何啟迪 黃丹萍 黃冠 陳纘光

摘 要 基因是人類的遺傳密碼，人類個(gè)體之間只有萬分之一的基因不相同，卻導(dǎo)致了人與人之間豐富的差異。了解這種差異對于科學(xué)研究具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。PCR是基因研究中常用的手段之一，但傳統(tǒng)PCR儀存在反應(yīng)時(shí)間長、能量消耗大、不便于集成與攜帶等缺陷，微流控技術(shù)與PCR結(jié)合可以有效縮小反應(yīng)體系，提高反應(yīng)效率，且易于集成化與微型化。本文按照微流控PCR芯片的結(jié)構(gòu)分類， 詳細(xì)介紹了微池型、連續(xù)流動(dòng)型PCR芯片，以及電泳、熒光、電化學(xué)和DNA雜交陣列等檢測方法，并在最后進(jìn)行了總結(jié)與展望。

關(guān)鍵詞 微流控； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 芯片； 綜述

1 引 言

2001年2月12日，中、美、日、德、法、英等國科學(xué)家和美國賽萊拉公司公布了人類基因組圖譜和初步分析結(jié)果[1]。這是人類對自身奧秘的探索史上一個(gè)重要的里程碑。研究結(jié)果顯示，人類99.99%的基因是相同的，僅萬分之一的不同基因造就了個(gè)體間豐富的差異。了解這種差異對于基礎(chǔ)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等方面研究都具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

在基因研究中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）是一種常用手段。PCR技術(shù)最先由Mullis等在1985年發(fā)明[2]，并獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)[3]。PCR的過程包括3個(gè)步驟：變性、退火、延伸，需要在高低中3個(gè)不同的溫度（高溫變性：90℃～95℃，低溫退火：55℃～60℃；中溫延伸：70℃～72℃）下進(jìn)行。除了反應(yīng)區(qū)域溫度的調(diào)節(jié)，實(shí)驗(yàn)中還涉及到反應(yīng)物、酶、DNA模板溶液體積的精準(zhǔn)測量，反應(yīng)體系的混合，溶液的驅(qū)動(dòng)和控制等。傳統(tǒng)的PCR儀器中的反應(yīng)是通過樣品槽反應(yīng)管樣品之間的熱傳遞實(shí)現(xiàn)的，存在反應(yīng)時(shí)間長、反應(yīng)體積大、能量消耗多、易產(chǎn)生副產(chǎn)物、不便于集成與攜帶等缺陷。

微流控（Microfluidics）是一門在μm～mm尺度下研究流體的處理與操控的技術(shù)[4]，集成化的微流控芯片還可以將采樣、稀釋、反應(yīng)、分離、檢測、分析等多個(gè)步驟融為一體，已廣泛用于化學(xué)、生物等各領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)室對于微流控芯片在化合物分離檢測[5]、藥物篩選[6]等方面的應(yīng)用均有研究。利用微流控芯片，傳統(tǒng)PCR儀存在的各種問題都有了解決的可能。例如：微小的反應(yīng)體系可以使熱傳遞更迅速，顯著提高擴(kuò)增速度，同時(shí)避免非特異性擴(kuò)增，提高反應(yīng)效率；全封閉的體系可以減少頻繁的手工操作引入的樣本污染和溶液損失；系統(tǒng)微型便攜，利于現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測等。

2 微流控PCR芯片

用于制作微流控芯片的材料有硅、玻璃、石英、金屬和有機(jī)聚合物如環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）和聚二甲基硅氧烷（PDMS）等[7]。其中，硅和玻璃具有良好的化學(xué)惰性和熱穩(wěn)定性，與硅相比，玻璃的機(jī)械強(qiáng)度更高，是制作PCR芯片的主要材料。PDMS生物相容性好，可塑性強(qiáng)，并且PDMS表面與很多材料表面都有很好的親和力，易于實(shí)現(xiàn)可逆封裝，可以用于制作生化分析器件[8]。但是PDMS的導(dǎo)熱系數(shù)小，散熱性差等特性在某些情況下不利于PCR反應(yīng)的進(jìn)行，可以與熱傳導(dǎo)性能好的玻璃形成混合芯片結(jié)構(gòu)，同時(shí)改善PCR芯片的散熱和光學(xué)性能。

除了利用軟光刻技術(shù)對微流體通道進(jìn)行微細(xì)精密的加工[9]， 還可使用熱壓法、注塑法和激光燒灼法等傳統(tǒng)方法以及3D打印等新興手段制作芯片。微通道封裝時(shí)，采用等離子表面處理或深紫外照射[10]后，迅速貼合，可以得到牢固和永久的封裝。

