楊有林，齊武強(qiáng),魯旭娟

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HPLC-MS/MS法同時測定腦血疏口服液中三種成分的含量

楊有林1，齊武強(qiáng)2,魯旭娟3*

目的 采用HPLC-MS/MS法同時測定腦血疏口服液中3種有效成分-芍藥苷、黃芪甲苷及丹皮酚的含量。方法 選用Phenomenex Luna C18(100 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以含10 mmol/mL乙酸銨乙腈溶液(A)、10 mmol/mL乙酸銨水溶液(B)為流動相，梯度洗脫；質(zhì)譜為ESI源負(fù)離子-MRM模式下檢測，流速為0.3 mL/min；柱溫為25 ℃。結(jié)果 芍藥苷、黃芩甲苷及丹皮酚3種成分線性范圍分別為0.20～2.00 μg (r=0.999 1)、2.00～20.00 μg (r=0.999 0)、1.00～10.00 μg (r=0.998 5)，3種化合物的平均回收率分別為100.1%、97.9%、102.3%。結(jié)論 本方法簡便、快捷，重現(xiàn)性好，適用于同時測定腦血疏口服液中芍藥苷、黃芪甲苷及丹皮酚的含量。

腦血疏口服液；芍藥苷；黃芪甲苷；丹皮酚；HPLC-MS/MS

0 引言

腦血疏口服液主要由黃芪、水蛭、牡丹皮、石菖蒲、牛膝、川芎和大黃7味中藥材組成。主要用于氣虛血瘀所致中風(fēng)、癥見半身不遂、口眼歪斜、舌強(qiáng)語蹇、偏身麻木、氣短乏力、舌暗苔薄白或白膩、脈沉細(xì)或細(xì)數(shù)、出血性中風(fēng)急性期及恢復(fù)早期見上述證候者[1]。近年來腦血疏口服液廣泛應(yīng)用于出血性中風(fēng)的治療，目前對腦血疏口服液在臨床方面研究的相關(guān)報(bào)道較多[1-3]，對于其方中主要成分含量的報(bào)道較少，羅小蘭等[4]測定了腦血疏口服液正丁醇提取后殘留物的質(zhì)量，沒有測定某種成分的具體含量。

本研究根據(jù)中醫(yī)理論，選擇方中黃芪和牡丹皮作為檢測藥材。黃芪中有效成分黃芪甲苷對腦缺血再灌注后血腦屏障具有保護(hù)作用，同時牡丹皮具有清熱涼血、活血化瘀之功效，丹皮酚和芍藥苷均為其有效成分。故選擇上述3種成分作為檢測成分。有研究者曾采用HPLC-UV法、HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷的含量[5-6]，但因黃芪甲苷在紫外區(qū)僅有末端吸收且不穩(wěn)定，且本試驗(yàn)同時測定芍藥苷、黃芪甲苷和丹皮酚的含量，因此，采用 HPLC-MS/MS法作為測定方法，該方法快速、簡便，以控制該制劑的質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Agilent 6410質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)；電子分析天平(MS104S型分析天平，瑞士梅特勒公司)。

1.2 藥品與試劑 腦血疏口服液(批號：120705、120806、120902，規(guī)格：10 mL*10支，山東沃華醫(yī)藥科技股份有限公司)，黃芪甲苷對照品(批號：111640-201002)、芍藥苷對照品(批號：110736-201136)及丹皮酚對照品(批號：110708-200506)均購于中國藥品生物制品檢定所，乙腈、乙酸銨均為色譜純，購于美國Sigma試劑公司，水為娃哈哈純凈水。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna C18(100 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：10 mmol/mL乙酸銨乙腈溶液(A)，10 mmol/mL乙酸銨水溶液(B)，梯度洗脫程序見表1；流速：0.3 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜條件 離子源為ESI源；檢測及掃描分別采用負(fù)離子檢測方式及多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式，霧化器壓力為50.0 psig；干燥氣溫度：400 ℃；毛細(xì)管電壓：-5 000 V；四極桿溫度：100 ℃；干燥氣流速：10.0 L/min。檢測化合物待測離子參數(shù)見表2。

表2 檢測化合物離子參數(shù)

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱定芍藥苷、黃芪甲苷及丹皮酚對照品適量，置于棕色量瓶中，溶解并稀釋至刻度(50%甲醇)，搖勻，制成混合對照品儲備液(質(zhì)量濃度分別為1.00、10.00、5.00 μg/mL)，吸取混合對照品儲備液各0.20、0.40、0.80、1.00、1.60、2.00 mL，用50%甲醇稀釋至100 mL量瓶中制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。得芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度：2.00、4.00、8.00、10.00、16.00、20.00 ng/mL；黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度：20.00、40.00、80.00、100.00、160.00、200.00 ng/mL；丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度：10.00、20.00、40.00、50.00、80.00、100.00 ng/mL，置于-20 ℃冰箱冷藏。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密吸取腦血疏口服液0.10 mL置于50 mL量瓶中，加入起始流動相[10 mmol/mL乙酸銨乙腈溶液∶10 mmol/mL乙酸銨水溶液(10∶90)]稀釋至刻度，搖勻后靜置。吸取5.00 mL溶液置于離心管中，4 000 r/min離心10 min，精密吸取上清液過微孔濾膜，即得。

