蔣卉男，王洪濤，李迎春，張 歡，劉卓剛

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復(fù)發(fā)難治B系淋巴瘤CAR-T治療后細(xì)胞因子變化

蔣卉男，王洪濤，李迎春，張 歡，劉卓剛*

目的 分析于我中心行CAR-T治療患者治療前后細(xì)胞因子變化，評(píng)估相關(guān)細(xì)胞因子在免疫治療中的作用及相關(guān)機(jī)制。方法 分別在復(fù)發(fā)難治B系淋巴瘤患者CAR-T細(xì)胞回輸前及回輸后4、7、14 d采集外周血，利用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)患者相關(guān)細(xì)胞因子(Th1、Th17、Foxp3、TNF-α、TGF-β、IL-10、IFN-γ、T抑制細(xì)胞、NK細(xì)胞及CRP)水平，分析變化趨勢(shì)。結(jié)果 4次CAR-T細(xì)胞回輸數(shù)目分別為：8×107、10×107、9.6×107、10×107。CAR-T細(xì)胞回輸前及回輸后4、7、14 d，Th1、Th17及CRP變化趨勢(shì)與臨床療效相關(guān)，NK細(xì)胞、CD8+細(xì)胞未見(jiàn)明顯相關(guān)性，而Tregs細(xì)胞作用尚未明確。結(jié)論 應(yīng)用CAR-T細(xì)胞回輸后，Th1、Th17相關(guān)效應(yīng)性T細(xì)胞細(xì)胞因子上升趨勢(shì)與臨床療效密切相關(guān)，NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞未見(jiàn)明顯相關(guān)性，而Tregs細(xì)胞作用尚未明確。關(guān)于CAR-T治療前后序貫治療、移植與CAR-T治療的關(guān)系，是否可以應(yīng)用細(xì)胞因子制劑促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增與效應(yīng)，仍有待進(jìn)行相關(guān)大樣本臨床研究。

復(fù)發(fā)難治B系淋巴瘤；CAR-T；細(xì)胞因子

0 引言

嵌合抗原受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞(Chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)是一類(lèi)能夠同時(shí)具有抗體特異性靶向識(shí)別的特點(diǎn)以及T細(xì)胞強(qiáng)大的效應(yīng)機(jī)制的基因工程細(xì)胞。鑒于CAR-T不依賴(lài)MHC限制性、無(wú)需抗原呈遞、雙信號(hào)系統(tǒng)激活、共刺激作用等特點(diǎn)，避開(kāi)傳統(tǒng)腫瘤耐受機(jī)制，可用于化療耐藥、酪氨酸激酶抑制劑耐藥以及造血干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)、供者細(xì)胞輸注無(wú)效的病例。CAR 由胞外特異性腫瘤抗原識(shí)別區(qū)、鉸鏈、跨膜區(qū)及胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域4個(gè)部分組成。其中，胞外特異性腫瘤抗原識(shí)別區(qū)結(jié)合了針對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原特異性抗體的抗原識(shí)別區(qū)的重鏈及輕鏈，能夠直接識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，進(jìn)而通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)域傳導(dǎo)信號(hào)、活化效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)。CAR通過(guò)基因工程的方法表達(dá)于T細(xì)胞表面，通過(guò)體外擴(kuò)增后過(guò)繼輸注給患者體內(nèi)的療法稱(chēng)為CAR-T療法。活化后的CAR-T細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子對(duì)抗腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制，從而提高T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。CAR-T作為新興免疫治療方法從開(kāi)展以來(lái)就受到了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注，其療效評(píng)估更是廣大研究者的討論熱點(diǎn)。我中心擬評(píng)估復(fù)發(fā)難治B系淋巴瘤患者CAR-T治療后相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，同時(shí)研究其作用機(jī)制，進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療。

