劉雯雯 馬妍 魏巖 潘建章 ?，? 方群

摘 要 本文根據(jù)2015年國際微全分析系統(tǒng)會(huì)議上的報(bào)告內(nèi)容，分別從微流控芯片技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用角度，討論了當(dāng)前微流控芯片領(lǐng)域發(fā)展的熱點(diǎn)和趨勢。

關(guān)鍵詞 微流控芯片； 國際微全分析系統(tǒng)會(huì)議； 研究熱點(diǎn)趨勢； 綜述

1 引 言

微流控芯片（Microfluidic chip）技術(shù)起源于分析化學(xué)領(lǐng)域的微全分析系統(tǒng)（Miniaturized total analysis systems， MicroTAS）概念，目前其研究和應(yīng)用范圍已經(jīng)逐漸擴(kuò)大至生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、組織工程、材料科學(xué)等重要領(lǐng)域，成為其核心研究工具。國際微全分析系統(tǒng)會(huì)議（International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences，簡稱為MicroTAS Conference）是目前全世界規(guī)模最大、綜合性最強(qiáng)、參與人數(shù)最多的微流控芯片研究領(lǐng)域?qū)W術(shù)會(huì)議。首屆MicroTAS會(huì)議于1994年在荷蘭的恩斯赫德（Enschede）舉辦，參與人數(shù)約200人。2000年之前，MicroTAS會(huì)議每隔2年分別在北美和歐洲舉辦一次。2000年之后，MicroTAS會(huì)議變?yōu)槟甓刃詴?huì)議，以三年為一個(gè)循環(huán)，每年分別在歐洲、北美洲和亞太地區(qū)的城市輪流舉辦，迄今已成功舉辦了19屆。近5年會(huì)議的參與人數(shù)均超過千人，參會(huì)人員的學(xué)科背景也涵蓋化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程、微機(jī)電系統(tǒng)、材料學(xué)、物理學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)等眾多學(xué)科。

目前，MicroTAS會(huì)議由位于美國北卡羅來納州的化學(xué)和生物微系統(tǒng)學(xué)會(huì)（The Chemical and Biological Microsystems Society， CBMS）負(fù)責(zé)管理，職能包括會(huì)議舉辦城市、會(huì)議主席和技術(shù)委員會(huì)的選定等。MicroTAS會(huì)議論文的審稿程序較為嚴(yán)格，通常中稿率為60%～70%。自2003以來歷屆的MicroTAS會(huì)議的論文集可在Lab Chip期刊網(wǎng)站（http：//www.rsc.org/Publishing/Journals/LC/news/uTAS_Abstracts_2003_to_Present.asp）下載。MicroTAS會(huì)議鼓勵(lì)年輕人參與學(xué)術(shù)交流，學(xué)術(shù)報(bào)告中除了少數(shù)的大會(huì)報(bào)告和主題報(bào)告的報(bào)告人為資深科學(xué)家外，大量的口頭報(bào)告人均為年輕研究人員。會(huì)議日程中每天均安排專門的、長時(shí)間的墻報(bào)交流部分。鼓勵(lì)微流控技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化，為廠商和與會(huì)者提供了充分的交流機(jī)會(huì)以促進(jìn)微流控公司的儀器和技術(shù)推廣。

2015年MicroTAS會(huì)議（MicroTAS 2015）于10月25～29日在韓國慶州市召開。大會(huì)分設(shè)8個(gè)主題：微/納流控基礎(chǔ)、微/納米工程、傳感器/執(zhí)行器/檢測方法、集成化微流控系統(tǒng)、細(xì)胞分離與分析、細(xì)胞/模式生物/器官芯片、診斷/治療/轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的應(yīng)用、分離/反應(yīng)及其它應(yīng)用。會(huì)議收到論文摘要共計(jì)1008篇，其中99篇摘要被選作口頭報(bào)告，616篇摘要被選作墻報(bào)展示（中稿率74.4%）。如表1所示，根據(jù)其研究主題統(tǒng)計(jì)，位于前三的分別為：傳感器/執(zhí)行器/檢測方法、細(xì)胞/模式生物/器官芯片細(xì)胞分離與分析。這表明了新型傳感和檢測技術(shù)仍然是微流控領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。以人體芯片（Human on a chip）為最終目的的器官集成芯片（Organs on a chip ）研究異軍突起，以循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離鑒定為代表的細(xì)胞分析受到更多的關(guān)注，表明了微流控應(yīng)用研究的重心已經(jīng)深入生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，成為其重要的研究平臺(tái)技術(shù)。此外，集成化微流控系統(tǒng)的稿件排名，表明便攜化、家用化的分析儀器仍然是微流控領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

2 微流控基礎(chǔ)技術(shù)

2.1 液滴微流控（多相微流控）技術(shù)

近年來，液滴微流控技術(shù)因其在單分子/單細(xì)胞分析，高通量、高效生化反應(yīng)和篩選的研究中所展現(xiàn)出的巨大應(yīng)用潛力而獲得快速發(fā)展，已成為新一代微流控技術(shù)的典型代表，并逐漸發(fā)展成為新的研究領(lǐng)域——多相微流控（Multiphase microfluidics）技術(shù)。多相微流控技術(shù)是指利用多相微流體的物理化學(xué)特性和尺度效應(yīng)，在微系統(tǒng)中進(jìn)行多相微功能單元（微液滴、微顆粒或微氣泡等）的生成、操控、反應(yīng)、分析和篩選。液滴作為一種典型的多相微功能單元，可作為微型反應(yīng)器，體積一般在pL級(jí)至nL級(jí)，生成速率可達(dá)1000液滴/s以上，具有限制擴(kuò)散、加速混合、提高傳熱和傳質(zhì)效率等優(yōu)點(diǎn)。此外，微通道中的液滴被其不互溶相包裹，有效降低了微通道表面對液滴內(nèi)物質(zhì)的吸附，減少了交叉污染。目前，液滴微流控的研究主要集中在多步驟液滴操控技術(shù)的研究以及液滴技術(shù)在高通量篩選中的應(yīng)用。