根據(jù)芯片的結(jié)構(gòu)差異可將PCR芯片分為靜止PCR與動(dòng)態(tài)PCR，或微池型PCR（Microchamber PCR， MCPCR）與連續(xù)流動(dòng)PCR（ContinuousFlow PCR， CFPCR）。微池型PCR的特點(diǎn)在于，反應(yīng)體系不流動(dòng)，通過芯片整體升溫降溫的循環(huán)來實(shí)現(xiàn)反應(yīng)；連續(xù)流動(dòng)PCR則由反應(yīng)液體循環(huán)流過不同溫區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。在連續(xù)流動(dòng)型PCR芯片中，反應(yīng)溶液沿著微通道在3個(gè)固定的溫度區(qū)連續(xù)流動(dòng)，3個(gè)溫度分別對應(yīng)高溫變性區(qū)、低溫退火區(qū)和中溫延伸區(qū)，在每個(gè)溫區(qū)的流動(dòng)時(shí)間和速度決定了反應(yīng)時(shí)間。每流過3個(gè)溫區(qū)為一次循環(huán)，PCR溶液按照所需的循環(huán)數(shù)依次流動(dòng)，最后完成整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)。

2.1 微池型PCR芯片

微池型PCR芯片是傳統(tǒng)PCR的微型化，有單反應(yīng)池[11～15]，液滴虛擬微池[16，17]及微池陣列[18～22]3種設(shè)計(jì)。 單反應(yīng)池結(jié)構(gòu)簡單，1993年由Northrup等[11]首次報(bào)道，他們在硅基質(zhì)上刻蝕出空腔，加入50 μL反應(yīng)液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Giordano等[12]在2001年采用聚酰亞胺材料制作單池PCR芯片（如圖1A所示），利用紅外加熱，在4 min內(nèi)完成了對長度為500 bp的DNA片段的擴(kuò)增。Neuzil等[16]采取以礦物油包裹PCR溶液的方式，形成了液滴虛擬微池來實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增（如圖1B所示），可以有效減少反應(yīng)溶液的揮發(fā)，他們設(shè)計(jì)的芯片能夠快速地升溫降溫，最后通過融解曲線分析和毛細(xì)管電泳兩種方法檢驗(yàn)純度。微池陣列是在單反應(yīng)池的基礎(chǔ)上增加反應(yīng)通量得到。Matsubara等[18]在一塊長3英寸、寬1英寸的硅片上刻蝕了1248個(gè)微孔，每個(gè)微孔容積為50 nL（如圖1C所示）。PCR反應(yīng)液用點(diǎn)樣儀加入每個(gè)微池，再用石蠟油密封。Cai等[22]則是將PCR反應(yīng)液通入芯片中，進(jìn)行預(yù)載入，之后通過芯片多層之間的滑動(dòng)使溶液進(jìn)入微室陣列中，最后分別進(jìn)行擴(kuò)增與成像，免去了頻繁加樣的繁瑣操作。微池型PCR的關(guān)鍵在于體系溫度的快速切換，需要優(yōu)化儀器的溫度控制來縮短循環(huán)時(shí)間，其次因?yàn)榉磻?yīng)體積微小，需要精密的加樣儀器或是利用微流控芯片結(jié)構(gòu)的特殊設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)高通量。

2.2 蛇形通道PCR芯片

蛇形通道PCR芯片由Kopp等[23]在1998年首次提出，蛇形通道PCR芯片的經(jīng)典形狀是平行式（如圖2A所示），隨后Schaerli等[24]在2009年開發(fā)出了輻射式排布的蛇形通道芯片，同時(shí)結(jié)合了液滴技術(shù)，將納升級的PCR反應(yīng)液包裹在油相之中，沿著通道在溫區(qū)間循環(huán)。Jiang等[25]在2014年同樣設(shè)計(jì)了一款輻射式通道的芯片（圖2B），利用太陽能加熱，并通過智能手機(jī)裝載的熒光檢測器檢測反應(yīng)的進(jìn)行。這種芯片的溫區(qū)一般以高溫中溫低溫的形式排布，加熱元件有Cu[24]、Pt[26]、Al[27]等金屬或是ITO[28， 29] （indium tin oxide，銦錫氧化物）電極等，為了提高芯片的溫度控制效率和3個(gè)溫區(qū)的精確控制，芯片還與溫度傳感器集成，并且通過熱隔離槽來降低溫區(qū)間的熱交換。雖然在一些特別的模板和引物條件下，PCR反應(yīng)中的退火和延伸溫度可以一致，只需兩個(gè)溫區(qū)就可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但是3個(gè)溫區(qū)PCR芯片適用性更廣。然而3個(gè)溫區(qū)芯片存在的一個(gè)問題是，高溫區(qū)解鏈產(chǎn)物在經(jīng)過中溫延伸區(qū)時(shí)可能會(huì)與DNA模板或互補(bǔ)鏈配對重新回到雙鏈狀態(tài)導(dǎo)致退火失敗，降低擴(kuò)增效率。而更改溫區(qū)的排布會(huì)使得芯片的設(shè)計(jì)更為復(fù)雜。

