系數(shù)矩陣。5個(gè)居群大賴草的種質(zhì)GS值變異范圍為0.429～0.733，平均 0.554，變幅為0.304，由相似系數(shù)矩陣可以看出，P1與P5之間遺傳相似系數(shù)最小，其遺傳距離最大，表明它們相互地區(qū)間材料的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。而P2與P4的兩份種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)最大，其遺傳距離小，表明這兩份材料親緣關(guān)系最近。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，5個(gè)居群之間差異明顯，具有較為豐富的醇溶蛋白遺傳多樣性。表4

表2 5個(gè)居群大賴草材料的電泳酶帶數(shù)及分布Table 2 Distribution and number of gliadin bands of 5 Leymus racemosus (Lam.)Tzvel populations

注:“—”代表酶帶存在位置

Note: “—”Indicates the position of the band

表3 5個(gè)居群大賴草的醇溶蛋白多態(tài)性Table 3 The gliadin genetic polymorphism of 5 Leymus racemosus (Lam.) Tzvel populations

注:*：α、β、γ、ω 4個(gè)區(qū)H值和D值的平均數(shù)

Note:*：Means the average numbers of Shannon index(H)and Simpson index(D) for four electrophoretic zones

表4 大賴草5個(gè)居群間遺傳相似系數(shù)Table 4 Genetic similarity coefficients of 5 Leymus racemosus (Lam.) Tzvel populations

對(duì)5個(gè)居群大賴草醇溶蛋白遺傳相似系數(shù)按UPGMA法進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，當(dāng)GS=0.62水平時(shí)，5個(gè)居群可以劃分為3大類，P2與P4聚為一類；P1、P3聚為第二類；P5單獨(dú)為一類。結(jié)合5個(gè)居群生境可以看出，根據(jù)供試材料的遺傳相似系數(shù)得出的聚類分析結(jié)果與其地理來源有一定相關(guān)性，具有相同地理來源的材料趨向于聚在一起。圖2

圖2 5個(gè)居群大賴草醇溶蛋白數(shù)據(jù)聚類Fig.2 Dendrogram of 5 Leymus racemosus (Lam.) Tzvel populations gliadin data using Nei-Li，s genetic similarity coefficients

2.2 居群內(nèi)醇溶蛋白

實(shí)驗(yàn)選用大麥提取液進(jìn)行操作。以居群P4為研究對(duì)象，進(jìn)行了居群內(nèi)醇溶蛋白電泳分析，結(jié)果共得到17條譜帶，可以看到，z1 所得到的條帶最為清晰，共15條。圖3

圖3 大賴草居群內(nèi)醇溶蛋白電泳圖譜Fig.3 Gliadin patterns of Leymus racemosus(Lam.) Tzvel within population A-PAGE

另外，z2、z3及z5上部有1～2條弱帶，其余材料沒有，除此之外，各材料間強(qiáng)帶幾乎完全相同，共有的條帶為7條，多態(tài)率為58.82%。

3 討 論

報(bào)道顯示，醇溶蛋白具有高度異質(zhì)性和復(fù)雜性，使用其研究方法對(duì)于評(píng)價(jià)不同物種間以及同種不同居群間的遺傳多樣性具有一定的可行性[18-19]。

3.1 居群間

研究通過電泳分離出6～15條遷移率不同的醇溶蛋白帶紋，只有2條是共同帶，多態(tài)率為89.47%，多態(tài)性比較高。不同居群間的材料醇溶蛋白帶型表現(xiàn)出較大的相似性，α和γ區(qū)的帶紋較少，且沒有一條帶紋是所有材料共有的，β、ω區(qū)帶紋多態(tài)性最大，分別各有一條共有條帶，與馬嘯[11]對(duì)垂穗披堿草的分析類似。由相似系數(shù)矩陣可以看出，P1與P5之間遺傳距離最大，說明它們之間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。P2與P4之間遺傳距離小，表明它們之間的親緣關(guān)系最近。但是從實(shí)際距離上看，P1與P5之間相隔40 km左右，而P2與P4之間相隔有60多km之多，那么P2、P4兩個(gè)居群的遺傳距離大于P1與P5間的遺傳距離，可以解釋為環(huán)境是造成其差異的主要因素。P1與P5居群間雖然距離較近，但中間相隔了2個(gè)縣級(jí)城市與一個(gè)烏倫古湖，使其成為一個(gè)屏障，阻隔了兩地的基因流動(dòng)；而P2與P4雖然距離較遠(yuǎn)，但二者之間是連綿的沙漠和部分農(nóng)田?；蚪涣魍〞?、生境相同。

嚴(yán)學(xué)兵等[20]通過分子技術(shù)研究披堿草屬植物遺傳分化和親緣關(guān)系的地理因素分析時(shí)得出總遺傳變異的8.9%與地理距離有關(guān)，14%是由生境造成的，肯定了生境條件對(duì)披堿草屬植物遺傳變異的影響。馬嘯等[11]對(duì)野生垂穗披堿草種質(zhì)的醇溶蛋白遺傳多樣性分析表明，醇溶蛋白圖譜類型與材料的生態(tài)地理環(huán)境具有一定的相關(guān)性。