1 研究對(duì)象

患者，男，41歲，于2013年10月發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸部腫大，伴盜汗、納差，行骨髓穿刺術(shù)及左側(cè)頸部淋巴結(jié)活檢術(shù)，確診慢性淋巴細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)化為非霍奇金淋巴瘤(彌漫大B細(xì)胞型，非生發(fā)中心型)Ritcher綜合征Ⅳ期B組IPI4分。行PET-CT示病灶侵及雙側(cè)頸部、雙側(cè)頜下、雙側(cè)鎖骨上淋巴結(jié)、雙側(cè)腋窩淋巴結(jié)，鼻咽、右側(cè)咽旁間隙、縱隔、雙肺門(mén)淋巴結(jié)、胰腺后方、腹主動(dòng)脈淋巴結(jié)、雙側(cè)盆壁、雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)，SUV介于2.4～6.3，并有骨髓浸潤(rùn)，SUVmax=4.5。行R-CHOP方案化療5個(gè)周期(第1次應(yīng)用美羅華后包塊明顯減小)，第3周期化療前復(fù)查骨髓象有核細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯異常，療效判定為PR。后行HyperCVAD-MA方案2個(gè)周期，出現(xiàn)Ⅳ度骨髓抑制；R-GEMOX方案2個(gè)周期，GEMOX方案1個(gè)周期。之后于2014年10月腋下新發(fā)包塊提示疾病復(fù)發(fā)，行美羅華聯(lián)合化療2個(gè)周期，無(wú)好轉(zhuǎn)，再次行PET-CT檢查，提示：右腋窩多枚腫大淋巴結(jié)，F(xiàn)DG代謝水平異常升高，較大者3.0 cm×1.7 cm，SUVmax=5.6；雙肺下葉FDG高代謝灶，SUVmax=4.6，考慮淋巴瘤浸潤(rùn)；左側(cè)髂骨及骶骨近左側(cè)骶髂關(guān)節(jié)處局部骨質(zhì)呈FDG異常高代謝，SUVmax=5.8；部分小腸、乙狀結(jié)腸及直腸腸壁略厚，腸壁及腸腔內(nèi)FDG代謝水平較高，SUVmax=8.7。

2015年3月患者為行CAR-T細(xì)胞治療前往我中心診治?；颊呷朐簳r(shí)右側(cè)腋下觸及腫大淋巴結(jié)，質(zhì)硬，無(wú)觸痛，大小約17 cm，無(wú)活動(dòng)性，其余查體無(wú)明顯異常，周身疼痛明顯。該患者分別于2015年3月10日、3月13日、5月12日、5月19日于我中心輸注CD19標(biāo)靶的CAR-T細(xì)胞，回輸前3 d予FC方案預(yù)處理。具體用藥：氟達(dá)拉濱30 mg/m2(3d)，環(huán)磷酰胺150 mg/m2(d2～d3)，回輸細(xì)胞量分別為：8×107、10×107、9.6×107、10×107?；颊哂诘?次回輸后第4天即發(fā)現(xiàn)腋下包塊明顯減小，回輸后第8天出現(xiàn)高熱，體溫超過(guò)39 ℃，予退熱栓退熱，伴腹瀉2 d及咽喉部不適，對(duì)癥處理后上述癥狀好轉(zhuǎn)。第3次回輸后第8天出現(xiàn)發(fā)熱，最高38 ℃，伴咽喉部不適，發(fā)熱1 d后癥狀好轉(zhuǎn)。4次細(xì)胞回輸后患者于2015年6月8日再次行PET-CT提示，原腋窩FDG高代謝淋巴結(jié)本次掃面明顯減小，SUVmax=1.2；原雙肺下葉近胸膜下類(lèi)圓形FDG高代謝灶，本次掃描消失；原髂骨、骶骨及骶髂關(guān)節(jié)處FDG高代謝灶，本次掃描明顯減低，SUVmax=3.1。行骨髓穿刺術(shù)提示，未見(jiàn)淋巴瘤細(xì)胞，評(píng)估患者療效達(dá)到PR。之后患者于2015年8月在我院行自體造血干細(xì)胞移植，現(xiàn)患者狀態(tài)平穩(wěn)，病情控制穩(wěn)定，生活質(zhì)量良好。

2 方法

本中心分別于患者CAR-T細(xì)胞回輸前及回輸后4、7、14 d采集外周血，利用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)患者相關(guān)細(xì)胞因子水平。

3 結(jié)果

患者4次CAR-T細(xì)胞輸注數(shù)量見(jiàn)表1，流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子水平變化見(jiàn)表2。

表1 患者4次輸注CAR-T細(xì)胞數(shù)量

由表2可見(jiàn)，Th1、Th17相關(guān)效應(yīng)性T細(xì)胞細(xì)胞因子及CRP變化趨勢(shì)與臨床療效相關(guān)，NK細(xì)胞、CD8+細(xì)胞未見(jiàn)明顯相關(guān)性，而Tregs細(xì)胞作用尚未明確。

4 討論

腫瘤相關(guān)的免疫治療在近幾年的腫瘤治療中取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。腫瘤微環(huán)境的免疫平衡理論受到關(guān)注，免疫增強(qiáng)因子的減少與免疫抑制因子的增多成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，并由此產(chǎn)生了靶向治療腫瘤的新方法。