2.3 螺旋通道PCR芯片

螺旋通道PCR芯片可以有效解決溫區(qū)布局的問題。在這類芯片中，3個(gè)溫區(qū)以扇形排布，反應(yīng)溶液沿著通道盤旋流動(dòng)，依次經(jīng)過高低中3個(gè)溫區(qū)。DNA的高溫變性產(chǎn)物直接進(jìn)入低溫退火區(qū)，避免了在延伸區(qū)雙鏈復(fù)性的可能，提高擴(kuò)增效率。螺旋通道PCR芯片有平面式與圓柱式兩種， Hashimoto等[30]研制的PCR芯片就是平面結(jié)構(gòu)（如圖3A所示），他們設(shè)計(jì)的芯片分左右兩個(gè)區(qū)域，通道寬度為50 μm，右側(cè)通道之間的距離為250 μm，左側(cè)為50 μm。他們利用這款芯片對反應(yīng)液流速進(jìn)行了探索，最終可以分別在1.7和3.2別min內(nèi)完成500 bp及997 bp的DNA片段的20次循環(huán)擴(kuò)增與檢測。Park等[31]將一條長3.5 m的彈性石英管在有3個(gè)溫區(qū)的圓柱加熱器上螺旋式纏繞33周，實(shí)現(xiàn)了PCR擴(kuò)增。隨后Dorfman等[32]也研制了類似的PCR設(shè)備（如圖3B所示），他們利用不混溶的氟化溶劑將反應(yīng)液分隔成液滴的形式，借助對界面性質(zhì)的優(yōu)化控制使得相鄰液滴不會(huì)相互污染，以達(dá)到高通量的目的。Shu等[33]采用空氣對液體片段進(jìn)行隔離，發(fā)展了一種在螺旋通道微流控裝置上進(jìn)行的高通量快速核酸擴(kuò)增方法，可以在一個(gè)液滴里同時(shí)擴(kuò)增4種病原菌的靶基因，對實(shí)驗(yàn)中涉及的4種病原菌的基因組同時(shí)檢測的靈敏度可以達(dá)到100 copies/μL。相比而言，平面式結(jié)構(gòu)緊湊但每個(gè)循環(huán)的長度不一致，圓柱式體積比較大但是每個(gè)循環(huán)長度一致，流體控制較為簡便。蛇形通道與螺旋通道PCR芯片的共同特點(diǎn)是，PCR的循環(huán)次數(shù)和時(shí)間受到整個(gè)通道的長度和流體速度的限制，一旦芯片結(jié)構(gòu)固定，循環(huán)次數(shù)也相對固定。

2.4 振蕩式PCR芯片

振蕩式PCR是近年來隨著微流控技術(shù)不斷發(fā)展衍生的新方法。在振蕩式裝置中，循環(huán)次數(shù)不會(huì)受微通道長短限制。振蕩式PCR裝置由反應(yīng)微通道、流體驅(qū)動(dòng)器及加熱器組成。PCR溶液在驅(qū)動(dòng)器的控制下在溫區(qū)間往復(fù)運(yùn)動(dòng)，循環(huán)次數(shù)可以隨意調(diào)節(jié)，在各個(gè)溫區(qū)的反應(yīng)時(shí)間也可以通過改變各溫區(qū)的長度和流動(dòng)速度來優(yōu)化（見圖4）。Wang等[34]將1 μL PCR反應(yīng)液以液滴的形式注入微通道中，反應(yīng)液液滴兩端以石蠟油封裝，通過雙向蠕動(dòng)泵的控制使液滴在3個(gè)溫區(qū)中循環(huán)，可以在15 min內(nèi)完成對人乳頭瘤細(xì)菌DNA的擴(kuò)增。隨后， 其他研究者們也設(shè)計(jì)了類似的芯片對黑色素瘤相關(guān)的酪氨酸酶基因[35]，沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌等[36]以及食物來源的病原體[37]的DNA進(jìn)行了檢測。振蕩式PCR芯片與蛇形通道式PCR芯片有個(gè)共同點(diǎn)是，PCR反應(yīng)溶液在循環(huán)過程中不得不在高溫變性后穿過延伸區(qū)， 才能來到退火區(qū)，但是通過流體驅(qū)動(dòng)器的調(diào)節(jié)，可以盡量縮短這段過程的時(shí)間，避免DNA雙鏈復(fù)性。

