孫威 陳雨晴 羅國(guó)安 張敏 章弘揚(yáng) 王月榮 胡坪

摘 要 微流控芯片是細(xì)胞體外培養(yǎng)的重要平臺(tái)，基于該平臺(tái)所發(fā)展的器官芯片技術(shù)更因其能夠模擬人體器官的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及功能而受到重視。本文從不同器官的角度介紹了近年來(lái)器官芯片技術(shù)在構(gòu)建人體生理學(xué)模型、藥物研發(fā)及毒理學(xué)研究中的應(yīng)用，并對(duì)器官芯片技術(shù)的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 微流控芯片； 器官芯片； 細(xì)胞； 人體器官； 綜述

1 引 言

自2011年美國(guó)總統(tǒng)奧巴馬宣布啟動(dòng)由NIH、FDA和國(guó)防部聯(lián)合設(shè)立的人體芯片（Humanonchip）[1]專項(xiàng)以來(lái)[2]，在全世界范圍內(nèi)掀起了人體芯片的研究熱潮。所謂人體芯片，就目前的研究水平而言，更確切地說(shuō)是芯片仿真人體器官系統(tǒng)（Organonachip systems），也稱為器官芯片（Organsonchips）[3]，是一種利用微加工技術(shù)，在微流控芯片上制造出能夠模擬人類器官的主要功能的仿生系統(tǒng)[4]。除了具有微流控技術(shù)微型化、集成化、低消耗的特點(diǎn)[5]外，器官芯片技術(shù)能夠精確地控制多個(gè)系統(tǒng)參數(shù)，如化學(xué)濃度梯度[6]、流體剪切力[7]、以及構(gòu)建細(xì)胞圖形化培養(yǎng)[8]、組織組織界面[9]與器官器官相互作用[10]等，從而模擬人體器官的復(fù)雜結(jié)構(gòu)、微環(huán)境和生理學(xué)功能。

人體生理學(xué)研究是生命科學(xué)研究的重要部分，傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)模式在研究人體病理生理學(xué)方面已經(jīng)取得了許多成就，但是這些簡(jiǎn)單的模式難以體現(xiàn)人體組織器官?gòu)?fù)雜的生理功能[11]，因此研究人員常使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)代替體外培養(yǎng)模式。然而，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也存在周期長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn)，且動(dòng)物模型常常不能預(yù)測(cè)人體對(duì)于各種藥物的響應(yīng)[12]。器官芯片概念的提出，正是為了解決動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的諸多不足，希望在芯片上建立更加真實(shí)的生理模型，并能成為一種仿生、高效、節(jié)能的生理學(xué)研究及藥物開(kāi)發(fā)工具。

經(jīng)過(guò)近幾年來(lái)的快速發(fā)展，研究人員已經(jīng)在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了眾多人體器官的構(gòu)建，如芯片肝、芯片肺、芯片腸、芯片腎、芯片血管、芯片心臟以及多器官芯片等。不僅如此，知名研究單位和制藥公司之間的合作已使器官芯片步入了實(shí)用階段。據(jù)報(bào)道，荷蘭生物技術(shù)公司Mimetas研發(fā)了一種芯片腎，并與幾家制藥公司達(dá)成了應(yīng)用合作協(xié)議將其用于藥物篩選[13]。另外，強(qiáng)生公司也計(jì)劃利用哈佛大學(xué)wyss生物工程研究所隸屬Emulate公司的人體血栓仿真芯片系統(tǒng)進(jìn)行藥物試驗(yàn)，并利用肝芯片測(cè)試藥物的肝毒性[14]。

2 器官芯片的設(shè)計(jì)理念

細(xì)胞的生長(zhǎng)需通過(guò)各種復(fù)雜的外環(huán)境與內(nèi)環(huán)境的協(xié)同作用共同完成。因此在建立體外生理學(xué)模型時(shí)需要考慮外界環(huán)境參數(shù)的真實(shí)性[15]。將微流控技術(shù)與微加工、細(xì)胞生物學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的器官芯片技術(shù)在對(duì)外界環(huán)境參數(shù)的控制中具有其他技術(shù)難以比擬的能力，通過(guò)產(chǎn)生流體剪切力、機(jī)械應(yīng)力、生化濃度梯度等理化刺激，細(xì)胞能夠響應(yīng)這些刺激而發(fā)生自組裝，展現(xiàn)更加真實(shí)的生理學(xué)功能，因而在體外生理學(xué)模型建立中具有特殊的優(yōu)勢(shì)[16]。