利用液滴系統(tǒng)中油相優(yōu)異的間隔能力，Park等[1]發(fā)展了一種基于多孔板和液滴陣列的自動(dòng)化免疫分析系統(tǒng)。反應(yīng)液（含免疫磁性微球）、洗脫液、以及顯色底物液滴分別置于多孔板的微孔中，微孔以微通道相連通。包被特異性抗體的免疫磁性微球在外界磁場驅(qū)動(dòng)下，借助微通道順序經(jīng)過反應(yīng)液、清洗液、以及酶反應(yīng)底物液滴，依次完成免疫分析所需的反應(yīng)、清洗、檢測的步驟，實(shí)現(xiàn)了高通量、自動(dòng)化的酶聯(lián)免疫分析。該系統(tǒng)可在1 h內(nèi)完成32個(gè)樣品的免疫分析測定，并顯著降低了試樣消耗。該方法成功用于合成β淀粉樣蛋白的定量分析，樣品消耗量降低至10

SymbolmA@ L， 檢出限為15 pg/mL。

Serra等[2]將磁鑷集成在聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）芯片微通道側(cè)邊，微通道內(nèi)則順序通入攜有磁性微球的樣品液滴、清洗液滴及反應(yīng)液液滴。通過程序控制磁鑷的開關(guān)，樣品液滴中的磁性微球在磁力作用下被固定在磁鑷上，經(jīng)過清洗除去多余物質(zhì)后，再被釋放進(jìn)入反應(yīng)液液滴中進(jìn)行反應(yīng)。該方法用于提取總RNA中的mRNA，并定量測定了乳腺癌細(xì)胞的HER2基因表達(dá)。

對不同尺寸的液滴進(jìn)行分選在單細(xì)胞分析和高通量篩選中具有重要意義。常規(guī)液滴分選方法一般只能進(jìn)行一級(jí)的尺寸分選。文獻(xiàn)[3，4]報(bào)道了一種基于線型軌道和點(diǎn)軌道技術(shù)的被動(dòng)型液滴多級(jí)分選方法。通過設(shè)計(jì)寬度不同的線型軌道，尺寸小的液滴則會(huì)一直保持在原有軌道中，尺寸較大的液滴則橫向跨越進(jìn)入相鄰較寬的軌道中，實(shí)現(xiàn)分選。在下一級(jí)的分選中，專門設(shè)計(jì)了點(diǎn)型軌道代替常規(guī)的線型軌道，實(shí)現(xiàn)液滴形狀的恢復(fù)，便于進(jìn)行下一次的分選。該方法可進(jìn)行三級(jí)液滴分選，可分選液滴尺寸范圍是29～48

隨著液滴系統(tǒng)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域的應(yīng)用，不少公司展出了液滴微流控相關(guān)的儀器，儀器功能涵蓋液滴生成、反應(yīng)、檢測等多個(gè)步驟。HahnSchikard公司利用離心力驅(qū)動(dòng)的流體聚焦微流控芯片來形成單分散的液滴，反應(yīng)后通過成像檢測實(shí)現(xiàn)計(jì)數(shù)分析。Dolomite Microfluidic公司則通過在油下順序吸取油相試劑油相的方法形成不同組分的試劑液滴，并通入芯片與其他液滴融合、反應(yīng)，用于微量的生化篩選中。

2.2 紙芯片

紙芯片是一種新興的微流控分析平臺(tái)，具有成本低、易攜帶、加工簡單、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)。紙芯片作為一次性使用的分析工具，在醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)控等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景。

Mosadegh等[5]采用具有多層結(jié)構(gòu)的紙芯片作為細(xì)胞培養(yǎng)的支架，用于癌細(xì)胞的三維培養(yǎng)和遷移測定（圖1）。該工作中，包含細(xì)胞和基質(zhì)膠的紙層位于中部，上下各堆疊層只含基質(zhì)膠的紙層。由于氧氣只能從頂部進(jìn)入，因此在堆疊的紙層中形成從高到低的氧氣濃度分布。多層紙芯片結(jié)構(gòu)能較好地模擬腫瘤微環(huán)境，而紙層的透氣性質(zhì)也便于研究氧氣梯度對腫瘤細(xì)胞的三維遷移性質(zhì)的影響。采用該方法研究了三維培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞向高濃度氧區(qū)域的快速遷移現(xiàn)象。

紙芯片作為一次性的生物傳感器受到廣泛的關(guān)注。Li等[6]在紙芯片上原位生長具有高比表面積的氧化鋅納米線，用于抗體的高效固定。并在芯片上集成了碳對電極和Ag/AgCl參比電極，建立了基于電化學(xué)阻抗譜的免疫分析方法，實(shí)現(xiàn)了高靈敏、無標(biāo)記的免疫分析。該方法的單次測定樣品消耗為3

