吳建勇，吳星星，楊學(xué)云，李建軍，王登峰，金映紅，王光雷，王治才

(1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830011；2.烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心，烏魯木齊 830063)

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綿羊副結(jié)核病的病原學(xué)檢測與分析

吳建勇1，吳星星2，楊學(xué)云1，李建軍1，王登峰1，金映紅1，王光雷1，王治才1

(1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830011；2.烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心，烏魯木齊 830063)

【目的】確診一例疑似綿羊副結(jié)核分枝桿菌感染的病原學(xué)特征?！痉椒ā繉⑺蜋z病料(腸系膜淋巴結(jié))涂片、抗酸染色后進(jìn)行顯微鏡觀察；同時(shí)，提取腸系膜淋巴結(jié)組織DNA，采用PCR擴(kuò)增副結(jié)核分支桿菌的IS900基因及亞型分型基因，并進(jìn)行序列測定與分析?！窘Y(jié)果】組織涂片染色鏡檢后可見抗酸染色陽性菌株；IS900基因及亞型分型基因的檢測和序列分析結(jié)果表明，目標(biāo)菌株為Ⅱ型(牛型)副結(jié)核分支桿菌?！窘Y(jié)論】采用鏡檢及分子檢測等手段確定從所送檢綿羊腸系膜淋巴結(jié)組織為Ⅱ型(牛型)副結(jié)核分支桿菌感染樣本。

副結(jié)核分支桿菌；綿羊；病原檢測；序列分析

0 引 言

【研究意義】副結(jié)核病(Paratuberculosis)又稱為約內(nèi)氏病(Johne's disease)，是一種由副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis)引起牛羊等多種動(dòng)物以頑固性腹瀉、漸進(jìn)性消瘦、腸黏膜增厚為特征的慢性消耗性傳染病，其慢性或隱性感染常常給家畜養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。其中，羊副結(jié)核病在澳大利亞、新西蘭、南非、智利、加拿大、西班牙、希臘、挪威、法國、土耳其等國均有文獻(xiàn)報(bào)道；與牛副結(jié)核臨床癥狀不同的是，羊副結(jié)核大多呈隱性感染，其臨床多表現(xiàn)為漸進(jìn)性消瘦、不耐運(yùn)動(dòng)并帶有軟性糞便，極易被誤診或忽視[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】副結(jié)核分支桿菌作為一種胞內(nèi)寄生的抗酸染色陽性菌，主要通過消化道感染易感動(dòng)物，且以幼畜最為易感。羊只自然感染到出現(xiàn)臨床癥狀通常需要12個(gè)月以上潛伏期[4]。通過胞內(nèi)寄生，該菌可以損傷宿主免疫系統(tǒng)，使得宿主對其它病原的易感性增高，從而導(dǎo)致機(jī)體進(jìn)一步消瘦與虛弱[4]。在細(xì)菌學(xué)分類上，一般將該菌分為3個(gè)亞型：Ⅰ型(羊型)、Ⅱ型(牛型)以及Ⅲ型(生物中間型)，不同亞型培養(yǎng)特征不盡相同[5]。其中，牛型菌株的易感動(dòng)物較多，毒力也較強(qiáng)，體外培養(yǎng)時(shí)間一般為8～12周，培養(yǎng)物為乳白色菌落；而羊型菌株對羊以外的其他宿主致病性較弱，培養(yǎng)物的菌落呈黃色，體外培養(yǎng)時(shí)間需要半年以上，培養(yǎng)難度較大，很難分離獲得該菌?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過腸系膜淋巴結(jié)組織涂片及抗酸染色、分子鑒定和亞型分析，可以確定感染副結(jié)核分支桿菌的亞型，這對該菌的分離培養(yǎng)極為重要[6-7]。【擬解決的關(guān)鍵問題】對送檢的疑似副結(jié)核感染羊腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)行涂片、染色、鏡檢、分子鑒定及序列分析，以確定其病原學(xué)特征，為該病的診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

副結(jié)核分支桿菌參考株(ATCC BAA-968)購自美國菌種保藏中心，復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)按推薦方法進(jìn)行，提取其基因組DNA作為此次試驗(yàn)的陽性對照。

1.1.2 試 劑

QIAamp DNA mini Kit購自QIAGEN公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等購自天根生化科技(北京)有限公司；2×GoTaqgreen master mix、pGEM-T easy Vector購自Promega公司；100 bp DNA Ladder、IPTG、X-Gal購自生工生物工程(上海)有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引 物

