范建華張 濤楊蘊(yùn)蕾陳 勛李尚民竇新紅

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽所,江蘇揚(yáng)州 225125; 2.北京農(nóng)學(xué)院,北京 102206; 3.上海復(fù)振物科技有限公司,上海 200437)

中藥復(fù)方消毒劑對雞只常見菌的體外抑菌試驗(yàn)

范建華1張 濤2楊蘊(yùn)蕾3陳 勛3李尚民1竇新紅*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽所,江蘇揚(yáng)州 225125; 2.北京農(nóng)學(xué)院,北京 102206; 3.上海復(fù)振物科技有限公司,上海 200437)

為了解國內(nèi)某廠家生產(chǎn)的植物源中藥復(fù)方消毒劑的體外抑菌效果，試驗(yàn)采用了藥敏打洞法和試管二倍稀釋法，對臨床常見的4種有害菌進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該消毒劑對大腸桿菌高度敏感，對其他3種菌中度敏感；對禽巴氏桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度為62.5mg/ml，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為31.3mg/ml。結(jié)果表明，該廠家生產(chǎn)的中藥消毒劑對雞常見的4種有害菌有較好的體外抑菌效果。

中藥復(fù)方消毒劑體外抑菌試驗(yàn)最小抑菌濃度

近年來，隨著養(yǎng)禽業(yè)的快速發(fā)展，禽病也顯得越來越復(fù)雜，特別是家禽細(xì)菌性疾病，傳播廣泛，危害較大，防治最難[1]。目前控制細(xì)菌性疾病的主要措施是應(yīng)用抗生素或其他化學(xué)藥物。然而，抗生素及化學(xué)藥物的長期、大量使用，不僅導(dǎo)致了大量耐藥菌株的頻繁出現(xiàn)，而且在食物源動(dòng)物的過量殘留，也會引起食品安全問題。因此，當(dāng)前積極研究和開發(fā)抗菌藥物的替代品尤為迫切[2]。

用于疫病預(yù)防的獸用消毒劑也面臨同樣難題?，F(xiàn)階段臨床應(yīng)用較多的消毒劑，多屬化學(xué)性消毒劑，種類繁多，常用的主要有復(fù)合酚類、碘類、季銨鹽類和氯制劑四大類。盡管對疫病病原有較好的殺滅作用，但也存在許多問題，如長期使用某些化學(xué)消毒劑對雞舍的籠具設(shè)施有一定的腐蝕性；某些強(qiáng)刺激性的化學(xué)消毒劑帶雞消毒時(shí)，對雞的眼結(jié)膜和呼吸道有一定的損傷；另外，消毒劑在使用不當(dāng)時(shí)，對飼養(yǎng)工人也有一定毒副作用[3]。

鑒于化學(xué)消毒劑可能存在一些不足。本試驗(yàn)是基于前期研究基礎(chǔ)，從蘆薈、苦楝、麻籽、皂莢、苦參根、地榆根、大青葉、柑橘果皮、金錢松根皮等多種植物中提取有效成分，根據(jù)中醫(yī)藥配伍理論，采用現(xiàn)代的復(fù)配技術(shù)，精煉而成的純天然植物源消毒劑，將嘗試對臨床常見的4種細(xì)菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，旨在為今后進(jìn)一步開發(fā)新型、綠色獸用消毒劑提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品

受試藥：500m1中藥復(fù)方消毒劑水溶液，含1g/m1生藥，由上海復(fù)振科技有限公司提供。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

禽巴氏桿菌C48-1株、雞白痢標(biāo)準(zhǔn)株YD 2株、大腸桿菌C15003株、金黃色葡萄球菌YD-1株，由本實(shí)驗(yàn)室保存、提供。

1.1.3 主要試劑、耗材

馬丁肉湯培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯和生化反應(yīng)管等均購自上海生工生物制劑有限公司；生化培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、凈化工作臺等由本實(shí)驗(yàn)室自行提供。

1.2 方法

1.2.1 菌液制作

將試驗(yàn)用菌株接種于腦心浸液肉湯上，搖床培養(yǎng)18 h，再轉(zhuǎn)至血平板培養(yǎng)基培養(yǎng)。挑取典型菌落接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基再培養(yǎng)18 h后取出，將菌液用馬丁肉湯培養(yǎng)基按10倍法稀釋至107～109CFU/m1，備用。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)

試驗(yàn)采用平皿藥敏打洞法[4]，即用滅菌移液槍取供試菌30μ1于平板培養(yǎng)基上，并用玻璃刮涂布均勻，然后用直徑為6mm的打孔器均勻打孔，每板5孔，去除孔內(nèi)瓊脂并用少量營養(yǎng)瓊脂封閉孔底。將供試藥液加于孔中，以滿而不溢為宜，并做好標(biāo)記。試驗(yàn)做3次重復(fù)。置4℃冰箱中作用1 h后取出.于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h，觀察結(jié)果。結(jié)果判定：抑菌圈直徑小于10mm為耐藥，10～15mm為中度敏感，大于15mm為高度敏感。