（1） 產(chǎn)生流體剪切力 流體的流動(dòng)會(huì)產(chǎn)生剪切力，人體內(nèi)每時(shí)每刻都存在著流體的流動(dòng)，而傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)卻無(wú)法給與系統(tǒng)剪切力。微流控技術(shù)能夠通過(guò)微泵灌流實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，這有利于穩(wěn)定地給予細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并及時(shí)將廢物排出，且相比于靜態(tài)培養(yǎng)，細(xì)胞所處的動(dòng)態(tài)環(huán)境與體內(nèi)更為相似。此外，灌流培養(yǎng)產(chǎn)生的流體剪切力對(duì)于人體的部分生理學(xué)功能如腎的重吸收而言必不可少[17]。

（2）提供動(dòng)態(tài)的機(jī)械應(yīng)力 人體內(nèi)存在著與生命活動(dòng)相關(guān)的壓力，如血壓、肺部壓力、骨骼壓力等。這種穩(wěn)態(tài)壓力對(duì)于維持機(jī)體的生理學(xué)功能如組織形成、細(xì)胞的分化甚至是腫瘤的形成具有重要的作用[18]。微流控技術(shù)能夠利用彈性多孔膜制造周期性的機(jī)械應(yīng)力，例如將細(xì)胞培養(yǎng)于多孔膜上，利用外界作用力使多孔膜發(fā)生形變從而模擬部分生理功能，如肺的呼吸、腸道蠕動(dòng)以及心臟收縮等。

（3）形成濃度梯度 由于在微尺度下，流體主要以層流形式運(yùn)動(dòng)，這有利于在通道中產(chǎn)生各種類型的濃度梯度[19]。以濃度梯度作為驅(qū)動(dòng)的各種生化信號(hào)對(duì)于許多生理過(guò)程如細(xì)胞遷移、分化、免疫反應(yīng)以及癌癥的轉(zhuǎn)移等起著關(guān)鍵的作用[20]。微流控技術(shù)能夠通過(guò)改變流速與通道尺寸，并利用微閥、微泵技術(shù)或獨(dú)特的通道設(shè)計(jì)等實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的、三維的生化濃度梯度，從而模擬人體內(nèi)各種復(fù)雜的生理學(xué)過(guò)程[21]。此外，多通道的濃度梯度的實(shí)現(xiàn)為芯片上藥物的高通量篩選提供了可能性。

（4）實(shí)現(xiàn)細(xì)胞圖案化培養(yǎng) 人體的組織不是由單一的細(xì)胞堆疊而成，而是需要多種細(xì)胞有序的排列，通過(guò)復(fù)雜的相互作用形成功能化的整體。微流控技術(shù)對(duì)細(xì)胞具有超強(qiáng)操控能力，模板法[22]、表面修飾[23]、電化學(xué)法[24]、層流[25]、微柱結(jié)構(gòu)[26]等都有助于實(shí)現(xiàn)在芯片上的細(xì)胞圖案化。這對(duì)構(gòu)建具有一定復(fù)雜幾何結(jié)構(gòu)的體外生理學(xué)模型大有裨益，同時(shí)能夠?yàn)檠芯考?xì)胞細(xì)胞相互作用、細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)相互作用提供一個(gè)理想的平臺(tái)。

3 器官芯片的研究進(jìn)展

3.1 芯片肝

肝臟是人體內(nèi)最重要的藥物代謝器官，藥物的肝毒性研究是新藥開(kāi)發(fā)的重要內(nèi)容。傳統(tǒng)靜態(tài)二維細(xì)胞培養(yǎng)模式下的肝細(xì)胞由于缺失與細(xì)胞外基質(zhì)的聯(lián)系，很快就會(huì)失去肝功能[27]，且它們?nèi)狈Τ掷m(xù)的灌流，不能理想地模擬生物微環(huán)境，而利用微流控技術(shù)與組織工程學(xué)能夠使具有肝功能的細(xì)胞自組裝，從而保持部分肝功能?，F(xiàn)有的芯片肝大多著眼于在芯片上建立肝臟的部分生理學(xué)模型，如膽小管、肝小葉、肝血竇模型等，并且利用這些模型進(jìn)行藥物篩選及毒理學(xué)研究。例如，在早期的研究中，Lee等[28]設(shè)計(jì)了一種仿內(nèi)皮細(xì)胞間隙結(jié)構(gòu)的芯片并在其中培養(yǎng)原代肝細(xì)胞，培養(yǎng)液于間隙外部進(jìn)行灌流培養(yǎng)，如圖1所示。這是首次在芯片上建立的肝血竇模型，具有高度滲透性的內(nèi)皮間隙結(jié)構(gòu)能夠?qū)⑺鳡罱Y(jié)構(gòu)中的原代肝細(xì)胞與外部血竇樣區(qū)域分離，但又能夠進(jìn)行物質(zhì)交換。在缺乏外基質(zhì)的條件下細(xì)胞能夠存活7天，在藥物扶他林的作用下，細(xì)胞在短時(shí)間（4 h）內(nèi)幾乎沒(méi)有顯示毒性，但在較長(zhǎng)時(shí)間（24 h）作用下發(fā)生死亡，表明此模型中的肝細(xì)胞具有生理活性。該研究為之后芯片肝模型的建立奠定了基礎(chǔ)。Ho等[24]利用介電泳產(chǎn)生的放射狀電場(chǎng)梯度，將肝細(xì)胞與上皮細(xì)胞圖案化排列在一個(gè)圓形PDMS芯片上，成功模擬了肝小葉結(jié)構(gòu)。在隨后的研究中，該課題組改進(jìn)了此模型，設(shè)計(jì)了“蜂巢”形狀的仿肝小葉介電泳陣列，并研究了細(xì)胞細(xì)胞相互作用，結(jié)果表明，肝小葉結(jié)構(gòu)能夠有效增加CYP1A1酶的活性。Hegde 等[29]制造了一個(gè)雙層芯片，通過(guò)多孔PET膜將通道分隔，并通過(guò)上層通道持續(xù)灌流培養(yǎng)下層通道中的膠原和纖連蛋白夾心的大鼠原代肝細(xì)胞，在芯片上建立了肝細(xì)胞“三明治”培養(yǎng)法。經(jīng)超過(guò)兩星期的培養(yǎng)，肝細(xì)胞能夠形成膽小管結(jié)構(gòu)，并實(shí)現(xiàn)了一定的肝功能。