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng) 由于腦血疏口服液為保密方，無處方比例，所以未做陰性對照試驗(yàn)，采用“基質(zhì)效應(yīng)”試驗(yàn)代替陰性對照試驗(yàn)。取同一批號的腦血疏口服液，根據(jù)“2.3.2”中方法制備溶液5份，利用“2.1”項(xiàng)色譜條件與“2.2”項(xiàng)質(zhì)譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，得3種待測化合物的平均色譜峰面積A1 (A1黃芪甲苷、A1芍藥苷、A1丹皮酚)；另精密吸取相同批號的腦血疏口服液0.10 mL置于50 mL量瓶中，同時精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅳ 0.10 mL，加入起始流動相[10 mmol/mL乙酸銨乙腈溶液∶10 mmol/mL乙酸銨水溶液(10∶90)]稀釋至刻度，搖勻后靜置。吸取5 mL溶液置于離心管中，4 000 r/min 離心10 min，精密吸取上清液過微孔濾膜，制備對照樣品5份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及“2.2”項(xiàng)質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，得到上述待測化合物的平均色譜峰面積A2 (A2黃芪甲苷、A2芍藥苷、A2丹皮酚)；此外，精密吸取5份混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅳ 0.10 mL，分別置于50 mL量瓶中，制備5份標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及“2.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，得到各待測化合物的平均色譜峰面積A3 (A3黃芪甲苷、A3芍藥苷、A3丹皮酚)。以各待測化合物(A2-A1)與A3的比值(1∶12<1∶3)來衡量基質(zhì)效應(yīng)。上述比較結(jié)果均符合文獻(xiàn)[7]中關(guān)于基質(zhì)效應(yīng)比值<1∶3的標(biāo)準(zhǔn)。表明在本方法下樣品基質(zhì)對待測物的測定無影響，同時樣品中其他化合物對待測物檢測無影響。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取5 μL上述系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件和“2.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，并記錄峰面積。橫坐標(biāo)(m)表示待測物質(zhì)量，縱坐標(biāo)(y)表示色譜峰面積，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，回歸方程見表3。

表3 回歸方程結(jié)果

2.5 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅳ(芍藥苷、黃芪甲苷及丹皮酚的濃度分別為10、100、50 ng/mL)，在“2.1”項(xiàng)色譜條件及“2.2”項(xiàng)質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析(n=6)，結(jié)果顯示，上述3種待測樣品的峰面積RSD(n=6)依次為1.8%、1.4%、1.1%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一批號(120902)腦血疏口服液0.10 mL，根據(jù)“2.3.2”中方法制備供試品溶液，并采用“2.1”項(xiàng)色譜條件和“2.2”項(xiàng)質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析(n=6)，芍藥苷、黃芪甲苷及丹皮酚的含量RSD(n=6)分別為2.1%、1.9%、2.6%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密取同一批號(120902)腦血疏口服液0.10 mL，根據(jù)“2.3.2”中條件制備1份供試品溶液，放置于室溫條件下，并在0、6、12、24、48 h分別進(jìn)樣分析，芍藥苷、黃芪甲苷及丹皮酚峰面積RSD(n=5)分別為1.3%、1.4%、0.9%。結(jié)果表明，溶液于室溫條件下靜置48 h仍穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn) 精密取同一批號(120902)腦血疏口服液0.10 mL (n=6)，精密稱定，分別精密加入上述混合對照品儲備液(芍藥苷、黃芪甲苷及丹皮酚的濃度分別為1.00、10.00、5.00 μg/mL) 0.60 mL，根據(jù)“2.3.2”中方法制備為供試品溶液并進(jìn)行分析，測定3種待測物的回收率，得其平均回收率分別為100.1%、97.9%、102.3%，RSD分別為4.0%、3.1%、5.7%。

2.9 供試品含量測定 取腦血疏口服液3批，每批3份，根據(jù)“2.3.2”中方法制備供試品溶液，并采用“2.1”項(xiàng)色譜條件和“2.2”項(xiàng)質(zhì)譜條件進(jìn)行測定并分析，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算上述樣品的含量。結(jié)果見表4。同時，取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅳ、上述供試品溶液1份，在相同色譜及質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。

表4 腦血疏口服液中芍藥苷、黃芪甲苷和丹皮酚的含量

圖1 TLC色譜圖

注：A.混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，B.腦血疏口服液；Ⅰ.芍藥苷，Ⅱ.黃芪甲苷，Ⅲ.丹皮酚