SymbolmA@ L，檢測時(shí)間約20 min，對RabbitIgG的檢出限為60 fg/mL，比常規(guī)顯色檢測方法降低了100倍。

紙芯片中的樣品溶液在毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)下流動(dòng)，無需額外輔助驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)即可完成樣品的引入與反應(yīng)。然而，毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)方法難以進(jìn)行多步和復(fù)雜化的液體操控。Park等[7]通過在硝化纖維膜施加壓力的方法，構(gòu)建了具有不同流體阻力的紙芯片，用于多步免疫分析操作（圖2）。硝化纖維膜經(jīng)過加壓后，其多孔結(jié)構(gòu)緊縮，流體阻力增大，會(huì)阻止或延遲流體流動(dòng)。樣品經(jīng)一步浸漬法引入后，優(yōu)先流經(jīng)未加壓區(qū)域與捕獲抗體結(jié)合，并在檢測區(qū)域富集。由于流體的延遲，加壓區(qū)域上預(yù)先固定的信號(hào)增強(qiáng)試劑在結(jié)合和富集步驟之后到達(dá)檢測區(qū)域，信號(hào)得以放大。該加壓紙基芯片通過簡單的浸漬步驟，即可完成預(yù)設(shè)的多步操作，適合用于即時(shí)檢驗(yàn)領(lǐng)域。

除了常規(guī)的紙基材料，聚合物也可用于構(gòu)建紙芯片。Hansson等[8]采用多向紫外光刻技術(shù)，加工了具有不同密度、不同方向交聯(lián)多聚物微柱的紙芯片。結(jié)果顯示，高密度的多聚物微柱具有更高的毛細(xì)作用力，液體會(huì)優(yōu)先聚集在高密度區(qū)域。通過設(shè)計(jì)不同密度間隔的多聚物微柱，可將液體限制在特定區(qū)域，減少其向外周擴(kuò)散，便于后續(xù)生化試劑的加入。此外，聚合物紙芯片的透明性較高，可顯著增加信號(hào)強(qiáng)度，比常用的硝化纖維紙基提高了3倍。

2.3 3D打印

近年來發(fā)展迅速的3D打印技術(shù)，采用光固化立體造型、選擇性激光燒結(jié)、熔融沉積造型等加工方式，直接將計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)模型轉(zhuǎn)為實(shí)物，可在短時(shí)間內(nèi)高分辨地完成復(fù)雜結(jié)構(gòu)的加工，具有高效、簡單、易學(xué)的特點(diǎn)。

利用3D打印技術(shù)，可以一步加工出常規(guī)光刻或熱壓等方法難以加工的具有復(fù)雜立體結(jié)構(gòu)的微流控芯片。Olanrewaju等[9]使用3D打印技術(shù)代替SU8光刻技術(shù)，加工出微結(jié)構(gòu)陽模。然后PDMS倒模后得到含有觸發(fā)閥、止流突破閥、微通道以及不同深度腔室的PDMS芯片。在毛細(xì)作用驅(qū)動(dòng)下，預(yù)先加入的抗體標(biāo)記微球在通道腔室內(nèi)堆積。隨后樣品溶液、標(biāo)記抗體溶液、以及清洗溶液自發(fā)順序地突破閥門進(jìn)入通道內(nèi)與磁珠反應(yīng)，自動(dòng)化完成捕獲、標(biāo)記、清洗等步驟。該芯片成功應(yīng)用于直接定量檢測大腸桿菌O157：H7抗體。

Bula等[10]使用3D打印機(jī)加工了微反應(yīng)室、試劑儲(chǔ)存器、光學(xué)檢測流通池等模塊，搭建了一套低成本、集成化水質(zhì)監(jiān)控裝置，用于定量分析飲用水的殘留氯含量。3D打印技術(shù)顯著降低了整體儀器的成本，并結(jié)合RGB 3個(gè)波長LED進(jìn)行檢測矯正，減少了基線漂移和流體中氣泡的影響，對水中殘留氯的檢出限降低至15 μg/L。

3D打印技術(shù)也被應(yīng)用于模擬血管的研究。Chan等[11]利用3D打印技術(shù)加工了立體的管道支架，隨后通過模具澆筑、降解等方法形成海藻酸鈣的三維支架結(jié)構(gòu)，將其放在瓊脂糖溶液中，冷卻后裂解海藻酸，最后形成三維血管結(jié)構(gòu)。

除了常規(guī)的打印材料，3D打印也能打印三維的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Cho等[12，13]先利用聚合物材料構(gòu)筑了三維框架，再將活細(xì)胞、水凝膠、生長因子等同時(shí)置于特殊設(shè)計(jì)的打印機(jī)噴頭中。精確控制含細(xì)胞液體的沉積位置，實(shí)現(xiàn)層層的精確可控沉積，最后得到含活細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)（圖3）。

Dolomite Microfluidic等公司也展示了小型的用于微流控芯片加工的3D打印機(jī)，機(jī)器內(nèi)置多種微流控芯片構(gòu)型設(shè)計(jì)，便于用戶操作。展示的3D打印機(jī)大多選用成本低的熔融沉積造型方式進(jìn)行芯片加工，精度約在200

SymbolmA@ m。雖然目前3D打印精度比不上傳統(tǒng)光刻加工技術(shù)，但3D打印快速成型的優(yōu)點(diǎn)可為研究初期的探索實(shí)驗(yàn)節(jié)省時(shí)間。