與現(xiàn)有的體外肝臟模型相比，芯片肝的主要優(yōu)勢(shì)在于能夠在微米尺度形成具有部分肝功能的肝細(xì)胞簇，從而建立更加接近人體形態(tài)學(xué)的肝模型，并能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持肝臟特異性功能[30]。由于微流控技術(shù)具有高內(nèi)涵篩選的潛力，如何實(shí)現(xiàn)芯片肝的多參數(shù)、大通量的快速分析將成為研究人員下一步的研究重點(diǎn)。

3.2 芯片腎

腎臟是人體重要的排泄器官，對(duì)維持體內(nèi)滲透壓與自穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。腎臟的基本功能單元是腎單位，能夠通過(guò)生成尿液借以清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及廢物，并且通過(guò)重吸收功能保留水分及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[31]。對(duì)于腎單位功能的影響因素中，流體剪切力的影響非常重要，它能夠改變腎臟細(xì)胞的功能與形態(tài)，并與某些疾病如多囊性腎病有密切關(guān)系。Jang等[32]設(shè)計(jì)了一個(gè)雙層芯片模擬腎近球小管結(jié)構(gòu)，并在系統(tǒng)中引入1 dyn/cm2的流體剪切力。芯片由多孔彈性膜分為兩層，在上層通道貼膜培養(yǎng)人原代近端腎小管上皮細(xì)胞。在流體剪切力作用下，細(xì)胞的白蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和葡萄糖重吸收能力能夠分別達(dá)到Transwell實(shí)驗(yàn)的2倍與3.5倍，充分證明了流體剪切力對(duì)于構(gòu)建腎臟生理學(xué)模型的重要性。研究人員通過(guò)此芯片腎測(cè)試了順鉑的細(xì)胞毒性并與傳統(tǒng)的Transwell培養(yǎng)進(jìn)行了對(duì)比[33]，在下層流體中定量（100 μmol）加入順鉑溶液，灌流作用24 h，引起細(xì)胞死亡，檢測(cè)乳酸脫氫酶活性，同時(shí)使用VFITC與PI染色法檢測(cè)細(xì)胞活率，結(jié)果表明，在相同條件下，芯片腎中細(xì)胞活率大于Transwell培養(yǎng)。

在腎臟病理生理學(xué)方面，Zhou等[34]在一個(gè)圓形十二通道的芯片上研究了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化引起的腎間質(zhì)纖維化。將人近端腎小管上皮細(xì)胞置于恒定流速的血清蛋白中，觀察到細(xì)胞出現(xiàn)了間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變，且在加入C3a補(bǔ)體后也能得到同樣的結(jié)果，而在高溫滅活的血清中并沒(méi)有觀察到此現(xiàn)象的發(fā)生，這為研究這一病理過(guò)程提供了一個(gè)新的視角。Wei等[35]設(shè)計(jì)了一個(gè)單層管狀通道的微流控芯片，在管壁上培養(yǎng)單層的人腎小管上皮細(xì)胞（HK2），通過(guò)加入含有CaCl2與Na3PO4的HBSS緩沖液模擬了腎磷酸鈣結(jié)石的生成，首次在芯片上建立了體外腎結(jié)石模型并具有成為此疾病模型的潛力。