2.5 閉環(huán)式PCR芯片

閉環(huán)式PCR芯片的原理與平面螺旋式PCR芯片類似，同樣是通過驅(qū)動(dòng)PCR溶液在平面內(nèi)的環(huán)形通道內(nèi)循環(huán)流過3個(gè)溫區(qū)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)溶液依次經(jīng)過高低中3個(gè)溫區(qū)，避免了DNA復(fù)性影響擴(kuò)增效率。根據(jù)驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng)的原理可以分為溫差環(huán)流[38]、對流驅(qū)動(dòng)[39]和外力（如浮力[40，41]、磁力[42，43]、壓力[44]等）驅(qū)動(dòng)的閉環(huán)PCR。與螺旋式PCR不同的是，閉環(huán)式PCR每個(gè)循環(huán)都是在同一個(gè)環(huán)形通道中進(jìn)行，因此每次循環(huán)的長度是一致的，芯片體積小，

圖4 振蕩型PCR裝置[36]

Fig.4 Oscillatoryflow PCR device[36]利于集成化和平行化高通量擴(kuò)增。Krishnan等[39]首次開發(fā)了一種利用雷諾貝納爾（RayleighBenard）自然對流驅(qū)動(dòng)方式進(jìn)行的PCR設(shè)備（如圖5A所示），PCR反應(yīng)液在61℃和97℃的密閉空間內(nèi)往復(fù)流動(dòng)，DNA的擴(kuò)增效率會(huì)受到雷諾數(shù)（Ra）和密閉腔體的高度與直徑的比值（h/d）的影響。Sun等[43]將多個(gè)閉環(huán)通道合并在一塊芯片內(nèi)（如圖5B所示），利用中心的磁鐵同時(shí)對四重閉環(huán)內(nèi)的磁性流體進(jìn)行操縱，磁性流體繼而推動(dòng)反應(yīng)液在環(huán)內(nèi)流動(dòng)，循環(huán)通過3個(gè)溫區(qū)。Xu等[44]通過ITO電極加熱控制3個(gè)溫區(qū)的溫度，采用壓縮氮?dú)庾鳛轵?qū)動(dòng)力，氣體的釋放由開關(guān)控制，反應(yīng)液在通道內(nèi)的移動(dòng)同時(shí)需要微閥的配合（如圖5C所示）。在這種設(shè)計(jì)的PCR芯片中，反應(yīng)時(shí)間、循環(huán)次數(shù)、反應(yīng)溫度都是可以根據(jù)實(shí)際要求設(shè)置的，大大提高了芯片的適用性。

3 芯片PCR產(chǎn)物的檢測與分析

在只具有擴(kuò)增功能的PCR芯片中，反應(yīng)完成后， 擴(kuò)增產(chǎn)物一般采用離線的凝膠電泳[23，43，45～47]、毛細(xì)管電泳[12]等分離檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證，這與傳統(tǒng)PCR儀相比并沒有優(yōu)勢，在線的檢測方法在提高檢測通量、減少交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)等方面更具有前景，因此發(fā)展功能集成化的芯片也是研究者追求的方向。

3.1 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis， CE）的原理是擴(kuò)增產(chǎn)物在進(jìn)入檢測通道前， 先通過嵌入型染料進(jìn)行標(biāo)記，隨后在電場的驅(qū)動(dòng)下遷移運(yùn)動(dòng)，因不同片段長度的DNA分子遷移速度不同而被分離。檢測器有紫外、熒光等。將PCR與毛細(xì)管電泳結(jié)合最早是由Mathies課題組[48]在1996年提出，他們將硅片PCR芯片與玻璃毛細(xì)管電泳芯片通過環(huán)氧樹脂連接在起一次，PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)芯片的十字交叉口注入分離通道進(jìn)行電泳。他們隨后又利用類似的方法對人類基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增并且可以對性別進(jìn)行鑒定[49]；之后還對病原微生物的DNA進(jìn)行了檢測，檢出限可以低至2～3個(gè)細(xì)菌[50]。近年來， PCR與CE的結(jié)合也逐漸朝著集成化的方向發(fā)展[51～53]。毛細(xì)管電泳因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)簡單、分析迅速，是最常用的分離檢測方法，然而它的缺陷在于只能分辨DNA序列的大小而無法區(qū)分DNA序列的不同。