2.4 檢測方法

隨著智能手機(jī)的廣泛應(yīng)用，其自帶的攝像頭逐漸被應(yīng)用于微流控系統(tǒng)的成像檢測中。同時(shí)，大量開源的手機(jī)應(yīng)用也便于科研工作者自行編寫應(yīng)用程序，進(jìn)行成像結(jié)果的現(xiàn)場分析。Shan等[14]結(jié)合單細(xì)胞液滴培養(yǎng)與基于智能手機(jī)成像的濁度檢測，發(fā)展了一種便攜式、低成本的細(xì)菌快速定量分析系統(tǒng)（圖4）。該工作將待測細(xì)菌分散至大量液滴中，每個(gè)液滴至多含有一個(gè)細(xì)菌。在后續(xù)培養(yǎng)中，液滴里的細(xì)菌會(huì)增殖，含有細(xì)菌的液滴濁度增加，而空白液滴依舊澄清。通過智能手機(jī)對鋪展液滴成像檢測、內(nèi)置應(yīng)用程序分析圖像濁度，即可快速計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)目。

圖4 結(jié)合液滴內(nèi)單細(xì)胞培養(yǎng)與智能手機(jī)成像技術(shù)的細(xì)菌定量分析方法示意圖

Fig.4 Schematic workflow of droplet singlecell culture coupled with smartphone imaging for bacteria quantification[14]

Kim等[15]發(fā)展了一種操作簡單、便攜式的芯片熒光成像檢測裝置，并結(jié)合微流控捕獲和尺寸篩選芯片，進(jìn)行水中寄生蟲的快速檢測。該檢測裝置主要由集成有激發(fā)濾光片的CMOS圖像傳感器、基于發(fā)光二極管陣列的明場照明裝置和基于大功率LED的熒光激發(fā)模塊組成。通過在微通道中加工有不同寬度微槽的方法，實(shí)現(xiàn)基于尺寸選擇的寄生蟲捕獲和分選。最后，利用明場成像和熒光檢測，實(shí)現(xiàn)對水中3種不同寄生蟲的檢測和定量。

Swyer等[16]結(jié)合數(shù)字微流控與平面微線圈技術(shù)，發(fā)展了一種基于高場強(qiáng)核磁共振譜的微量樣品檢測方法，并用于自動(dòng)化和實(shí)時(shí)化學(xué)反應(yīng)的監(jiān)控。該工作將數(shù)字微流控裝置固定在平面微線圈上方，程序化操控nL級(jí)樣品液滴在平面微線圈上的移動(dòng)、混合、和反應(yīng)。該方法分別檢測了木糖液滴與硼酸鹽液滴混合前后的核磁共振譜，并實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)產(chǎn)物的生成過程。

Liszkaa等[17]報(bào)道了基于拉曼光譜技術(shù)的高分辨單細(xì)胞成像方法。為了降低拉曼光譜技術(shù)的高檢測背景， 提高成像靈敏度和分辨率，設(shè)計(jì)了以石英材料為基底的PDMS芯片，用于匹配高數(shù)值孔徑和短工作距離的激光聚焦透鏡。PDMS芯片的透氣性質(zhì)適合細(xì)胞的長時(shí)間培養(yǎng)和檢測。利用該技術(shù)，可進(jìn)行無標(biāo)記成像檢測單個(gè)乳腺癌細(xì)胞，獲得細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)組分二維空間分布信息。

3 微流控芯片的應(yīng)用趨勢

3.1 細(xì)胞分離/捕獲

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells， CTCs）是從原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤病灶上脫落并進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞。CTCs的定量分析在研究癌癥轉(zhuǎn)移進(jìn)程、癌癥早期診斷、以及藥物療效快速評(píng)估中起著重要作用。然而，CTCs在循環(huán)血中的數(shù)量極少，10 mL全血中約有800億個(gè)紅細(xì)胞和5億個(gè)白細(xì)胞，CTCs數(shù)量僅僅有1～100個(gè)。因此，如何高效快速地分離和捕獲全血中的CTCs是CTCs研究的關(guān)鍵。哈佛大學(xué)Toner在本次會(huì)議上作了題目為“未來癌癥病人的管理：尋找稀有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的探索（Future of managing cancer patients： A quest to find rare circulating tumor cells）”的大會(huì)報(bào)告[18]。介紹了其研究組利用微流控技術(shù)分離全血中CTCs的最新研究進(jìn)展，以及在細(xì)胞、基因水平上對被捕獲的CTCs進(jìn)行了后續(xù)分析研究，包括單個(gè)CTC培養(yǎng)、CTCs上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化研究、單細(xì)胞RNA測序等。該研究組自2007年開始進(jìn)行基于微流控芯片技術(shù)的CTCs相關(guān)研究，已發(fā)展了三代CTCs捕獲芯片。第一代芯片是利用上皮細(xì)胞粘附因子（EpCAM）抗體修飾高密度微柱陣列進(jìn)行高效的CTCs捕獲。第二代的Herringbone chip在EpCAM抗體捕獲的基礎(chǔ)上，在通道中增加工人字形渦流生成微結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)CTC與包被EpCAM抗體表面的相互作用，提高捕獲效率。第三代的CTCiChip則利用慣性聚焦、磁分離等物理方法來除去白細(xì)胞和紅細(xì)胞，只保留CTCs。該方法解決了部分CTCs低表達(dá)或者不表達(dá)EpCAM，無法采用抗體法進(jìn)行捕獲的問題，顯著提高了樣品處理通量。CTCiChip已成功用于分離男性前列腺癌血液樣本中的CTCs，并對捕獲得到的CTCs進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序分析。研究揭示了前列腺癌的耐藥機(jī)制與非經(jīng)典Wnt信號(hào)相關(guān)[19]。該研究組還發(fā)展了一種名為ClusterChip的芯片技術(shù)，利用尺寸分離的方法直接從全血中高效分離CTCs多細(xì)胞群體，同時(shí)保持了CTCs多細(xì)胞群體的完整性。Lim等[20]介紹了一種基于尺寸選擇的離心力驅(qū)動(dòng)CTCs分離裝置。該裝置的主體是8