除了PDMS材料，水凝膠材料也成功應(yīng)用于腎生理學(xué)模型的建立，Mu等[36]通過(guò)水凝膠鍵合技術(shù)將兩塊水凝膠拼接在一起，形成兩個(gè)平行的三維微脈管網(wǎng)絡(luò)，建立了腎單元的生理模型，可在不同的水凝膠通道中培養(yǎng)不同的細(xì)胞，如 MDCK細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）細(xì)胞，并通過(guò)水凝膠的傳質(zhì)作用實(shí)現(xiàn)腎單元被動(dòng)擴(kuò)散的模擬。此水凝膠結(jié)構(gòu)能夠在芯片上建立更加復(fù)雜的質(zhì)量運(yùn)輸?shù)纳韺W(xué)腎模型，增加芯片腎的多樣性與復(fù)雜性。

3.3 芯片腸

腸是消化管中最長(zhǎng)的一段，也是消化功能最重要的一段。大部分藥物都是通過(guò)口服進(jìn)入人體，口服藥物須經(jīng)過(guò)小腸進(jìn)入血液循環(huán)，因此研究藥物經(jīng)腸道細(xì)胞的吸收成為了藥物篩選的重要步驟[37]。小腸壁上的絨毛使得小腸擁有巨大的表面積，從而達(dá)到快速吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用，所以芯片上小腸絨毛形態(tài)學(xué)的建立對(duì)研究腸功能具有重要的意義。Sung等[22]通過(guò)激光燒蝕、PDMS軟光刻技術(shù)，并使用水凝膠作為模板，首次在芯片上構(gòu)建了“梳子”狀3D水凝膠結(jié)構(gòu)以模擬人的腸道絨毛結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與人腸絨毛的形狀與分布密度接近，長(zhǎng)度約450～500 μm。研究人員通過(guò)在水凝膠表面覆蓋一層人腸上皮細(xì)胞（Caco2）進(jìn)行細(xì)胞滲透率與跨膜電阻（TEER）的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于傳統(tǒng)2D模型，此模型更加接近人體實(shí)際情況。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)可在水凝膠結(jié)構(gòu)內(nèi)引入血管內(nèi)皮細(xì)胞從而制作更加復(fù)雜的生理學(xué)模型，并進(jìn)行藥物吸收實(shí)驗(yàn)。

腸道具有特殊的運(yùn)動(dòng)方式，包括分節(jié)收縮、腸道蠕動(dòng)和腸絨毛的運(yùn)動(dòng)，而腸道蠕動(dòng)在對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化及吸收中具有重要的作用。為了模擬人體腸道蠕動(dòng)，Kim等[38]設(shè)計(jì)了一個(gè)雙層PDMS芯片，通過(guò)彈性多孔膜將兩層通道分隔，在真空泵的作用下周期性的拉伸（0.15 Hz）該P(yáng)DMS膜以模擬人體腸道蠕動(dòng)的擴(kuò)張與收縮。同時(shí)，在膜上培養(yǎng)了Caco2細(xì)胞并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過(guò)周期性的伸縮，細(xì)胞能夠分化并形成人體腸道內(nèi)的腸絨毛結(jié)構(gòu)。更為重要的是，研究人員還將人腸道內(nèi)寄生的大腸桿菌與上皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果表明二者的共存能夠增加Caco2細(xì)胞的屏障功能。此研究實(shí)現(xiàn)了包括循環(huán)機(jī)械應(yīng)力、流體剪切力以及微生物共培養(yǎng)等多個(gè)生理學(xué)相關(guān)參數(shù)的控制，高度真實(shí)地反映了人腸道復(fù)雜的生理學(xué)狀況，并取得了一定的研究成果。此外，Esch等[39]在不同形狀的硅基質(zhì)陣列上固定一層SU8多孔膜，隨后利用二氟化氙將硅基質(zhì)除去，得到一層三維膜。在該膜上培養(yǎng)Caco2細(xì)胞并通過(guò)熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞能夠形成小腸絨毛結(jié)構(gòu)并分泌閉合蛋白，表明細(xì)胞之間能夠形成緊密連接。

雖然器官芯片技術(shù)對(duì)復(fù)雜的腸道生理學(xué)功能進(jìn)行了精確的模擬，但鮮有通過(guò)芯片腸對(duì)藥物吸收能力進(jìn)行研究。Imura等[40]制作了一個(gè)由多孔膜分隔的雙層芯片腸并測(cè)定了環(huán)磷酰胺和熒光黃的吸收率。因此，在已有的腸模型基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)藥物吸收的測(cè)定應(yīng)成為下一步的研究方向。

