劉虹霞，張譯丹，張國(guó)剛*

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·藥學(xué)研究·

骨癆敵注射液HPLC指紋圖譜研究

劉虹霞1，張譯丹2，張國(guó)剛1*

目的 建立中藥復(fù)方制劑骨癆敵注射液的HPLC指紋圖譜分析方法，對(duì)制劑的質(zhì)量進(jìn)行控制。方法 采用ECOSIL C18柱(250 mm × 4.60 mm,5 μm)，以乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm，進(jìn)樣量：10 μL。結(jié)果 通過(guò)對(duì)25批制劑進(jìn)行指紋圖譜分析，標(biāo)定出9個(gè)共有峰。采用對(duì)照品指認(rèn)了毛蕊異黃酮葡萄糖苷、柚皮苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1 5個(gè)色譜峰。并運(yùn)用“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度計(jì)算軟件”，計(jì)算25批注射液的相似度在0.985 ～ 0.997之間。結(jié)論 所建立的HPLC指紋圖譜分析方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性良好，可用于骨癆敵注射液的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

骨癆敵注射液；指紋圖譜；HPLC；質(zhì)量控制

0 引言

骨癆敵注射液是由5味藥材組成的中藥復(fù)方制劑，其藥味分別為黃芪、三七、骨碎補(bǔ)、乳香和沒(méi)藥。骨癆敵注射液具有益氣養(yǎng)血、補(bǔ)腎壯骨、活血化瘀的功效，用于骨關(guān)節(jié)結(jié)核、淋巴結(jié)核、肺結(jié)核等各種結(jié)核病以及瘤型麻風(fēng)病等癥。中藥及其制劑均為多組分復(fù)雜體系，因此,評(píng)價(jià)其質(zhì)量應(yīng)采用與之相適應(yīng)的、能提供豐富鑒別信息的檢測(cè)方法，但現(xiàn)行的顯微鑒別、理化鑒別和含量測(cè)定等方法都不足以解決這一問(wèn)題。而中藥指紋圖譜能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)，這也正好符合中醫(yī)藥整體學(xué)說(shuō)。因此，筆者結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[1-5]，對(duì)骨癆敵注射液的HPLC指紋圖譜進(jìn)行研究，為其質(zhì)量控制方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀(配有DAD檢測(cè)器，Chemstation system化學(xué)工作站，美國(guó)Agilent公司)，AE240十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士Mettler公司)。

骨癆敵注射劑(規(guī)格：2 mL/支，批號(hào)：091201、091202、091203、110401、110402、110403、110404、110405、1207001、1207002、1207003、1207004、1207005、1207006、1207007、1207008、1207009、1207010、1208001、1208002、1209001、12009003、1209006、1210001、1210003，沈陽(yáng)藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號(hào)：111920-201102，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，柚皮苷(批號(hào)：110722-200309，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，三七皂苷R1(批號(hào)：0745-200006，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，人參皂苷Rg1(批號(hào)：110703-200726，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，人參皂苷Rb1(批號(hào)：110704-200217，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，娃哈哈純凈水(純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，乙腈(色譜純，天津康科德科技有限公司)，甲醇(色譜純，天津康科德科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ECOSIL C18柱(250 mm × 4.60 mm，5 μm)，以乙腈為流動(dòng)相A、水溶液為流動(dòng)相B，按表1程序進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備 供試品溶液：取骨癆敵注射液1支，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。

對(duì)照品溶液：取柚皮苷對(duì)照品、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品、三七皂苷R1對(duì)照品、人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品各適量，精密稱定，分別加10%甲醇溶液制成每1 mL含柚皮苷 0.40 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷 0.35 mg、三七皂苷R1 0.35 mg、人參皂苷Rg1 0.50 mg、人參皂苷Rb1 0.25 mg的對(duì)照品溶液，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 共有峰的標(biāo)定及對(duì)照指紋圖譜 將25批骨癆敵注射液按“2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣分析(見(jiàn)圖1)，以出現(xiàn)率100%計(jì)，取各批次制劑指紋圖譜中的典型色譜峰作為共有指紋峰，標(biāo)定出9個(gè)共有峰，并運(yùn)用“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度計(jì)算軟件”，采用平均數(shù)法生成注射液對(duì)照指紋圖譜(見(jiàn)圖2)。

圖1 25批骨癆敵注射液色譜圖

2.4 共有峰的指認(rèn) 與對(duì)照品色譜峰對(duì)比可以確定：4號(hào)峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，6號(hào)峰為柚皮苷，7號(hào)峰為三七皂苷R1，8號(hào)峰為人參皂苷Rg1，9號(hào)峰為人參皂苷Rb1，色譜圖見(jiàn)圖3，以6號(hào)峰即柚皮苷色譜峰為參比峰。