1.2.3 最小抑菌濃度測定

試驗(yàn)分組及抑菌試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)見表1方法。試驗(yàn)組，先在每個(gè)空白試管中加入1.0m1的馬丁肉湯培養(yǎng)基，然后在第一管中加入1.0m1的試驗(yàn)藥物，逐次采用試管二倍法[5]稀釋，即按1：2、1：4、1：8……1：1024稀釋。至第10管棄去1.0m1，然后在每管中加入25u1試驗(yàn)菌液。置于37℃搖床培養(yǎng)18h。18h后取出各組別，根據(jù)藥物與試驗(yàn)菌反應(yīng)顯示的試管渾濁度，確定各種菌的最小抑菌濃度；陰性對照組只加培養(yǎng)基和藥物；陽性對照組只加培養(yǎng)基和菌液，空白對照組只加菌液。

表1　試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)菌液最終反應(yīng)濃度

禽巴氏桿菌、雞白痢沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌4種菌經(jīng)擴(kuò)菌后，濃度分別為4.0×107CFU/m1、5.0×109CFU/m1、7.0×108CFU/m1和8.0×108CFU/m1。

2.2 藥敏試驗(yàn)測定結(jié)果

結(jié)果顯示，該消毒劑對大腸桿菌的敏感性最高，抑菌圈直徑平均為18mm，對雞白痢沙門氏菌、禽巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌等中度敏感，抑菌圈直徑平均分別為11mm、12mm和12mm。詳見表2。

表2　消毒劑藥敏試驗(yàn)測定結(jié)果

2.2 消毒劑最小抑菌濃度（MIC）

消毒劑最小抑菌濃度結(jié)果見表2。由表2知，該消毒劑對禽巴氏桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度為62.5mg/m1，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為31.3mg/m1。

表3　消毒劑最小抑菌濃度結(jié)果

說明：“-”代表藥物與菌液作用后試管澄清，無菌；反之“+”代表渾濁，仍有菌生長

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)貿(mào)易的全球化的發(fā)展，動(dòng)物疾病流行也呈現(xiàn)全球化特點(diǎn)，一些新的疾病的流行給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。由于新型傳染病疫苗的研究需要較長周期，因此預(yù)防控制新型傳染病只能通過加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和注重消毒等預(yù)防措施來實(shí)現(xiàn)。這種形勢下，研究一種或多種新型、高效、廣譜、安全的消毒藥顯得十分必要[6]。然而，目前市場上常用的消毒劑，大多為化學(xué)性消毒劑，在使用過程中，對人類、畜禽和環(huán)境均存在不同程度的毒副作用。因此，在保證有效殺滅病原微生物，切斷病原傳播的前提下，減少化學(xué)性消毒劑的使用頻率，尋找安全、高效的消毒劑替代品，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

植物源中草藥是我國的國粹，許多中草藥具有良好的抑菌和抗病毒功效[7]。中草藥抗菌、抗病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)是活性成分，目前已知的多為生物堿、甙類、鞣酸類、酮類、醛類、酚類及揮發(fā)油等，如小檗堿、白頭翁素、穿心蓮內(nèi)酯、苯甲酸、山梨酸、桉油精等。中草藥的許多活性成分均能直接抑制或殺滅病原微生物，誘生干擾素，改變細(xì)菌、真菌細(xì)胞膜的通透性，干擾病毒復(fù)制所需的有些酶。因此，利用我國豐富的中草藥資源，積極研究和開發(fā)綠色新型中草藥消毒劑，將具有廣闊的市場前景。

中草藥消毒劑的研究和應(yīng)用歷史研究，早在唐代孫思邈的《備急千金要方》中就有記載，有太乙流金散（雄黃、雌黃、礬石、鬼箭羽等）燒煙熏之可以辟瘟氣的說法。后來，隨著中醫(yī)藥理論的推進(jìn)研究和實(shí)踐，后人已逐漸熟知掌握了單味和多味中草藥藥性藥效，并且在此基礎(chǔ)上，形成了瘟病的審癥求因理論，將病原定性為濕熱和溫?zé)醿纱箢?，消毒、殺菌?yīng)以芳香化濁避穢、清熱解毒為原則[8]。因此，艾葉、蒼術(shù)、大青葉、蘆薈、香薷草、苦參等中藥材被廣泛應(yīng)用于臨床多種致病病原的熏蒸消毒，如胡曉蕙[9]等對一種主要由野菊花、厚樸、蒼術(shù)、金銀花、牛蒡子、辛夷等制成的水提劑預(yù)防上呼吸道感染進(jìn)行觀察。結(jié)果表明“中空劑”有體外直接抗CBV3、CBV5的作用，從而滅活或減少空氣 中的病原微生物，可降低上呼吸道感染發(fā)病率；王淑云[10]等研究的由藿香、艾葉、蒼術(shù)、石決明、佩蘭等12味藥物組成的復(fù)方消毒劑，應(yīng)用結(jié)果表明：該消毒劑對醫(yī)院手術(shù)室、病房、治療室等場地具有較好的消毒效果，殺菌率達(dá)86.1%，對培養(yǎng)菌株金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的空間和表面消毒，均具有較強(qiáng)的殺菌作用。