SymbolmA@ m的多孔聚碳酸酯膜，離心力驅(qū)動(dòng)反應(yīng)室中的全血樣品經(jīng)過多孔膜過濾后進(jìn)入廢液池。由于CTCs尺寸大于白細(xì)胞和紅細(xì)胞，且剛性較大，因此會(huì)被保留在膜上，而白細(xì)胞和紅細(xì)胞會(huì)被濾掉進(jìn)入廢液池，實(shí)現(xiàn)快速、高效地從全血中分離CTCs。

Kim等[21]發(fā)展了一種基于電激活雙孔陣列技術(shù)（Electroactive doublewell array， EdWA）的單細(xì)胞捕獲和分析方法，對單細(xì)胞的捕獲率可達(dá)95%。芯片中每個(gè)單細(xì)胞操控單元由一個(gè)基于介電操控的細(xì)胞捕獲孔以及一個(gè)基于PDMS薄膜密封的反應(yīng)孔組成。在介電力的作用下，單個(gè)細(xì)胞被固定至捕獲孔中。然后利用PDMS薄膜形變，將反應(yīng)腔室封閉形成包含有單個(gè)細(xì)胞的獨(dú)立反應(yīng)器。最后，提高電壓直接進(jìn)行細(xì)胞裂解來釋放細(xì)胞內(nèi)組分。該技術(shù)被應(yīng)用于研究單個(gè)PC3細(xì)胞中的βgal酶活性差異。

Dura等[22]介紹了在芯片單個(gè)微結(jié)構(gòu)中高通量捕獲兩種不同的細(xì)胞，形成細(xì)胞對的方法，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；脑趩渭?xì)胞層次上研究免疫應(yīng)答級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程（圖5）。該芯片在每個(gè)捕獲結(jié)構(gòu)上都設(shè)計(jì)了雙向的捕獲微腔，兩次改變流向后，即可形成成對細(xì)胞，細(xì)胞成對成功率約在40%～85%。該工作研究了成對OTI CD8T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞的免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括鈣離子信號(hào)釋放、磷酸化、以及下游效應(yīng)等功能。

圖5 單細(xì)胞免疫應(yīng)答級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程研究：（a）微流控芯片照片， （b）細(xì)胞捕獲微結(jié)構(gòu)的SEM圖， （c）細(xì)胞引入及配對的4步操作， （d）小鼠淋巴細(xì)胞在捕獲結(jié)構(gòu)中的相差及熒光疊加圖像[22]

Fig.5 Immune cell pairing： （a） Image of the device， （b） SEM of the cell trap array showing the backside single cell traps， and frontside twocell traps and support pillars， （c） Fourstep cell loading and pairing protocol and （d） Overlaid phase contrast and fluorescence images showing primary mouse lymphocytes stained with DiI （red） and DiO （green） membrane dyes paired in the traps[22]

對白細(xì)胞和紅細(xì)胞的定量檢測有助于對白血病、貧血和炎癥等疾病進(jìn)行診斷，然而現(xiàn)有檢測儀器成本較高，限制了其在經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)和國家中的使用。Ahn等[23]發(fā)展了一種基于水躍（Hydraulic jump）現(xiàn)象的白細(xì)胞和紅細(xì)胞的分離方法。該工作通過在微通道中集成不同高度和寬度的微腔來誘發(fā)水躍現(xiàn)象。由于白細(xì)胞和紅細(xì)胞存在尺寸差異，通過精確調(diào)整驅(qū)動(dòng)流速，兩種細(xì)胞在微腔區(qū)域存在不同的捕獲和釋放行為，從而實(shí)現(xiàn)分離，分離效率為80%。

3.2 單細(xì)胞分析

由于細(xì)胞間存在異質(zhì)性，基于群體細(xì)胞的研究會(huì)掩蓋潛在的分子機(jī)制。單細(xì)胞分析有助于深入了解細(xì)胞異質(zhì)性，對癌癥研究、術(shù)后療效評(píng)估、免疫應(yīng)激研究等具有重要意義。

單細(xì)胞研究常用熒光染料標(biāo)記目標(biāo)分子進(jìn)行成像分析，但部分小分子如離子、氨基酸等代謝物很難尋找到合適的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。Türkcan等[24]發(fā)展了一種基于輻射發(fā)光的分析方法，研究單個(gè)腫瘤細(xì)胞對氟標(biāo)記脫氧葡萄糖（FDG）的攝取情況。輻射發(fā)光基于細(xì)胞中的FDG在衰變時(shí)會(huì)放射出β粒子，從而激發(fā)CdWO4基底輻射出可被顯微檢測的可見光。該方法結(jié)合了液滴系統(tǒng)通量高、無交叉污染的特點(diǎn)。將攝入FDG的單細(xì)胞包裹至液滴中，并利用微孔陣列固定液滴進(jìn)行長時(shí)間的追蹤與成像分析， 應(yīng)用于研究不同攝入時(shí)間下乳腺癌單細(xì)胞中的FDG含量分布，以及野生型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白敲除型結(jié)腸癌單細(xì)胞中的FDG含量分布。