圖2 骨癆敵注射液對(duì)照指紋圖譜

圖3 骨癆敵注射液共有峰指認(rèn)

2.5 共有峰峰純度測(cè)定 應(yīng)用DAD檢測(cè)器，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件對(duì)供試品溶液進(jìn)行全掃描，測(cè)定各共有峰的峰純度，結(jié)果見(jiàn)表2。各色譜峰的峰純度均不小于85.0%，表明各共有峰與鄰近色譜峰分離度良好，無(wú)色譜峰重疊現(xiàn)象。

表2 峰純度結(jié)果

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 儀器精密度試驗(yàn) 取同一批(批號(hào)：110404)供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件分析，計(jì)算各共有峰與參比峰(6號(hào)峰)的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.2%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.3%，表明各色譜峰較為穩(wěn)定，儀器精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：110404)，按“2.2”項(xiàng)平行制備6份供試品，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算各共有峰與參比峰(6號(hào)峰)的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算其RSD。結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.3%，相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0%，表明該方法具有一定重復(fù)性。

2.6.3 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，于常溫下保存，分別在0、4、8、12、16和24 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件分析，計(jì)算各共有峰與參比峰(6號(hào)峰)的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.2%，相對(duì)峰面積的RSD均小于4.5%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)對(duì)指紋研究無(wú)影響。

2.7 相似度分析 運(yùn)用“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度計(jì)算軟件”對(duì)25批注射液的色譜圖進(jìn)行處理，經(jīng)色譜峰自動(dòng)匹配生成骨癆敵注射液的HPLC指紋圖譜共有模式，見(jiàn)圖4。通過(guò)“相似度計(jì)算”功能進(jìn)行色譜圖譜樣本與對(duì)照指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3。25批注射液之間相似度結(jié)果良好，說(shuō)明各批次間注射液差別較小，質(zhì)量穩(wěn)定。

圖4 25批骨癆敵注射液指紋圖譜疊加圖

批號(hào)相似度批號(hào)相似度0912010.98512070060.9910912020.98712070070.9960912030.99312070080.9961104010.99612070090.9971104020.98712070100.9961104030.98712080010.9961104040.99312080020.9961104050.99312090010.99312070010.99612090030.99312070020.98812090060.99312070030.99612100010.99212070040.99012100030.98512070050.987

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 根據(jù)骨癆敵注射液色譜圖研究在各波段下的吸收情況，結(jié)果顯示，203 nm波長(zhǎng)下，色譜峰較多，吸收較強(qiáng)，分離也較好，故選定檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 骨癆敵注射液3D光譜圖

圖6 骨癆敵注射液各波長(zhǎng)色譜圖疊加圖

3.2 梯度洗脫的選擇 筆者選擇了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水(冰醋酸)等多種流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)注射劑進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果表明，乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)各個(gè)色譜峰的分離度較好(203 nm檢測(cè))，基本達(dá)到基線分離，因此，選擇此流動(dòng)相為骨癆敵注射液指紋圖譜檢測(cè)的流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.3 共有峰歸屬 骨癆敵注射液共確定9個(gè)共有峰，其中4號(hào)峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，為黃芪的有效成分[6]；6號(hào)峰為柚皮苷，為骨碎補(bǔ)的有效成分[7]；7、8、9號(hào)峰分別為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1，均為三七的有效成分[8]。

[1] 熊明玲,劉凱南,高厚明,等.骨碎補(bǔ)高相液相指紋圖譜構(gòu)建與應(yīng)用[J].藥物研究,2011,20(5):4-5.

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HPLC fingerprint study of Gu laodi injection

LIU Hong-xia1,ZHANG Yi-dan2,ZHANG Guo-gang1*

(1.School of Traditional Chinese Materia Medica,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016,China;2.Liaoning Province Shiyan High School,Shenyang 110841,China)

Objective To establish an HPLC fingerprints analysis method for the quality control of the compound Chinese medicine Gu laodi injection.Methods The separation was performed on a ECOSIL C18column(250 mm×4.60 mm,5 μm) by gradient elution with acetonitrile-water as the mobile phase,the flow rate at 1.0 mL/min,the column temperature at 30 ℃,the detection wavelength at 203 nm and the injection volume at 10 μL.Results By the fingerprint analysis of 25 batches of injection,we had pinpointed 9 common peaks.The peaks of calycosin-7-glucoside,naringin,notoginsenoside R1,ginsenoside Rg1 and ginsenoside Rb1 were identified.The similarity of 25 batches of injection was about 0.985 to 0.997 by using traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity calculation software.Conclusion The HPLC fingerprints analysis method is specific and reproducible,and it can be used to assess the quality of Gu laodi injection.

Gu laodi injection;Fingerprint;HPLC;Quality control

2016-08-10

1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016；2.遼寧省實(shí)驗(yàn)中學(xué)，沈陽(yáng) 110841

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201610018