副結(jié)核分枝桿菌IS900分子鑒定引物(Primer90、Primer91)[8]、亞型分析引物(DMC529、DMC531、DMC533)[9]，以上引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。表1

表1 所用引物Table 1 Primers of this article

1.1.4 樣品來源

2015年7月，病羊來自新疆某一養(yǎng)羊戶。病羊年齡為4～5歲，表現(xiàn)為體況消瘦及腹瀉癥狀；剖檢后可見腸系膜淋巴結(jié)腫大，初步判斷為疑似副結(jié)核分支桿菌感染。采集綿羊腸系膜淋巴結(jié)作為試驗(yàn)研究的目標(biāo)樣品。

1.2 方 法

1.2.1 病料的抗酸染色

將腸系膜淋巴結(jié)涂片、固定，參考《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南》推薦的抗酸染色法染色，鏡檢，并采用副結(jié)核分支桿菌參考菌株作為對照，判斷送檢樣本是否存在抗酸染色陽性菌株。

1.2.2 腸系膜淋巴結(jié)組織樣品DNA的提取

取約100 mg淋巴結(jié)組織，加入液氮研磨后分裝成一式三份，采用QIAamp DNA mini Kit提取組織基因組DNA，具體操作按試劑盒說明書介紹的方法進(jìn)行。

1.2.3 副結(jié)核分支桿菌IS900基因的分子檢測

以Primer90、Primer91為引物對IS900基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 3 min；30個(gè)循環(huán)后72℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后克隆至pGEM-T easy載體中，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選后，在每平板上挑選3～5個(gè)陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測定、比對與分析。

1.2.4 副結(jié)核分支桿菌的亞型鑒定

以DMC529、DMC531、DMC533為引物對副結(jié)核分支桿菌的亞型進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s；30個(gè)循環(huán)后72℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后連接pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選后，每平板上挑選3～5個(gè)陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測定、比對與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌的染色鏡檢結(jié)果

通過對送檢的綿羊腸系膜淋巴結(jié)組織樣本進(jìn)行涂片、抗酸染色及顯微鏡檢查后可見腸系膜淋巴結(jié)組織染色背景為藍(lán)色，其間有紅色、不規(guī)則的細(xì)短桿菌(圖1 A)，與副結(jié)核分枝桿菌參考菌株抗酸染色特征及形態(tài)相似(圖1 B)，判斷為抗酸染色陽性菌。圖1

注：A：綿羊腸系膜淋巴結(jié)組織涂片抗酸染色結(jié)果圖；B：副結(jié)核分枝桿菌參考菌株(ATCC BAA-968)抗酸染色結(jié)果

Note: A: Acid-fast Staining results of smear of sheep mesenteric lymph node; B: Acid-fast Staining results ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisreference strain (ATCC BAA-968)

圖1 抗酸染色、顯微鏡觀察結(jié)果

Fig.1 Results of microscopic examination after acid-fast staining

2.2 腸系膜淋巴結(jié)組織提取DNA中副結(jié)核分支桿菌基因片段檢測

將提取腸系膜淋巴結(jié)組織基因組DNA編號(hào)為MAPxj-5(sheep)，采用副結(jié)核分支桿菌特異性引物進(jìn)行副結(jié)核分支桿菌特異性基因IS900的擴(kuò)增，結(jié)果顯示，從目標(biāo)樣本中擴(kuò)增得到400 bp左右的目的片段，與預(yù)期大小一致。圖2

注：M：Marker 100 DNA ladder marekr；1～2：副結(jié)核分枝桿菌參考菌株ATCC BAA-968 DNA；3～5：疑似病例腸系膜里巴結(jié)組織DNA；6：空白對照

Note: M: Marker 100 DNA ladder marekr; 1-2: Amplificated result of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis reference strain (ATCC BAA-968); 3-5: Amplificated result ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisfrom sheep mesenteric lymph node; 6: Blank control

圖2 病羊綿羊腸系膜淋巴結(jié)DNA中副結(jié)核分支桿菌的PCR檢測結(jié)果

Fig.2 Detection results ofMycobacteriumparatuberculosisfrom sheep mesenteric lymph node by PCR