3.4 芯片肺

肺是人的呼吸器官，肺泡是肺部氣體交換的主要部位，也是肺的功能單位。肺泡由一層單層上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)層的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，具有復(fù)雜的生理結(jié)構(gòu)。因此，傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)模式難以對(duì)肺的生理模型進(jìn)行準(zhǔn)確模擬，而微流控技術(shù)因其對(duì)流體流量及芯片尺寸的精確控制、持續(xù)的流體灌輸以及持續(xù)的氣體交換能力為建立體外肺模型與肺的病理學(xué)研究提供了一個(gè)強(qiáng)有力的平臺(tái)。Huh等[41]構(gòu)建了一個(gè)雙層芯片肺以模擬人的呼吸過(guò)程，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，該芯片分為上下兩層，上層為氣體通道，下層為液體通道，中間由一個(gè)多孔彈性的PDMS膜將其分隔，膜的上側(cè)培養(yǎng)置于氣液界面的人肺泡上皮細(xì)胞，下側(cè)則是浸潤(rùn)在動(dòng)態(tài)流體環(huán)境中的血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而模擬人肺泡毛細(xì)血管屏障；同時(shí)在通道的左右兩側(cè)存在兩個(gè)與真空泵連接的側(cè)通道，通過(guò)有規(guī)律的真空條件變化（0.25 Hz）引起PDMS膜發(fā)生形變以模擬人呼吸時(shí)肺泡壁的擴(kuò)張和收縮，而這在傳統(tǒng)的體外模型中是難以實(shí)現(xiàn)的。更重要的是，該模型能夠通過(guò)在氣道引入炎癥刺激物，并在液體通道加入中性粒細(xì)胞引起系統(tǒng)的生理學(xué)響應(yīng)，并用于納米毒性的研究。隨后的工作中，通過(guò)引入白細(xì)胞介素2，研究人員成功建立了基于微流控芯片的肺水腫病理學(xué)模型[42]。

肺泡壁僅由一層上皮細(xì)胞組成，容易受到損傷而導(dǎo)致破裂?；谖⒘骺仄脚_(tái)的肺上皮細(xì)胞的損傷模型有剪切力模型、機(jī)械拉伸模型以及兩種作用力同時(shí)具備的模型[43]。例如Huh等[44]設(shè)計(jì)了一個(gè)自動(dòng)化的芯片用于研究流體剪切力對(duì)細(xì)胞的損傷，芯片由上下兩個(gè)流體通道構(gòu)成，通道由一個(gè)多孔聚酯膜分隔，下層通道通入液體，上層接種小氣道上皮細(xì)胞，同時(shí)注入液塞流，液塞流在流動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生流體剪切力，從而建立細(xì)胞損傷模型?；诖四Ｐ?，他們還成功設(shè)計(jì)了一種微流體肺氣道芯片[45]，模擬了呼吸道表面液體（ASL）淤積導(dǎo)致的液塞流對(duì)肺上皮細(xì)胞的損傷。研究表明，大量的細(xì)胞損傷發(fā)生在液塞流傳播過(guò)程，而表面活性物質(zhì)能夠有效防止細(xì)胞死亡，提示表面活性物質(zhì)可以作為包括急性呼吸窘迫綜合征等多種病癥的潛在治療手段。

雖然上述芯片肺模型已經(jīng)具有一定的生理學(xué)結(jié)構(gòu)，但是由于肺部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜和特殊性，現(xiàn)有的芯片肺模型仍相對(duì)簡(jiǎn)單。因此，在芯片上實(shí)現(xiàn)更多的肺部生理學(xué)結(jié)構(gòu)模擬，建立一個(gè)完整的芯片肺模型將成為研究人員研究的重點(diǎn)。

圖2 微流控芯片肺的結(jié)構(gòu)[41]

Fig.2 Structure of microfluidic lungonachip device[41]

3.5 芯片心臟

成熟的心肌細(xì)胞是一種高度極化的細(xì)胞，具有收縮性。心肌細(xì)胞的收縮性與其外界的物理化學(xué)環(huán)境存在著緊密的聯(lián)系，如流速、鈣離子濃度、基底物質(zhì)、電刺激等[46]。近幾十年來(lái)，研究人員致力于制造功能性心臟模型，并取得了許多重要的成果。但是這些模型的結(jié)構(gòu)、生理學(xué)結(jié)構(gòu)以及外部支持使其無(wú)法與微流控技術(shù)相結(jié)合。而微流控技術(shù)是在微觀尺度上利用對(duì)心臟組織的微操控獲得更加接近生理的形態(tài)學(xué)、電生理學(xué)以及收縮性數(shù)據(jù)。Grosberg等[47]在一塊彈性薄膜表面覆蓋一層心肌細(xì)胞薄片，通過(guò)施加電刺激研究心肌細(xì)胞的收縮性。此外，研究人員采用了實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析技術(shù)檢測(cè)裝置中腎上腺素的動(dòng)態(tài)變化，檢測(cè)范圍為10