3.2 熒光檢測法

熒光檢測法也是目前微流控PCR芯片中常用的檢測方法之一。研究者將芯片與熒光成像系統(tǒng)結(jié)合，不但可以在終點(diǎn)進(jìn)行產(chǎn)物檢測[22，54]，還可以借助熒光探針和芯片結(jié)構(gòu)實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)行過程[27， 55～62]。熒光終點(diǎn)檢測一般用于判斷PCR的成功與否或進(jìn)行半定量分析，但是實(shí)時(shí)熒光檢測則可以通過循環(huán)閾值的方法進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析[27]。然而循環(huán)閾值定量方法會(huì)受到擴(kuò)增效率的影響，Vogelstein等[63]在1999年提出了數(shù)字PCR（digital PCR）的概念，通過將樣本分配到成百上千個(gè)反應(yīng)單元中，每個(gè)單元只包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的DNA分子，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對各個(gè)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最終獲得定量結(jié)果。反應(yīng)單元越多，數(shù)字PCR的結(jié)果越準(zhǔn)確，且不會(huì)受到擴(kuò)增效率的影響。微池型PCR芯片與熒光檢測相結(jié)合，進(jìn)行數(shù)字PCR是目前的研究熱點(diǎn)之一[17，20，64]。

在線熒光檢測除終點(diǎn)檢測、實(shí)時(shí)檢測，還包括熒光融解曲線分析。這是一種可以與實(shí)時(shí)熒光PCR有機(jī)結(jié)合的檢測技術(shù)，在PCR 結(jié)束后，利用現(xiàn)有的溫度梯度，從退火溫度緩慢升溫至變性溫度即可完成，具有靈敏、準(zhǔn)確，且可以防止污染的優(yōu)點(diǎn)。Crews課題組[65]采用這種分析技術(shù)，在20 min內(nèi)完成了對人類唾液中的DNA的擴(kuò)增與唾液來源的性別確認(rèn)。

3.3 電化學(xué)方法

電化學(xué)方法是一種通過對電極的功能化修飾（如固定探針、酶、適配體等）， 特異性地捕捉目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)生相應(yīng)的電信號（電壓、電流、電阻）的檢測手段，具有靈敏性高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，而且可以通過微加工技術(shù)集成在微流控芯片上，因此最近也被發(fā)展用于PCR產(chǎn)物檢測[13， 66～69]。Fang等[66]將蛇形通道PCR芯片與電化學(xué)檢測相結(jié)合，在退火溫區(qū)集成了三電極陣列，對每個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)的產(chǎn)物檢測。電化學(xué)方法中所用到的探針可以是特定序列的一段核酸多聚物，通過與目標(biāo)產(chǎn)物的特異性結(jié)合產(chǎn)生電信號的改變，因此電化學(xué)方法可以在一定程度上分辨產(chǎn)物的核酸序列。

3.4 DNA雜交微陣列

DNA雜交微陣列[70～75]是針對特定序列產(chǎn)物的一種檢測手段，可以對擴(kuò)增產(chǎn)物序列進(jìn)行分析。通過精細(xì)的微加工技術(shù)，可以將PCR芯片與固定有大量寡核苷酸探針的微陣列相結(jié)合，PCR產(chǎn)物與探針完全互補(bǔ)，二者結(jié)合后則會(huì)產(chǎn)生熒光圖樣，通過這些熒光圖樣就可以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的序列信息。研究者們通過DNA雜交微陣列的方法在低豐度的DNA突變檢測[70]、流感病毒檢測[71]、HIV病毒基因分型[73]等方面進(jìn)行了探索。

4 微流控PCR芯片分析應(yīng)用實(shí)例

隨著微機(jī)電加工技術(shù)的快速發(fā)展，微流控PCR芯片也在向結(jié)構(gòu)簡單化、功能集成化、便攜式、一次性的方向發(fā)展，目前已有不少文獻(xiàn)報(bào)道了可以在線完成完整的生物樣本分離與分析的裝置，為生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)等學(xué)科的研究帶來了很多應(yīng)用價(jià)值。