將所擴(kuò)增的目的基因IS900連接T載體并進(jìn)行序列測定與分析，結(jié)果表明其序列長度為400 bp。Blast搜索結(jié)果顯示，該序列與GenBank中的CP005928.1、AF416985.1、AF305073.1、AE016958.1、S74401.1、AJ250015.1、AF250016.1、X16293.1、FJ775181.1等序列同源性在99.0%以上；用Clustal W方法分析，同源性均在99.2%以上，進(jìn)一步表明所擴(kuò)增的樣品種含有副結(jié)核分枝桿菌。圖3

圖3 病料淋巴結(jié)副結(jié)核分枝桿菌IS900基因序列的相似性和遺傳偏離Fig.3 Identity and divergence of IS900 gene inMycobacterium avium subsp. paratuberculosis strains

2.3 腸系膜淋巴結(jié)組織DNA中副結(jié)核分支桿菌的亞型鑒定及序列比對

進(jìn)一步采用DMC529、DMC531、DMC533引物對所提取的組織基因組DNA進(jìn)行副結(jié)核分支桿菌基因Ⅰ/Ⅲ和Ⅱ型特異性基因擴(kuò)增。結(jié)果顯示，從目標(biāo)樣品中成功擴(kuò)增出310 bp的目的片段，該片段與Ⅱ型菌株亞型分型基因片段的預(yù)期大小一致。圖4

注：M：Marker 100 DNA ladder marekr；1～2：副結(jié)核分枝桿菌參考菌株(ATCC BAA-968)擴(kuò)增結(jié)果；3～5：疑似副結(jié)核分枝桿菌腸系膜里巴結(jié)組織DNA擴(kuò)增結(jié)果；6：空白對照

Note: M: Marker 100 DNA ladder marekr; 1-2: Amplificated result ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisreference strain (ATCC BAA-968); 3-5: Amplificated result of MMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisfrom sheep mesenteric lymph node; 6: Blank control

圖4 綿羊腸系膜淋巴結(jié)樣品副結(jié)核分支桿菌亞型鑒定結(jié)果

Fig.4 Subtype identification results ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisfrom sheep mesenteric lymph node

對亞型基因片段進(jìn)行克隆及基因序列測定，結(jié)果表明其序列長度為310 bp；參考Collins等人[9]公布的Ⅰ型、Ⅱ型序列進(jìn)行比對分析，可見試驗(yàn)所擴(kuò)增的基因與Ⅱ型基因序列相似性為100%，從而確定檢測樣品中的目標(biāo)菌株為II型副結(jié)核分枝桿菌。圖5

注：Ⅰ：Ⅰ型(羊型)副結(jié)核分支桿菌序列；Ⅱ：Ⅱ型(牛型)副結(jié)核分支桿菌序列；MAPxj-5

Note: Ⅰ:Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosistype Ⅰgene sequence; Ⅱ:Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosistype Ⅱ gene sequence

圖5 副結(jié)核分支桿菌不同亞型DMC基因序列比對結(jié)果

Fig.5 Sequence Alignment of different subtype DMC gene fromMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis

3 討 論

副結(jié)核病是一種重要的人畜共患病，我國農(nóng)業(yè)部將其列為二類動(dòng)物疫病病種名錄。該病慢性、隱性感染給全球養(yǎng)羊業(yè)帶來了一定的經(jīng)濟(jì)損失，也給人帶來潛在的健康威脅。目前，國外已有商品化的副結(jié)核分支桿菌抗體檢測試劑盒用于牛副結(jié)核病的檢測；但綿羊副結(jié)核病ELISA抗體檢測方法經(jīng)過20多年的研究，仍未解決敏感性與特異性問題，還未能應(yīng)用于臨床診斷與檢測。對于羊副結(jié)核分枝桿菌感染多采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)或分子生物學(xué)檢測等技術(shù)手段進(jìn)行診斷。由于羊感染副結(jié)核分枝桿菌后潛伏期長、臨床癥狀不明顯，僅僅依靠細(xì)菌分離培養(yǎng)進(jìn)行診斷往往不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和隔離病畜，加大了該病在羊群中傳播和進(jìn)一步擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。