Zhu等[25]報(bào)道了利用電化學(xué)阻抗譜實(shí)時(shí)監(jiān)控單個(gè)裂殖酵母細(xì)胞的動(dòng)態(tài)成長過程（圖6）。在集成加工了平面電極、培養(yǎng)通道、負(fù)壓通道及細(xì)胞捕獲結(jié)構(gòu)的微流控芯片上，借助負(fù)壓作用，將單個(gè)桿狀的裂殖酵母細(xì)胞固定在捕獲結(jié)構(gòu)上，培養(yǎng)通道內(nèi)通入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。由于裂殖酵母細(xì)胞是通過細(xì)胞端部的延長進(jìn)行生長，其長度變化會(huì)影響原有通道的阻抗。利用共聚焦成像的方法得到細(xì)胞長度與阻抗的線性關(guān)系。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測電阻抗信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞生長情況的持續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)控。

Wheeler等[26]發(fā)展了一種基于數(shù)字微流控的免疫細(xì)胞化學(xué)方法，應(yīng)用于單細(xì)胞信號(hào)通路的研究。該芯片系統(tǒng)為間隔一定高度的雙層平板裝置，其中上層平板表面加工有親水區(qū)域用于單個(gè)細(xì)胞固定，下層為用于液滴操控的數(shù)字微流控裝置。不同的試劑液滴順序經(jīng)過細(xì)胞固定區(qū)域，依次完成配體刺激、清洗、固定、免疫染色的步驟。最后將上層平板取下，使用共聚焦熒光定量檢測信號(hào)分子的活化程度。該方法成功用于定量研究不同濃度、不同時(shí)間血小板源性生長因子（PDGF）對成纖維細(xì)胞中PDGFRAkt信號(hào)應(yīng)答通路的影響。

Kang等[27]介紹了一種單細(xì)胞水平的蛋白質(zhì)免疫印跡分析方法，能在4 h內(nèi)同時(shí)定量分析1000個(gè)細(xì)胞中特定蛋白，并將其應(yīng)用于乳腺癌細(xì)胞的抗藥性研究（圖7）。該工作在凝膠涂層芯片上集成了關(guān)鍵的蛋白質(zhì)印跡法步驟，包括單細(xì)胞捕獲、細(xì)胞裂解、梯度PAGE膠蛋白電泳分離、光致交聯(lián)固定蛋白、熒光標(biāo)記抗體雜交，以及成像檢測。該方法用于定量檢測乳腺癌細(xì)胞中HER2蛋白、相互作用蛋白（HER3和MUC4）、以及抗藥性相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示HER2在20%乳腺癌細(xì)胞中過量表達(dá)，也觀察到由于其表達(dá)差異性帶來的信號(hào)通路的差異激活現(xiàn)象[28]。

3.3 器官芯片

器官芯片（Organs on a chip）指利用微流控系統(tǒng)對微流體、細(xì)胞及其微環(huán)境的靈活操控能力，在微流控芯片上構(gòu)建可模擬器官功能的集成微系統(tǒng)，為體外藥物篩選和生物醫(yī)學(xué)研究提供更接近人體真實(shí)生理和病理?xiàng)l件的，成本更低的篩選和研究模型。從簡單細(xì)胞三維培養(yǎng)、多細(xì)胞共培養(yǎng)開始，器官芯片已經(jīng)向著結(jié)構(gòu)和功能都更接近真實(shí)器官的方向發(fā)展。目前研究工作大多是利用芯片微結(jié)構(gòu)、生物材料輔助、多種細(xì)胞共同培養(yǎng)等方法模擬某個(gè)器官或組織，如骨骼、血管、皮膚[29]，或者更進(jìn)一步模擬出肝小葉的形狀、小腸絨毛的褶皺、肺器官的氣液界面等。

最后一天的大會(huì)報(bào)告由橫浜市立大學(xué)Taniguchi博士[30]介紹了利用誘導(dǎo)人多潛能干細(xì)胞（iPSCs）重建功能性器官的研究工作，該方法模擬胚胎發(fā)育過程中肝臟形成的過程，即肝祖細(xì)胞從前腸內(nèi)胚層分層，形成肝芽，肝芽的迅速血管化。將由iPSCs分化形成的肝細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，3種細(xì)胞自組裝， 3天后形成直徑約4～5 mm的三維肝芽，這一變化依賴于肝細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互協(xié)調(diào)作用。將形成的肝芽移植到小鼠體內(nèi)，48 h內(nèi)即可與宿主血管連接，形成的血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步促進(jìn)肝芽在宿主體內(nèi)的持續(xù)生長，并能夠執(zhí)行肝臟的部分功能，如清除血液中的毒素、產(chǎn)生人類特異性代謝物等。該研究組還將這一器官芽（Organ bud）移植方法用于胰腺和腎臟器官的構(gòu)建中，并有望進(jìn)一步應(yīng)用于組織重建和器官移植[31]。在上述研究中雖尚未使用微流控技術(shù)，但其研究思路和方法無疑對器官芯片的研究具有重要的指導(dǎo)和借鑒意義。

Jusoh等[32]發(fā)展了一種用于仿生模擬骨骼中血管生成過程的微流控芯片。該工作利用纖維蛋白和骨礦物質(zhì)羥基磷灰石納米晶體混合物來形成人工骨骼，并將其置于人臍靜脈上皮細(xì)胞通道和肺成纖維細(xì)胞通道中間的微通道中。在肺成纖維細(xì)胞釋放的血管內(nèi)皮生長因子的誘導(dǎo)下，人臍靜脈上皮細(xì)胞進(jìn)入人工骨骼通道中形成三維血管結(jié)構(gòu)。羥基磷灰石的納米晶體具有大量吸附血管內(nèi)皮生長因子并緩慢釋放的功能，對血管形成產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)研究了含有不同濃度羥基磷灰石的人工骨骼對血管生成的影響，結(jié)果顯示0.2%的濃度效果最好，血管深入人工骨骼的長度最長，三維結(jié)構(gòu)也最為豐富。