Sciancalepore等[35]在2011年構(gòu)建了一款振蕩型PCR芯片，也是第一款巢式PCR芯片。芯片由PDMS與玻璃基質(zhì)兩層鍵合而成，PDMS中包裹有一根玻璃毛細(xì)管，作為PCR反應(yīng)的通道。毛細(xì)管中填充了硅化試劑玻璃基質(zhì)表面通過電子束蒸發(fā)沉積的方式設(shè)置了3個(gè)鈦/鉛復(fù)合電極，作為微加熱器，并與溫度傳感器結(jié)合，分別控制PCR過程中需要的3個(gè)溫度，升/降溫速度可以達(dá)到16℃/s。反應(yīng)液滴通過毛細(xì)管兩端的流體泵控制，在3個(gè)溫區(qū)間循環(huán)。巢式PCR的特點(diǎn)在于引物包括內(nèi)外兩套，外引物完成第一次PCR后的產(chǎn)物作為內(nèi)引物的模板，進(jìn)行第二次PCR。這種擴(kuò)增方式的特異性和靈敏性都明顯高于普通的PCR。作者利用這款巢式PCR芯片在55 min內(nèi)完成對酪氨酸激酶基因的擴(kuò)增，可以用于惡性黑色素瘤的診斷，比傳統(tǒng)PCR儀的速度提高了4倍。

Tian等[64]提出了一款利用負(fù)壓協(xié)助完成DNA純化和數(shù)字PCR檢測的微流控芯片。芯片分為DNA純化區(qū)與數(shù)字PCR區(qū)，以磁珠吸附生物樣品裂解液中的DNA，并在磁鐵的幫助下固定在純化區(qū)，經(jīng)過兩步清洗后， 從磁珠上洗脫，與PCR試劑混合，再借助負(fù)壓使溶液流入PCR區(qū)的微孔陣列中后，用硅油與未凝固的PDMS混合物沖走多余的樣品，在溫度循環(huán)的過程中，未固化的PDMS混合物也會(huì)逐漸凝固，起到封鎖進(jìn)樣通道的作用。氣壓控制通道則注入水，使PCR區(qū)域保持濕潤，避免試劑的蒸發(fā)。擴(kuò)增完成后，通過對每個(gè)微孔中熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)以及樣品的稀釋倍數(shù)可以對樣品濃度進(jìn)行定量。數(shù)字PCR的關(guān)鍵在于需要將樣品溶液分配至成百上千個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)孔中，使每個(gè)孔里只含有1～2個(gè)DNA模板或是沒有，這款芯片利用了PDMS的透氣性，在芯片外用注射器抽吸，使空腔內(nèi)形成負(fù)壓，從而完成了樣品溶液的分配，擺脫了對自動(dòng)加樣器的依賴。

Chang等[76]設(shè)計(jì)了一種集樣品制備、擴(kuò)增、純化、檢測于一體的微池型微流控PCR芯片對假體關(guān)節(jié)液中的細(xì)菌進(jìn)行了檢測和分型，用于參考選擇合適的抗生素，治療在關(guān)節(jié)成形中的細(xì)菌感染等并發(fā)癥。該課題組隨后利用類似的芯片對幽門螺旋桿菌對喹諾酮類抗生素的耐藥性診斷進(jìn)行了研究[77]。他們將幽門螺旋桿菌特異性的引物結(jié)合在磁珠上，利用磁鐵的吸附，在擴(kuò)增完成后可以輕松地將擴(kuò)增產(chǎn)物與剩余試劑分離，從而達(dá)到純化的效果。利用兩種不同的引物，芯片還可以同時(shí)進(jìn)行單核酸多態(tài)性的研究，通過擴(kuò)增產(chǎn)物可以分辨樣品中的病原體是否是幽門螺旋桿菌，并判斷是否出現(xiàn)了耐藥性突變，為疾病的治療提供了可靠的依據(jù)。

5 總結(jié)與展望

微流控PCR芯片的形式從最初單個(gè)微池或是簡單的蛇形通道逐漸變得越來越豐富，并且在微閥、微泵等功能元件的組合下，功能也越來越完善，研究者們的思維也在逐步地?cái)U(kuò)展，出現(xiàn)了許多巧妙的設(shè)計(jì)。但是芯片的結(jié)構(gòu)并非越復(fù)雜越好，繁瑣的流體操作會(huì)耗費(fèi)大量時(shí)間，也會(huì)對芯片制作帶來麻煩，因此在完成實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡那疤嵯拢?盡量簡化芯片結(jié)構(gòu)才是重點(diǎn)。目前，PCR芯片在流體操作方面已經(jīng)基本由機(jī)械化自動(dòng)化的流體泵來完成，為了擺脫對流體泵的依賴，也有研究者提出了一些利用材料的表面張力自驅(qū)動(dòng)的芯片，在樣品制備方面也出現(xiàn)了不少可以直接利用功能結(jié)構(gòu)在線提取和純化的芯片，然而在在線檢測方面仍舊有待改進(jìn)。熒光檢測是最為便捷和靈敏的檢測手段，但是需要依賴于昂貴的光學(xué)儀器和攝像設(shè)備，毛細(xì)管電泳與凝膠電泳則相對廉價(jià)但是受到精度和靈敏度的限制，離線檢測耗時(shí)耗力又易引入污染。所以，發(fā)展一種能夠在線檢測， 且低成本、高速度、高通量的檢測方法， 是今后的研究重點(diǎn)，可以向電化學(xué)生物傳感器的方向考慮。