上世紀(jì)90年代，我國張恒軒[10]、馬勛等[11]從臨床特征、剖檢、涂片鏡檢等方面判斷新疆的馬鹿以及小尾寒羊可能存在副結(jié)核??；近年來，國內(nèi)多個(gè)單位的研究人員也開展了于奶牛[12]、牦牛[13]、梅花鹿[14]等牲畜副結(jié)核分支桿菌抗體檢測的研究，確定了我國存在副結(jié)核病抗體陽性動(dòng)物，但對于患畜病原的分子檢測和亞型分析鮮有報(bào)道。研究以美國菌種保藏中心引進(jìn)的參考菌株為標(biāo)準(zhǔn)，提取疑似副結(jié)核分枝桿菌感染組織DNA，用PCR擴(kuò)增、序列測定與分析方法，對疑似病例中的病原進(jìn)行了種及亞型水平鑒定，確定了所檢病例屬于II型(牛型)副結(jié)核分枝桿菌感染。該結(jié)果與美國Collins等[15]報(bào)道的非接觸牛、鹿的綿羊以Ⅰ型副結(jié)核分支桿菌感染為主的報(bào)道不同[15]。試驗(yàn)從顯微鏡檢查、分子鑒定等進(jìn)一步證明了新疆綿羊種存在II型(牛型)副結(jié)核分枝桿菌感染，而開展羊源副結(jié)核分支桿菌的分離培養(yǎng)及其追蹤溯源是下一步亟待開展的工作。

4 結(jié) 論

研究通過綿羊腸系膜淋巴結(jié)組織涂片、抗酸染色、顯微鏡觀察、副結(jié)核分枝桿菌特異性基因的分子檢測及亞型分型鑒定等手段，確定了送檢病料為II型(牛型)副結(jié)核分枝桿菌感染樣本，從病原學(xué)角度進(jìn)一步驗(yàn)證了新疆羊群中存在副結(jié)核分枝桿菌感染。研究為綿羊副結(jié)核分枝桿菌感染的病原學(xué)分子檢測提供了技術(shù)手段，也為下一步開展副結(jié)核分枝桿菌的分離鑒定及其追蹤溯源提供了基礎(chǔ)。

References)

[1]Fiorentino, M. A., Gioffré, A., Cirone, K., Morsella, C., Alonso, B., & Delgado, F., et al. (2012). First isolation of mycobacterium avium, subsp. paratuberculosis, in a dairy goat in argentina: pathology and molecular characterization.SmallRuminantResearch, 108(1-3):133-136.

[2]Lombard, J. E. (2011). Epidemiology and economics of paratuberculosis.VeterinaryClinicsofNorthAmericaFoodAnimalPractice, 27(3):525-535.

[3]Windsor, P. A. (2015). Paratuberculosis in sheep and goats.VeterinaryMicrobiology, 181(1-2):161-169.

[4]Robbe-Austerman, S. (2011). Control of paratuberculosis in small ruminants.VeterinaryClinicsofNorthAmericaFoodAnimalPractice, 27(3):609-620.

[5]Juan, L. D., lvarez, J., Romero, B., Bezos, J., Castellanos, E., & Aranaz, A., et al. (2006). Comparison of four different culture media for isolation and growth of type ii and type i/iii subsp. strains isolated from cattle and goats.AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 72(9):5,927-5,932..

[6]Travería, G. E., Zumarraga, M., Etchechoury, I., Romano, M. I., Cataldi, A., & Pinedo, M. F., et al. (2013). First identification of mycobacterium avium paratuberculosis sheep strain in argentina.Brazilianjournalofmicrobiology: [publicationoftheBrazilianSocietyforMicrobiology],44(3):897-899.

[7]Robbe-Austerman, S. (2011). Control of paratuberculosis in small ruminants.VeterinaryClinicsofNorthAmericaFoodAnimalPractice,27(3):609-620.

[8]Naser, S. A., Collins, M. T., Crawford, J. T., Valentine, J. F., Naser, S. A., & Collins, M. T., et al. (2009). Culture of mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (map) from the blood of patients with Crohn`s disease: a follow-up blind multi center investigation.OpenInflammationJournal, 2(1):22-23.

[9]Collins, D. M., De, Z. M., & Cavaignac, S. M. (2002). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis strains from cattle and sheep can be distinguished by a pcr test based on a novel DNA sequence difference.JournalofClinicalMicrobiology, 40(12):4,760-4,762.