Xu等[33]利用微流控芯片技術(shù)，在細(xì)胞外基質(zhì)界面的兩側(cè)分別培養(yǎng)形成微血管內(nèi)皮細(xì)胞層和星形膠質(zhì)細(xì)胞層，建立了一種3D血腦屏障仿生系統(tǒng)（圖8）。通過測定內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接蛋白（鈣粘素），P糖蛋白和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等功能蛋白的表達(dá)升高，以及內(nèi)皮細(xì)胞層對熒光小分子的通透性，驗(yàn)證了該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)血腦屏障的功能。利用該芯片研究了血腦屏障對8種抗癌藥物的藥效的影響，結(jié)果顯示只有替莫唑胺能夠穿過血腦屏障，從而誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。該工作實(shí)現(xiàn)了高通量（16個(gè)）血腦屏障仿生系統(tǒng)的構(gòu)建，可用于研究藥物對腦癌的療效和不同癌細(xì)胞向腦遷移能力。

為了實(shí)現(xiàn)高通量的3D類器官的培養(yǎng)和后續(xù)分析，Allbritton等[34]發(fā)展了一種基于微孔陣列芯片的腸隱窩類器官的高通量培養(yǎng)方法。實(shí)驗(yàn)研究了濃度梯度、不同表面性質(zhì)對細(xì)胞分化、隱窩類器官形成的影響。在磁性聚苯乙烯“木筏”陣列培養(yǎng)形成腸隱窩后，利用“木筏”分離和磁力吸引的方法收集載有選定腸隱窩的“木筏”，對特定的腸隱窩進(jìn)行后續(xù)分析，并實(shí)現(xiàn)了單個(gè)類器官的基因表達(dá)分析。

Kinoshita等[35]發(fā)展了一種可耐較高壓力的仿生血管組織的加工方法。該方法使用氯化鋇粉末摻雜的PDMS加工微通道芯片，將海藻酸鈉和平滑肌細(xì)胞的混合物通入微通道，即可在通道表面形成一層平滑肌細(xì)胞和鋇海藻酸鈉層。最后通入內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞在海藻酸鈉水凝膠表面生長成為單細(xì)胞層。最終形成了外層為平滑肌細(xì)胞、內(nèi)層為內(nèi)皮細(xì)胞的三維血管結(jié)構(gòu)。

3.4 即時(shí)檢驗(yàn)和臨床診斷

即時(shí)檢驗(yàn)（Pointofcare testing， POCT）以便捷、快速的現(xiàn)場檢驗(yàn)為主要目標(biāo)，具有檢測時(shí)間短、成本低、操作簡便等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于臨床監(jiān)護(hù)、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。微流控芯片技術(shù)具有低消耗、高效、微型化、集成化等優(yōu)點(diǎn)，非常適合用于POCT裝置的研制。

Priye等[36]利用無人機(jī)構(gòu)建了一種便攜、低成本的核酸快速分析平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)所需試劑與儀器設(shè)備通過無人機(jī)定點(diǎn)輸送至樣品采集區(qū)域。樣品采集后借助無人機(jī)的槳葉旋轉(zhuǎn)完成前處理、離心等操作?；跓釋α鳒囟妊h(huán)原理，無人機(jī)搭載的小型反應(yīng)器可在恒溫加熱條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，具有加熱裝置簡單、能量損耗少的優(yōu)點(diǎn)。最后，利用智能手機(jī)搭建的熒光檢測裝置，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測分析PCR結(jié)果。該分析平臺(tái)成功用于埃博拉病毒、葡萄球菌、登革熱等傳染性疾病的檢測。無人機(jī)技術(shù)具有操作簡便、機(jī)動(dòng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，特別適用于資源匱乏地區(qū)和野外環(huán)境中的即時(shí)檢驗(yàn)。而且隨著無人機(jī)的普及與相關(guān)診斷技術(shù)的發(fā)展，預(yù)計(jì)其會(huì)較快應(yīng)用于實(shí)際現(xiàn)場分析中。

Magro等[37]介紹了一種基于紙芯片和等溫逆轉(zhuǎn)錄重組聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增（RTRPA）技術(shù)的RNA擴(kuò)增和檢測方法，并應(yīng)用檢測埃博拉病人實(shí)際樣本的即時(shí)檢驗(yàn)。該工作中，采取冷凍法預(yù)先將反應(yīng)試劑固定在紙芯片，樣品加入至紙芯片的反應(yīng)區(qū)域與試劑混合。利用RTRPA和實(shí)時(shí)熒光定量檢測樣品中埃博拉病毒RNA含量。該方法已經(jīng)應(yīng)用于埃博拉病人樣本的檢測，取得了較好結(jié)果。

Duvall等[38]基于DNA介導(dǎo)磁珠聚集現(xiàn)象，建立了一種低成本、可明場成像檢測的病原體診斷方法。在磁場作用下，長鏈DNA會(huì)觸發(fā)磁珠聚集。當(dāng)存在待測病原體時(shí)，其環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)生成的短鏈DNA片段優(yōu)先與磁珠結(jié)合，從而抑制磁珠聚集。結(jié)合手機(jī)成像分析磁珠聚集程度，能夠快速進(jìn)行病原體的現(xiàn)場檢測。該方法已成功應(yīng)用于多種病原體的診斷，包括甲型流感病毒、沙門氏菌、以及艱難梭菌。