Symbolm@@ 12～10

Symbolm@@ 4 mol/L。

心肌缺氧會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，從而引起心律失常、局部缺血和心力衰竭。Ren等[48]設(shè)計(jì)了一種微流控仿生芯片，用于模擬缺氧對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。該芯片利用兩列平行的微柱陣列構(gòu)造毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障，從而精確模擬了心肌組織的結(jié)構(gòu)功能。當(dāng)不同濃度的解偶聯(lián)劑FCCP作用于心肌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象，且與FCCP的濃度及作用時(shí)間存在一定相關(guān)性。Ca2+的調(diào)控是心肌細(xì)胞的主要特征功能之一，而在細(xì)胞急性缺氧時(shí)該功能會(huì)受到影響。為了研究在缺氧早期細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，Martewicz等[49]設(shè)計(jì)了一個(gè)能夠在線檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)態(tài)變化的芯片，通過(guò)快速改變芯片內(nèi)氧濃度模擬細(xì)胞急性缺氧，證明了缺氧可誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的可逆變化。

大多數(shù)基于微流控技術(shù)的心臟模型使用的是PDMS材料，但是PDMS不利于細(xì)胞在芯片上的粘附。為此，Annabi 等[50]使用了兩種細(xì)胞兼容的水凝膠GelMA與Metro分別覆蓋于PDMS通道表面，以促進(jìn)心肌細(xì)胞在芯片表面的粘附。與GelMA覆蓋的通道相比，Metro表面生長(zhǎng)的原代心肌細(xì)胞表現(xiàn)出了更好的粘附性與收縮性。

現(xiàn)有的器官心臟模型通過(guò)改變外界參數(shù)很好的體現(xiàn)了心肌細(xì)胞的收縮性，為了建立更加真實(shí)的心臟模型，更多因素如三維環(huán)境以及共培養(yǎng)模式應(yīng)成為研究的重點(diǎn)。此外，現(xiàn)階段在芯片上使用的細(xì)胞多為哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞，因此，下一階段研究尤其是藥物毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn)需要使用更多的人類細(xì)胞以獲得更加真實(shí)的結(jié)果。

3.6 芯片血管

血管是指血液流經(jīng)的一系列管道，是連接各個(gè)器官并實(shí)現(xiàn)器官之間物質(zhì)交換的重要部分，微血管網(wǎng)絡(luò)對(duì)維持新陳代謝以及組織微環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用。建立體外血管形態(tài)學(xué)與生理學(xué)模型能夠加快對(duì)微血管網(wǎng)絡(luò)這一復(fù)雜系統(tǒng)的病理生理學(xué)研究[51]。因此，芯片血管的建立對(duì)于研究體外器官間相互作用乃至“Humanonchip”構(gòu)建具有重要的意義。Kim等[52]設(shè)計(jì)了一個(gè)三維灌注式芯片，芯片由5個(gè)平行的通道組成，通道之間存在著微柱陣列將其分隔，但可以進(jìn)行物質(zhì)傳導(dǎo)，中心通道與最外側(cè)通道分別用于HUVECs與基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，其余通道用于灌流，通過(guò)基質(zhì)細(xì)胞分泌的促血管生成因子作用于HUVECs， 實(shí)現(xiàn)了芯片上的血管新生和血管再生。該芯片的主要優(yōu)點(diǎn)在于灌流式培養(yǎng)更加真實(shí)地反映了人體內(nèi)血管的形態(tài)學(xué)特征，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的屏障功能和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

人的血液處在不斷流動(dòng)的狀態(tài)，流體與血管壁之間能夠產(chǎn)生剪切力。研究剪切力對(duì)血管壁的作用在血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成、炎癥性血管疾病及腫瘤經(jīng)血管轉(zhuǎn)移等的病理學(xué)研究具有重要的意義[53]。Nguyen等[54] 設(shè)計(jì)了一種微流控人工血管，通過(guò)控制管內(nèi)流體的流動(dòng)方向及流速發(fā)現(xiàn)當(dāng)毛細(xì)管內(nèi)剪切力超過(guò)10 dyn/cm2時(shí)能夠引起血管出芽生成，從而提出了生物體內(nèi)潛在的血管密度自平衡機(jī)制。Zheng等[55]以I型膠原作為支架，在芯片中制造了一個(gè)三維結(jié)構(gòu)的微血管網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)加入生長(zhǎng)因子如VEGF，對(duì)HUVECs與血管周細(xì)胞的相互作用及血管生成進(jìn)行了研究。研究者在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中引入化學(xué)刺激如佛波酯來(lái)模擬血管對(duì)炎癥的響應(yīng)，結(jié)果表明化學(xué)刺激能夠?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞變?yōu)檠ㄇ盃顟B(tài)。此外，Wang等[56]合成了一種彈性的多孔透明纖維素人工血管，并將其植入三維膠原蛋白基質(zhì)構(gòu)建的微芯片中以模擬腫瘤粘附作用及經(jīng)血管的遷移。