[10]張恒軒, 張建基, 龔嘉林, 等. 新疆馬鹿感染副結(jié)核分枝桿菌的調(diào)查研究[J]. 特產(chǎn)研究,1994,(2): 16-17.

ZHANG Heng-xuan, ZHANG Jian-ji, GONG Jia-lin, et al. (1994). Investigation of Mycobacterium paratuberculosis in Xinjiang Wapiti [J].SpecialWildEconomicAnimalandPlandResearch, (2):16-17. (In Chinese)

[11]馬勛, 張高軒, 田晶華, 等. 新疆綿羊副結(jié)核分枝桿菌病的診斷(簡報(bào))[J]. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1999,3(1).

MA Xun, ZHANG Gao-xuang, TIAN Jing-hua, et al. (1999). The Diagnosis of Mycobacterium Paratuberculosis of Sheep in Xinjiang [J].JournalofShiheziUniversity(NaturalScienceEdition), 3(1). (In Chinese)

[12]韓猛, 張亮, 王基隆, 等. 山東省規(guī)模化奶牛場結(jié)核病與副結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2014,30(14):10-13.

HAN Meng, ZHANG Liang, WANG Ji-long, et al. (2014). Epidemiological Investigation of Large-scale Dairy Farm on Tuberculosis and Paratuberculosis in Shandong Province [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 30(14):10-13.(In Chinese)

[13]汪小強(qiáng), 韓照清, 劉鑫宇, 等. 西藏部分地區(qū)牦牛副結(jié)核病血清流行病學(xué)調(diào)查[J].中國奶牛, 2015,(14):63-65.

WANG Xiao-qiang, HAN Zhao-qing, LIU Xin-yu, et al. (2015). Seroprevalence of Paratuberculosis in Yaks in Some Regions of Tibet, China [J].ChinaDairyCattle, (14):63-65. (In Chinese)

[14]付志金, 宋戰(zhàn)昀, 馮新, 等. 吉林省梅花鹿副結(jié)核病, 結(jié)核病及布魯菌病血清流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013,33(11):1 696-1 699.

FU Zhi-jin, SONG Zhan-yun, FEN Xin, et al. (2013). Sero-epidemiological survey on prevalence of paratuberculosis sika deer in Jilin province [J].ChineseJournalofVeterinaryScience, 33(11):1,696-1,699. (In Chinese)

[15]Collins, M. T. (1996). Diagnosis of paratuberculosis.VeterinaryClinicsofNorthAmericaFoodAnimalPractice, 12(2):357-371.

Fund project:Support by national special project for fluffy sheep Industry (CARS-40-11), and science and technology planning project of General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China (AQSIQ) (2015IK286).

Etiological Detection and Analysis of Paratuberculosis in Sheep

WU Jian-yong1, WU Xing-xing2, YANG Xue-yun1, LI Jian-jun1, WANG Deng-feng1,JIN Ying-hong1, WANG Guang-lei1, WANG Zhi-cai1

(1. Veterinary Research Institute, Xinjiang Academy of Animal Science, Urumqi 830011, China;2.UrumqiCityAnimalDiseaseControlandDiagnosisCenter,Urumqi830063,China)

【Objective】 To determine the pathogenic characteristics of a sheep with suspected infection byMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis.【Method】The specimen (sheep mesenteric lymph node) sent for testing was examined by microscopy after smearing and acid-fast staining. The mesenteric lymph node tissue genomic DNA was extracted, and theIS900 gene and subtype gene ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosiswere detected from tissue genomic DNA by PCR, then PCR products were sequenced and analyzed.【Result】Some acid-fast staining positive strains were found on smear, and the molecular detection and sequencing results ofIS900 gene and subtype gene showed that the target strain was identified as type Ⅱ (cattle type)Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis.【Conclusion】It is confirmed that the sheep mesenteric lymph node tissue was the specimen infected with type Ⅱ (cattle type)Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisby microscopic examination and molecular detection.

Mycobacteriumaviumsubspparatuberculosis; sheep; etiological detection; sequence analysis

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.08.027

2016-03-22

國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-40-11)；國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015IK286)

吳建勇(1984-)，男，湖南醴陵人，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物微生物與免疫學(xué)，(E-mail)w19850505y@163.com

王治才(1955-)，男，甘肅高臺(tái)人，研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物微生物與免疫學(xué)，(E-mail)zhicai.w@163.com

S855.1+2

A

1001-4330(2016)08-1562-07