由于芯片加工平臺(tái)還不夠普及，微流控PCR的技術(shù)也還不夠成熟，微流控PCR芯片暫時(shí)還不能取代商品化的PCR儀，但是我們相信在更為精細(xì)的微機(jī)電加工、更為準(zhǔn)確的溫度與流體控制、更為靈敏的數(shù)碼影像分析下，芯片的制作會(huì)越來越精巧，PCR的操作會(huì)更高效和便捷，基因分析的結(jié)果會(huì)更穩(wěn)定和豐富?；谖⒘骺匦酒耐怀鰞?yōu)點(diǎn)和人們對新技術(shù)新方法的需求，微流控PCR芯片將在今后的基因研究中逐漸占據(jù)一席之地。

References

1 Scientists Announced the Latest Human Genome. http：//www.people.com.cn/GB/guoji/25/95/20010212/393263.2001

科學(xué)家公布最新的人類基因組圖譜. http：//www.people.com.cn/GB/guoji/25/95/20010212/393263.2001

2 Saiki R K， Scharf S， Faloona F， Mullis K B， Horn G T， Erlich H A， Arnheim N. Science， 1985， 230（4732）： 1350-1354

3 Mullis K B. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.， 1994， 33： 1209-1213

4 Whitesides G M . Nature， 2006， 442（7101）： 368-373

5 Li X C， Chen Z G， Pan J B， Yang F， Li Y B， Yao M C. J. Chromatogr. A， 2013， 1291： 174-178

6 Zhang B B， Li Y B， He Q D， Qin J ， Yu Y Y， Li X C， Zhang L ， Yao M C， Liu J S， Chen Z G. Biomicrofluidics， 2014， 8（5）： 054110

7 CHEN WenYuan， ZHANG WeiPing. Integrated Microfluidic Polymer PCR Chip. Shanghai： Profile of Shanghai Jiao Tong University Press， 2009： 35

陳文元，張衛(wèi)平. 集成微流控聚合物PCR芯片， 上海： 上海交通大學(xué)出版社， 2009： 35

8 McDonald J C， Duffy D C， Anderson J R， Chiu D T， Wu H T， Schueller O J， Whitesides G M. Electrophoresis， 2000， D21（1）： 27-40F

9 Deng T， Goetting L B， Hu J M， Whitesides G M. Sensor. Actuat. APhys.， 1999， 75（1）： 60-64

10 Dittrich P S， Tachikawa K， Manz A. Anal. Chem.， 2006， 78（12）： 3887-3907

11 Northrup M A， Ching M T， White R M. In： Proceeding of the 7th International Conference on Solid State Sensors and Actuators， Yokohama， Japan， 1993： 924-926

12 Giordano B C， Ferrance J， Swedberg S， Huhmer A F ， Landers J P. Anal. Biochem.， 2001， 291（1）： 124-132

13 Lee T M， Carles M C， Hsing I M. Lab Chip， 2003， 3（2）： 100-105

14 Shen K Y， Chen X F， Guo M， Cheng J. Sensor. Actuat. BChem.， 2005， 105（2）： 251-258

15 Wang S， Sun Y， Gan W， Liu Y， Xiang G， Wang D， Wang L， Cheng J， Liu P. Biomicrofluidics， 2015， 9（2）： 024102

16 Neuzil P， Pipper J， Hsieh T M. Mol. Biosyst.， 2006， 2（67）： 292-298

17 Tanaka H， Yamamoto S， Nakamura A， Nakashoji Y， Okura N， Nakamoto N， Tsukagoshi K， Hashimoto M. Anal. Chem.， 2015， 87（8）： 4134-4143