由于微血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，在建立芯片血管模型時(shí)研究人員還需要考慮剪切力外的其他因素，如在系統(tǒng)中引入VEGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β[51]以及膽固醇等刺激對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的響應(yīng)，進(jìn)一步增加芯片血管的真實(shí)性。

3.7 多器官芯片

預(yù)測(cè)和評(píng)估人體對(duì)各種藥物的響應(yīng)，建立“Humanonchip”的重要步驟之一是將多個(gè)獨(dú)立的器官集成在一個(gè)芯片上。而肝臟代謝產(chǎn)生的毒素往往會(huì)引起其他器官毒性，因此，為了研究這種器官之間代謝作用的機(jī)理，肝細(xì)胞或組織常被用于與其他器官共同研究。Groothuis課題組[57]設(shè)計(jì)了一種由兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)腔串聯(lián)而成的灌流培養(yǎng)芯片，并在兩個(gè)培養(yǎng)腔內(nèi)均放置大鼠腸道與肝臟切片，模擬人體內(nèi)的首過(guò)代謝。通過(guò)在上游培養(yǎng)腔中加入膽汁分泌產(chǎn)物引起上游腸成纖維細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子，此生長(zhǎng)因子能夠?qū)е孪掠未?lián)的培養(yǎng)腔內(nèi)肝細(xì)胞活性下降，而單獨(dú)培養(yǎng)的肝細(xì)胞并沒(méi)有出現(xiàn)類似現(xiàn)象。Ramello 等[58]利用一個(gè)肝腎細(xì)胞共培養(yǎng)芯片實(shí)現(xiàn)了抗癌藥匹服平的腎毒性研究。首先在芯片上接種肝、腎細(xì)胞孵育24h，隨后在肝腎芯片上加入50 μmol匹服平培養(yǎng)液灌流培養(yǎng)72 h，并設(shè)置肝細(xì)胞與腎細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)體系作為對(duì)照，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量、Ca2+釋放量及細(xì)胞代謝物等指標(biāo)進(jìn)行分析實(shí)現(xiàn)毒性測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在肝腎共培養(yǎng)體系中，匹服平在肝細(xì)胞中代謝產(chǎn)生的具有腎毒性的氯乙醛導(dǎo)致了犬腎細(xì)胞下降30%，而單獨(dú)培養(yǎng)的肝、腎細(xì)胞體系中并沒(méi)有此現(xiàn)象。

人體結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性促使研究人員建立更加復(fù)雜的微流控多器官芯片系統(tǒng)。Zhang等[1]設(shè)計(jì)了一個(gè)多通道的三維微流控芯片，通過(guò)在不同的通道內(nèi)分別培養(yǎng)不同的細(xì)胞模擬人體內(nèi)的肝、肺、腎和脂肪組織，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β1在不同通道的濃度控制。Shuler課題組[10，59，60]利用多器官芯片對(duì)藥物藥代動(dòng)力學(xué)藥效動(dòng)力學(xué)（PKPD）進(jìn)行了多項(xiàng)研究。如Sung等[59]設(shè)計(jì)了一個(gè)如圖3所示的多層芯片，通過(guò)水凝膠三維培養(yǎng)3種不同的細(xì)胞株以模擬肝臟、腫瘤和骨髓結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)在系統(tǒng)中加入5氟尿嘧啶引起細(xì)胞代謝變化，與計(jì)算得到的5氟尿嘧啶的PKPD理論模型結(jié)果相符。在最近的研究中，Maschmeyer等[61]在一個(gè)多器官芯片上以十萬(wàn)分之一的比例縮小人的腸、肝、皮膚和腎，從而建立了多器官芯片模擬系統(tǒng)。此共培養(yǎng)體系能夠維持28天，細(xì)胞均保持高活性并能夠自發(fā)形成功能化的結(jié)構(gòu)并實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的自穩(wěn)態(tài)。

綜上可知，器官芯片的研究已涉及人體的主要器官。此外，在微流控芯片上還成功構(gòu)建了其它器官模型，如血腦屏障模型[8，62，63]、肌肉模型[64]、骨骼模型[65]、脾臟模型[66]、乳腺模型[67]、皮膚模型[68，69]等。

圖3 多器官微流控培養(yǎng)結(jié)構(gòu)[59]

Fig.3 A multiorgan microfluidic framework[59]

a.分層的多器官芯片原理圖； b. 組裝的芯片實(shí)體圖。

a. A schematic of layered multiorgan chip； b. A picture of the assembled device.