近年來(lái)，CAR-T在免疫治療中的作用得到學(xué)者的關(guān)注。CAR-T治療后GM-CSF的表達(dá)[1]，聯(lián)合IFN-r、IL-6、CRP，腫瘤大小，已被證實(shí)為評(píng)估CAR-T療效的重要依據(jù)。我中心通過(guò)1例治療成功CAR-T患者案例得出初步結(jié)論，應(yīng)用CAR-T細(xì)胞回輸后，Th1、Th17相關(guān)效應(yīng)性T細(xì)胞細(xì)胞因子上升趨勢(shì)與臨床療效密切相關(guān)，NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞未見(jiàn)明顯相關(guān)性，而Tregs細(xì)胞作用尚未明確。

表2 CAR-T輸注前后細(xì)胞因子監(jiān)測(cè)

注：—由于外周血中細(xì)胞含量少，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)未獲得

研究顯示，T細(xì)胞通過(guò)不同的分化途徑生成不同T細(xì)胞，產(chǎn)生特殊性能。CD4+T細(xì)胞亞群中[2]，Thl主要分泌IL-2、IFN-γ和 TNF等，Th2主要分泌IL-4、IL-5、 IL-10、IL-13等。正常穩(wěn)態(tài)下，機(jī)體 Th1/Th2 處于平衡狀態(tài)，若平衡失調(diào)則稱(chēng)為T(mén)h1/Th2漂移。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，免疫格局多偏向 Th2，削弱Th1，有助于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[3]。若能通過(guò)免疫治療逆轉(zhuǎn)這種漂移狀態(tài)，則可以對(duì)腫瘤細(xì)胞起到強(qiáng)有力的殺傷作用[4-5]。本研究中，針對(duì)復(fù)發(fā)難治B系腫瘤患者，T細(xì)胞無(wú)法正常啟動(dòng)、維持對(duì)腫瘤細(xì)胞及其他抗原的免疫應(yīng)答。因此，將經(jīng)過(guò)基因工程處理的CAR-T細(xì)胞回輸至患者體內(nèi)，成功啟動(dòng)免疫反應(yīng)，可以克服體內(nèi)原有T細(xì)胞的功能缺陷，從而起到腫瘤殺傷作用。

CAR-T療法在產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞殺傷作用的同時(shí)，也會(huì)因?yàn)榧?xì)胞因子的過(guò)度釋放導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生。此時(shí)，患者可能會(huì)發(fā)生高熱、呼吸困難、急性呼吸窘迫綜合征、嚴(yán)重心律失常，甚至多器官功能衰竭。已有研究表明，CD19CAR-T可以產(chǎn)生劑量相關(guān)性急性細(xì)胞毒性作用，而且高水平分泌Th2可以誘導(dǎo)肉芽腫反應(yīng)，從而產(chǎn)生慢性的細(xì)胞毒效應(yīng)[6]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子風(fēng)暴多與IL-6及IFN-γ等細(xì)胞因子的高循環(huán)水平相關(guān)。癥狀多于開(kāi)始輸注細(xì)胞的數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)出現(xiàn)，癥狀出現(xiàn)的機(jī)會(huì)及嚴(yán)重程度與前期誘導(dǎo)藥物、機(jī)體免疫細(xì)胞活化程度及腫瘤負(fù)荷密切相關(guān)。在患者出現(xiàn)上述癥狀時(shí)，及時(shí)地判斷及處理尤為關(guān)鍵。主要的處理措施包括：①對(duì)癥治療：控制體溫在39 ℃以下，對(duì)于出現(xiàn)循環(huán)衰竭患者，注意循環(huán)支持及腎功能保護(hù)；②拮抗劑使用：出現(xiàn)低氧血癥的患者，可以給予TNFα拮抗劑及IL-6拮抗劑，用藥時(shí)注意低劑量起始，密切觀察藥物的后續(xù)免疫抑制作用；③處理腫瘤溶解綜合征：注意監(jiān)測(cè)患者血象、尿酸、腎功能及相關(guān)系統(tǒng)征象，水化、堿化治療。此外，同時(shí)，目前已有小分子制劑作為CAR-T細(xì)胞的自殺制劑應(yīng)用于臨床，對(duì)于危及生命的細(xì)胞因子風(fēng)暴反應(yīng)或者長(zhǎng)期B細(xì)胞功能缺陷的患者，可以應(yīng)用該制劑撤除體內(nèi)CAR-T，終止CAR-T免疫反應(yīng)。