3 討論

黃芪甲苷一般是在紫外末端吸收(λ=203 nm)，采用ELSD檢測器靈敏度不高，干擾較大；在本實(shí)驗(yàn)中，由于腦血疏口服液方中藥味多，雜質(zhì)較多，分離難度增大，因此，采用HPLC-UV法或HPLC-ELSD法需多步提取，操作繁瑣。此外，方中芍藥苷的含量較低。綜上，最后確定采用HPLC-MS/MS測定方中芍藥苷、黃芪甲苷及丹皮酚的含量。徐潔等[8]采用HPLC-MS/MS測定黃芪甲苷和芍藥苷時選擇負(fù)離子模式測定，由于黃芪甲苷及芍藥苷結(jié)構(gòu)中含有多羥基，丹皮酚結(jié)構(gòu)中也含有羥基，能提供[H]+，故該分子呈一定程度的弱酸性，使化合物帶有負(fù)電荷。本研究主要基于上述理論，并結(jié)合各個化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇負(fù)離子模式檢測方法。結(jié)果顯示，黃芪甲苷與芍藥苷負(fù)離子的響應(yīng)值較高，丹皮酚負(fù)離子響應(yīng)較正離子稍低，但能滿足檢測需要，所以，3種檢測化合物均采用負(fù)離子模式測定，且專屬性強(qiáng)。

由于腦血疏口服液組方保密，方中各成分比例無法可知，所以本實(shí)驗(yàn)沒有制備陰性溶液，而是采用添加法測定基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，證明方中其他成分對待測物無干擾。同時，做基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)較陰性對照實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢在于其不僅能夠反映出其他藥物對待測物的干擾，還能反映藥材本身所含成分對待測物的干擾。經(jīng)基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)后證明方中所含成分對待測物基本無干擾。

由于采用負(fù)離子檢測，條件考察中分別選擇甲醇、乙腈有機(jī)相。結(jié)果顯示，選擇甲醇作為有機(jī)相時，待測物相應(yīng)信號不穩(wěn)定且信號稍低，分析原因可能是甲醇分子中含有羥基，也能提供一定的[H]+，由于本研究采用梯度洗脫的方式，造成流動相中甲醇提供[H]+不均勻，且抑制待測物的離子化程度；而乙腈分子中，其含有的N原子可有效結(jié)合氫離子，并可加強(qiáng)待測物離子化的效應(yīng)，因此將乙腈確定為有機(jī)相；同時，在流動相中加入一定比例乙酸銨，可有效改善色譜峰峰型。而采用梯度洗脫方式作為色譜條件，可在較短時間內(nèi)對3種成分的含量進(jìn)行同時測定，在程序最后回到流動相初始狀態(tài)平衡色譜柱，能使色譜峰保留時間穩(wěn)定。

[1] 陳澈,院立新,張根明.腦血疏口服液在腦血管病方面的臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2014,12(8):1005-1006.

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[3] 劉曉萍.腦血疏口服液的實(shí)驗(yàn)研究與臨床效果評價[J].中國藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)雜志,2012,6:128-130.

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Simultaneous determination of paeoniflorin,astragaloside Ⅳ and paeonol in Naoxueshu liquid by HPLC-MS/MS

YANG You-lin1,QI Wu-qiang2,LU Xu-juan3*

(1.Department of Pharmacy,Maternal and Child Health Hospital of Baoji City,Baoji 721000,China;2.Department of Pharmacy,Traditional Chinese Medicine Hospital of Baoji,Baoji 721000,China;3.Department of Clinical Laboratory,Xi′an Central Hospital,Xi′an 710003)

Objective To develop an HPLC-MS/MS method for simultaneous determination of paeoniflorin,astragaloside Ⅳ and paeonol in Naoxueshu liquid.Methods The chromatographic separation was achieved on a Phenomenex Luna C18column (100 mm×4.6 mm,5 μm) with a mobile phase of 10 mmol/mL ammonium acetate in acetonitrile-10 mmol/mL ammonium acetate solution.The flow rate was 0.3 mL/min and the column temperature was 25 ℃.Results The paeoniflorin,astragaloside Ⅳ and paeonol showed good linearity in 0.20～2.00 μg(r=0.999 1),2.00～20.00 μg(r=0.999 0) and 1.00～10.00 μg (r=0.998 5),and the average recovery rates were 100.1%,97.9% and 102.3%,respectively.Conclusion The method is accurate,sensitive and specific,which can be used for the quality control of Naoxueshu liquid.

Naoxueshu liquid;Paeoniflorin;Astragaloside Ⅳ;Paeonol;HPLC-MS/MS

2016-03-18

1.陜西省寶雞市婦幼保健院藥劑科，陜西 寶雞721000；2.陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，陜西 寶雞 721000；3.西安市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安710003

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201610019