研究白細(xì)胞的趨藥性異常有助于糖尿病的診斷。Hou等[39]介紹了一個(gè)集成的微流控裝置用于全血中中性粒白細(xì)胞分選和趨藥性分析。指尖血經(jīng)收集后進(jìn)入直通道中，由于Fahraeus效應(yīng)，紅細(xì)胞會(huì)軸向遷移，而白細(xì)胞和血小板會(huì)遷移進(jìn)側(cè)邊細(xì)通道中。在趨藥性分析通道中，嗜中性粒細(xì)胞被捕獲在修飾抗體CD66b的通道表面。最后通過實(shí)時(shí)成像的方法研究嗜中性粒細(xì)胞在藥物梯度的遷移特性，實(shí)現(xiàn)對糖尿病的診斷。

4 微流控芯片領(lǐng)域的展望

我們相信，隨著微流控芯片研究的深入及其在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中的應(yīng)用擴(kuò)展，在不久的將來，微流控芯片技術(shù)將在以下幾個(gè)方面獲得突破。（1）基于液滴微流控的超高通量篩選技術(shù)將對新藥研發(fā)、生物工程酶的改進(jìn)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究起到關(guān)鍵的推進(jìn)作用；（2）微流控技術(shù)將成為單細(xì)胞分析的核心工具，促進(jìn)單細(xì)胞基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)的發(fā)展，從單細(xì)胞層次揭示新的分子機(jī)制、信號(hào)傳導(dǎo)和代謝通路；（3）以數(shù)字PCR芯片和循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC捕獲芯片為代表的新型“液體活檢”診斷工具，將可能突破當(dāng)前癌癥早期診斷和術(shù)后療效評(píng)估存在的技術(shù)瓶頸，成為新的癌癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；（4）器官芯片和人體芯片技術(shù)的繼續(xù)發(fā)展，可能在芯片上構(gòu)建用于藥物研究的仿生人體，從而顯著降低當(dāng)前新藥研究成本和研發(fā)周期；（5）微流控技術(shù)將在即時(shí)檢驗(yàn)中扮演著越來越關(guān)鍵的作用，在傳染病檢測、環(huán)境監(jiān)察、食品安全檢測、農(nóng)殘檢測、家用醫(yī)療儀器等方面具有強(qiáng)大的市場前景。

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31 Takebe T， Enomura M， Yoshizawa E， Kimura M， Koike H， Ueno Y， Matsuzaki T， Yamazaki T， Toyohara T， Osafune K， Nakauchi H， Yoshikawa H Y， Taniguchi H. Cell Stem Cell， 2015， 16： 556-565

32 Jusoh N， Oh S， Kim S， Ahn J， Lee K H， Kim J， Jeon N L. Proceedings of the 19th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences（MicroTAS 2015）， 25-29 October， 2015， Gyeongju， Korea 35-37

33 Xu H， Zhang M， Wang L， Qin J H. Proceedings of the 19th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences（MicroTAS 2015）， 25-29 October， 2015， Gyeongju， Korea 161-163

34 Allbritton N L， Wang Y， Gunasekara D B， Ahmad A A， Magness S T， Sims C E. Proceedings of the 19th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences（MicroTAS 2015）， 25-29 October， 2015， Gyeongju， Korea 94-96

35 Kinoshita K， Iwase M， Yamada M， Seki M. Proceedings of the 19th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences（MicroTAS 2015）， 25-29 October， 2015， Gyeongju， Korea 135-137

36 Priye A， Wong S， Ugaz Vr M. Proceedings of the 19th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences（MicroTAS 2015）， 25-29 October， 2015， Gyeongju， Korea 8-10

37 Magro L， Jacquelin B， Lafaye P， Manuguerra J C， Monti F， Sakuntabhai A， Vanhomwegen J， Tabeling P. Proceedings of the 19th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences（MicroTAS 2015）， 25-29 October， 2015， Gyeongju， Korea 281-283

38 DuVall J A， Cabaniss S T， Angotti M L， Borba J C， Moore J H， Shukla N， Kendall M M， Landers J P. Proceedings of the 19th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences（MicroTAS 2015）， 25-29 October， 2015， Gyeongju， Korea 185-187

39 Hou H W， Tay H M， Boehm B O. Proceedings of the 19th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences（MicroTAS 2015）， 25-29 October， 2015， Gyeongju， Korea 100-101

Current Research Focus and Development Trend in

Microfluidic Chip Field：

A Perspective from the International MicroTAS 2015 Conference

LIU WenWen， MA Yan， WEI Yan， PAN JianZhang， ZHU Ying*， FANG Qun*

（Institute of Microanalytical Systems， Department of Chemistry， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）

Abstract This paper briefly introduced the international conference on miniaturized systems of microfluidic chip for chemistry and life sciences （MicroTAS conference）. Current research focus and trend in the research field of microfluidic chip revealed from the conference were discussed， including the technology of dropletbased microfluidics， paperbased chip， 3D printing， and chip detection， as well as the application of microfluidic chips in cell separation/capture， single cell analysis， organsonachip， and pointofcare testing/clinical diagnosis.

Keywords Microfluidic chip； International conference on miniaturized systems for chemistry and life sciences； Research focus； Development trend； Review

（Received 18 February 2016； accepted 9 March 2016）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21435004， 21227007， 21475117） and the Natural Science Foundation of Zhejiang Province， China （No. LY14B050001）