在CAR-T產(chǎn)生的免疫反應(yīng)中，Tregs是具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞，能夠在免疫應(yīng)答負(fù)調(diào)節(jié)以及自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)[5]，腫瘤發(fā)生免疫逃逸的重要機(jī)制之一是Tregs對(duì)抗腫瘤免疫應(yīng)答的抑制作用。因此，降低腫瘤患者體內(nèi)Tregs的表達(dá)或降低其活性可能提高免疫治療的療效。且已有研究表明，在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者中，高水平的Tregs細(xì)胞與CD4/CD8比值較低、不成熟樹(shù)突狀細(xì)胞增多正相關(guān)，預(yù)示不良預(yù)后[7]；另有研究證實(shí)，在慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病患者中，Tregs可以作為量化預(yù)后的指標(biāo)[8]，代表Tregs的CD4、CD25、CD127在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室即可化驗(yàn)，其高低與患者預(yù)后、化療達(dá)到CR的時(shí)間成正比。目前，已有研究者重點(diǎn)研究利用Tregs細(xì)胞提供的微環(huán)境，在繼免疫治療自身免疫疾病和異基因造血干細(xì)胞移植后出現(xiàn)的排斥反應(yīng)。同時(shí)，在腫瘤治療方面，已經(jīng)出現(xiàn)可以改變Tregs介導(dǎo)的局部免疫抑制微環(huán)境的方法，如抑制可以促進(jìn)Tregs分化的吲哚胺2,3-雙加氧酶1(IDO)，從而逆轉(zhuǎn)Tregs在腫瘤患者細(xì)胞中的增殖。

NK細(xì)胞是機(jī)體固有免疫反應(yīng)中重要的效應(yīng)細(xì)胞，與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。NK細(xì)胞具有無(wú)需抗原致敏直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[9]。其中，NKG2D是NK細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用的關(guān)鍵的活化型受體，其能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)的NKG2D配體。Parkhurst等[10]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者自身的NK細(xì)胞具有和健康人相似的增殖性，但是這些細(xì)胞僅低水平表達(dá)NKG2D，并且需要外源IL-2二次活化，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)歸無(wú)明顯作用。Bachanova等[11]前期研究也證實(shí)了自體NK細(xì)胞對(duì)于腫瘤患者并無(wú)臨床療效。目前并沒(méi)有相關(guān)研究證實(shí)NK細(xì)胞與CAR-T作用前后的變化及相關(guān)意義。

腫瘤免疫治療雖然在近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)，但仍存在許多亟待解決的問(wèn)題。免疫治療療效的評(píng)估及相關(guān)輔助用藥、治療機(jī)制仍尚不明確。本中心目前接受CAR-T治療的患者例數(shù)仍有限，尚不足以形成細(xì)胞因子評(píng)估預(yù)后量化標(biāo)準(zhǔn)，有待結(jié)合多中心治療結(jié)果系統(tǒng)評(píng)價(jià)。關(guān)于CAR-T治療的前后序貫治療、移植與CAR-T治療的關(guān)系、是否可以應(yīng)用細(xì)胞因子制劑促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增與效應(yīng)仍有待進(jìn)行相關(guān)大樣本臨床試驗(yàn)，從而得出統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，指導(dǎo)臨床治療方案的確定。

志謝：感謝北京美康優(yōu)娃生物科技有限公司為我中心提供CAR-T細(xì)胞制備的技術(shù)支持。

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Changes in cytokines after CAR-T treatment for relapsed and refractory B-cell lymphoma

JIANG Hui-nan,WANG Hong-tao,LI Ying-chun,ZHANG Huan,LIU Zhuo-gang*

(Department of Hematology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110020,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of the changes in cytokines after CAR-T treatment for relapsed and refractory B-cell lymphoma.Methods The blood of patients with refractory and relapsed B-cell lymphoma was collected before and at 4,7,14 d after CAR-T.The changes in cytokines were detected by flow cytometry.Results The number of the CAR-T cells was 8×107,10×107,9.6×107and 10×107,respectively.The changes in Th1,Th17 and CRP were related to the clinical efficacy,while no relationship was found between NK cells and CD8+cells,and the effect of Tregs was still not clear.Conclusion The upward of levels of Th1,Th17 and CRP is related to the clinical efficacy,while NK cells and CD8+cells has no relationship with it,and the relationship of Tregs with clinical efficacy is still not clear.Clinical trials with large sample size should be performed to clarify the relationship of sequential therapy before and after CAR-T and transplantation with CAR-T,and whether cytokines can promote the amplification efficiency.

Refractory and replased B-cell lymphoma;CAR-T;Cytokines

2016-01-20

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液科，沈陽(yáng) 110020

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201610017