4 展 望

由于微流控技術(shù)能夠通過(guò)精密的微加工技術(shù)對(duì)芯片上微通道的尺寸、空間位置以及連接方式等進(jìn)行精確的控制；能夠使用各種新型的材料作為細(xì)胞生存的基底以及能夠提供持續(xù)的灌流培養(yǎng)模式，使其在體外細(xì)胞培養(yǎng)中有著無(wú)與倫比的實(shí)用性與潛力。隨著微加工技術(shù)與細(xì)胞三維培養(yǎng)相結(jié)合所誕生的器官芯片技術(shù)作為一種新型體外細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，在提出后即得到了廣泛重視和迅速發(fā)展。器官芯片技術(shù)旨在建立一個(gè)人工的仿生微環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)組織器官水平的模擬，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行人體生理學(xué)研究、藥物開(kāi)發(fā)以及其毒理學(xué)等相關(guān)研究。器官芯片技術(shù)能夠克服傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)模式與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的不足，它具有建立高度仿生的體外生理學(xué)模型的潛力，甚至可能影響以制藥工業(yè)為代表的部分產(chǎn)業(yè)的發(fā)展進(jìn)程。器官芯片最終目標(biāo)是將不同器官的細(xì)胞集成于單一芯片中，構(gòu)建更加復(fù)雜的多器官芯片模型甚至是人體模型，最終實(shí)現(xiàn)“Humanonchip”，為人體循環(huán)系統(tǒng)的研究以及藥物的藥代動(dòng)力學(xué)與藥效動(dòng)力學(xué)的建立提供了一個(gè)嶄新的平臺(tái)。

器官芯片技術(shù)目前還處在萌芽階段，仍有大量技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化方面的問(wèn)題需要解決：（1）開(kāi)發(fā)更加適合細(xì)胞培養(yǎng)的新材料。現(xiàn)有的芯片材料多為PDMS、聚碳酸酯等，它們具有良好的滲透性與生物相容性，因此在芯片細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛使用，然而PDMS被證明能夠吸附疏水性小分子，可能會(huì)減少有效的藥物濃度和活性并引起實(shí)驗(yàn)誤差。因此需要進(jìn)行表面化學(xué)改性，或者選擇其它代替材料。（2）使用更加可靠的人類細(xì)胞。下一代器官芯片將著眼于使用原代細(xì)胞與人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，這對(duì)于特異性疾病的研究、個(gè)體化醫(yī)療及新藥開(kāi)發(fā)具有重要意義。（3）由于芯片體積小，細(xì)胞容量低，因此需要開(kāi)發(fā)高靈敏度的檢測(cè)方法和裝置。只有在不影響細(xì)胞活力的情況下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞進(jìn)程與生物標(biāo)志物的準(zhǔn)確的實(shí)時(shí)檢測(cè)，才能充分發(fā)揮器官芯片技術(shù)的潛能。因此發(fā)展適合于芯片的電化學(xué)、光學(xué)、免疫學(xué)的檢測(cè)手段，如使用各類傳感器，同時(shí)設(shè)計(jì)更加標(biāo)準(zhǔn)化的芯片，使之與傳統(tǒng)的生物檢測(cè)手段相匹配，亦將成為研究的重點(diǎn)。相信隨著技術(shù)的發(fā)展以及研究的深入，器官芯片技術(shù)必將廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域的研究中。

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Organsonchips and Its Applications

SUN Wei1， CHEN YuQing1， LUO GuoAn2，3， ZHANG Min3， ZHANG HongYang1， WANG YueRong1， HU Ping*1

1（Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry， School of Chemistry and Molecular Engineering，

East China University of Science and Technology， Shanghai 200237， China）

2（Department of Chemistry， Tsinghua University， Beijing 10084， China）

3（Shanghai Key Laboratory of New Drug Design & Modern Engineering Center for TCM， School of Pharmacy，

East China University of Science and Technology， Shanghai 200237， China）

Abstract Microfluidic chips are significant platforms of cell culture in vitro. Microfluidic chipbased organsonchips technology has received attention because it can mimic the complex structures and functions of human organs. In this review， the recent advances of organsonchips technology in different organs are reported including the build of human physiological models， drug discovery and toxicology research. And the development of this technology is proposed.

Keywords Microfluidic chip； Organsonchips； Cell； Human organ； Review

（Received 26 October 2015； accepted 23 December 2015）

This work was supported by the National Science and Technology Major Project for Significant New Drugs Development（No. 2013ZX09507005）