3.2 居群內(nèi)

通過大賴草居群內(nèi)凝膠電泳得到的電泳圖與前人[21]的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比可以看出其研究結(jié)果相似，即大賴草居群內(nèi)各試驗(yàn)材料種子蛋白電泳所獲得的條帶數(shù)量和位置上都比較一致，尤其是強(qiáng)帶幾乎完全相同，個(gè)別材料的差異僅表現(xiàn)在弱帶上，與魏秀華等[15]對(duì)鵝觀草屬居群內(nèi)的分析類似。但因凝膠的速度及濃度稍微不均導(dǎo)致各試驗(yàn)材料所得條帶并不是一一對(duì)應(yīng)，即遷移率大小一樣的蛋白，各試驗(yàn)材料橫向帶紋在圖譜上的位置并不是顯示在同一個(gè)水平上，但這并不影響分析，資料記載[21]也有類似的情況。唐慧慧等[13]對(duì)“中國(guó)野生大麥醇溶蛋白遺傳多態(tài)性研究”也發(fā)現(xiàn)，地理環(huán)境相似地區(qū)的材料有著相似的醇溶蛋白圖譜類型?？梢钥闯鐾痪尤簝?nèi)種子醇溶蛋白的差異不是很大。

3.3 居群間與居群內(nèi)對(duì)比

嚴(yán)學(xué)兵等[22]采用等位酶分析法研究了老芒麥等9個(gè)披堿草屬物種40個(gè)居群的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)物種居群內(nèi)的遺傳多樣性遠(yuǎn)低于居群間，屬級(jí)水平上的遺傳多樣性主要存在于種間和種內(nèi)居群間，而且各居群的遺傳距離與海拔和經(jīng)緯度相關(guān)性顯著。研究也發(fā)現(xiàn)，大賴草的居群間條帶多態(tài)性(89.47%)大于居群內(nèi)(58.82%)，說明了居群內(nèi)的遺傳多樣性低于居群間，環(huán)境上的差異是不同居群間遺傳多樣性產(chǎn)生的主要原因。Nevo[23]分別觀察了在大、小地理尺度下自然居群的蛋白質(zhì)變異，發(fā)現(xiàn)在大尺度地理?xiàng)l件下，由于生境不同阻礙了基因漂移，從而造成較大的遺傳差異。

4 結(jié) 論

研究對(duì)大賴草5個(gè)居群間和居群內(nèi)進(jìn)行醇溶蛋白電泳圖譜分析，結(jié)果顯示5個(gè)居群之間條帶差異明顯，居群內(nèi)不明顯，說明醇溶蛋白凝膠電泳可以作為指紋圖譜，用于研究同一物種不同居群間及居群內(nèi)的差異是可行的，同時(shí)也表明，大賴草居群間及居群內(nèi)都發(fā)生了遺傳變異，居群間大于居群內(nèi)。

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Fund project:Supported by National Natural Science Foundation of China(31160134)

Study on Gliadin of Leymus racemosus (Lam.)Tzvel of Different Populations

XUE Xiao-dong1, DAI Pei-hong2, Wumaierxiati Tahan1, ZHOU Gui-ling1

(1. College of Pratacultural and Environmental Sciences,2.CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

【Objective】 In order to investigate the differences and genetic diversity ofLeymusracemosusgermplasm among and within the populations，the project aims to study the seed gliadin of XinjiangLeymusracemosusbetween different populations.【Method】The genetic diversity of 5Leymusracemosuspopulations' seed gliadin were analyzed by using acid polyacrylamide gel electrophoresis(A-PAGE).【Result】(1)19 gliadin bands were separated by electrophoresis between 5 populations of them, 17 bands had polymorphisms and the polymorphic rate was 89.47%. 17 bands were isolated from populations, 10 bands had polymorphisms and the polymorphic rate was 58.82%, the polymorphism rate within populations were less than among the populations.(2)The variation's range of Shannon index between materials was 0.346,7-0.400,0, average value was 0.372,7. The variation's range of Nei-Li genetic similarity coefficient (GS) was 1.583,7-1.738,5, average value of 1.659,4.The variation's range of genetic similarity coefficient (GS) was 0.429-0.733，average value of 0.554. Further clustering analysis showed that the test materials could be clustered into 3 categories when the GS value was 0.62, and habitat similar populations could be clustered together, which also showed that it was a certain distribution between different populations.【Conclusion】The electrophoresis of the seed gliadin showed that the genetic diversity among populations was significantly different and not obvious within populations. It was explained that the electrophoresis of seed gliadin could be used as a fingerprint, and was feasible when it was used to study the differences between and within populations.

Leymusracemosus(Lam.) Tzvel; different populations; gliadin; genetic diversity; cluster analysis

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.08.019

2016-03-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160134)

薛曉東(1983-)，男，山西大同人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参镔Y源學(xué)，(E-mail)414273009@qq.com

周桂玲(1957-)，女，新疆烏魯木齊人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参飳W(xué)，(E-mail)1820944856@qq.com

S184

A

1001-4330(2016)08-1500-07