本試驗(yàn)使用的中草藥消毒劑，其主要成分為蘆薈、苦楝、麻籽、皂莢、苦參根、大青葉、柑橘果皮、金錢松根皮等多種植物中提取有效成分，其中苦楝、麻籽、苦參根、大青葉等含有豐富的生物堿和植物多酚等活性成分，能夠抑制細(xì)菌和真菌等生物酶合成過程，迅速穿透和崩解細(xì)菌細(xì)胞壁，還能干擾某些腸道和呼吸道寄生病毒的RNA合成；蘆薈和皂莢分別含有蘆薈苷和皂苷，是優(yōu)良的表面活性去污因子，具有良好的滲透能力和去污能力。其水溶液在振搖時(shí)能產(chǎn)生大量持久的蜂窩狀泡沫，可以乳化油脂，有效去除污垢，在實(shí)際消毒過程中，能夠有效地防止有機(jī)質(zhì)對其他中草藥消毒效果的破壞；柑橘果皮和金錢松根皮含有去味因子，有較好的芳香去味效果。因此，本試驗(yàn)使用的消毒劑方劑，符合中醫(yī)的君臣佐使理論，復(fù)配設(shè)計(jì)合理。

通過本次體外抑菌試驗(yàn)證明，該消毒劑對大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、禽巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌等主要家禽致病菌有很好的抑制作用，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示4種菌的抑菌圈直徑分別為18mm、11mm、12mm和12mm；對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為31.3mg/m1，對禽巴氏桿菌和雞白痢沙門氏菌的最小抑菌濃度為62.5mg/m1。MIC測定結(jié)果與國內(nèi)邱園園[11]、王金和[12]等報(bào)道相似，但與李淑紅[13]、邱真真[14]等試驗(yàn)結(jié)果略有差異，可能與菌株不同菌型、抗藥性，以及中草藥藥材來源不同所致的藥效差異有關(guān)。

[1] 朱國強(qiáng).家禽細(xì)菌性疾病的思考[J].中國禽業(yè)導(dǎo)刊，2010，24 （15）：23-24.

[2] 程古月，郝海江，謝書宇，等.抗生素替代品的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（35）：97-106.

[3] 周德綱.獸用消毒劑研究進(jìn)展[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2014，24（5）：42-44.

[4] 田艷玲.藥敏試驗(yàn)方法在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2014，12（11）：31-32.

[5] 黃通旺，李永忠.試管稀釋法篩選β-內(nèi)酰胺酶的中草藥研究[J]廣東醫(yī)學(xué)，1998，12（1）：17-18.

[6] 洪學(xué).畜禽消毒劑應(yīng)用[J].四川畜牧獸醫(yī)，2007，12（7）：6-8.

[7] 梁劍平，張應(yīng)祿，李滋睿，等.獸用中草藥研究開發(fā)展望[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2005，24（4）：15-17.

[8] 胡曉蕙，蔣連泓，高嵐，等.中藥空氣消毒劑預(yù)防上呼吸道感染的觀察[J].浙江中醫(yī)雜志，2002，12（6）：269-270.

[9] 王淑云，何飛舟，羅坤華，等.中藥速效空氣消毒片對醫(yī)院空氣消毒效果的臨床觀察[J].中華護(hù)理雜志，1997，32（1）：37-38.

[10] 高慧，張思超.中藥消毒劑研究現(xiàn)狀[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，28（6）：476-478.

[11] 邱園園，韓金潭，孫翠翠，等.“香連”溶液干膏劑體外抑菌試驗(yàn)研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（3）：708-713.

[12] 王金和，邊傳周，金登宇，等.中草藥消毒劑殺菌效果的研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，42（11）：39-41

[13] 李淑紅，王京仁，成鋼，等.8種中草藥對豬大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，24（22）：131-135.

[14] 邱真真，王莎莎，魯曉晴，等.新型復(fù)方中草藥消毒劑的消毒效果及其殺菌機(jī)理研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，24 （17）：17-20.

竇新紅，研究員

北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)（中獸醫(yī)）北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（Kf2016032）