18 Matsubara Y， Kerman K， Kobayashi M， Yamamura S， Morita V， Takamura Y， Tamiya E. Anal. Chem.， 2004， 76（21）： 6434-6439

19 Matsubara Y， Kerman K， Kobayashi M， Yamamura S， Morita Y， Tamiya E. Biosens. Bioelectron.， 2005， 20（8）： 1482-1490

20 Ottesen E A， Hong J W， Quake S R， Leadbetter J R. Science， 2006， 314（5804）： 1464-1467

21 Prakash R， Kaler K V. Microfluid. Nanofluid.， 2007， 3（2）： 177-187

22 Cai D， Xiao M， Xu P， Xu Y C， Du W. Lab Chip， 2014， 14（20）： 3917-3924

23 Kopp M U， Mello A J， Manz A. Science， 1998， 280（5366）： 1046-1048

24 Schaerli Y， Wootton R C， Robinson T， Stein V， Dunsby C， Neil M A， French P M， deMello A J， Abell C， Hollfelder F. Anal. Chem.， 2009， 81（1）： 302-306

25 Jiang L， Mancuso M， Lu Z， Akar G， Cesarman E， Erickson D. Sci. Rep.， 2014， 4： 4137

26 Schneegass I， Brautigam R， Kohler J M. Lab Chip， 2001， 1（1）： 42-49

27 Tachibana H， Saito M， Shibuya S， Tsuji K， Miyagawa N， Yamanaka K， Tamiya E. Biosens. Bioelectron.， 2015， 74： 725-730

28 Sun K， Yamaguchi A， Ishida Y， Matsuo S， Misawa H. Sensor. Actuat. BChem.， 2002， 84（23）： 283-289

29 Fukuba T， Yamamoto T， Naganuma T， Fujii T. Chem. Eng. J.， 2004， 101（13）： 151-156

30 Hashimoto M， Chen P C， Mitchell M W， Nikitopoulos D E， Soper S A， Murphy M C. Lab Chip， 2004， 4（6）： 638-645

31 Park N， Kim S， Hahn J H. Anal. Chem.， 2003， 75（21）： 6029-6033

32 Dorfman K D， Chabert M， Codarbox J H， Rousseau G， de Cremoux P， Viovy J L. Anal. Chem.， 2005， 77（11）： 3700-3704

33 Shu B W， Zhang C S， Xing D. Anal Chim Acta， 2014， 826： 51-60

34 Wang W， Li Z X， Luo R， Lu S H， Xu A D， Yang Y J. J. Micromech. Microeng.， 2005， 15（8）： 1369-1377

35 Sciancalepore A G， Polini A， Mele E， Girardo S， Cingolani R， Pisignano D. Biosens. Bioelectron.， 2011， 26（5）： 2711-2715

36 Wang H Y， Zhang C S， Xing D. Microchim. Acta， 2011， 173（34）： 503-512

37 Zhang C S， Wang H Y， Xing D. Biomed. Microdevices， 2011， 13（5）： 885-897

38 Chen Z， Qian S， Abrams W R， Malamud D， Bau H H. Anal. Chem.， 2004， 76（13）： 3707-3715

39 Krishnan M， Ugaz V M， Burns M A. Science， 2002， 298（5594）： 793-793

40 Agrawal N， Ugaz V M. Clin. Lab. Med.， 2007， 27（1）： 215

41 Wheeler E K， Benett W， Stratton P， Richards J， Chen A， Christian A， Ness K D， Ortega J， Li L G， Weisgraber T H， Goodson K E， Milanovich F. Anal. Chem.， 2004， 76（14）： 4011-4016

42 Sun Y， Kwok Y C， Nguyen N T. Lab Chip， 2007， 7（8）： 1012-1017

43 Sun Y， Nguyen N T， Kwok Y C. Anal. Chem.， 2008， 80（15）： 6127-6130

44 Xu Z R， Wang X， Fan X F， Wang J H. Microchim. Acta， 2010， 168（12）： 71-78

45 Nakano H， Matsuda K， Yohda M， Nagamune T， Endo I， Yamane T. Biosci. Biotechnol. Biochem.， 1994， 58（2）： 349-352

46 Agrawal N， Hassan Y A， Ugaz V M. Angew. Chem. Int. Edit.， 2007， 46（23）： 4316-4319

47 Guttenberg Z， Muller H， Habermuller H， Geisbauer A， Pipper J， Felbel J， Kielpinski M， Scriba J， Wixforth A. Lab Chip， 2005， 5（3）： 308-317

48 Woolley A T， Hadley D， Landre P， deMello A J， Mathies R A， Northrup M A. Anal. Chem.， 1996， 68（23）： 4081-4086

49 Lagally E T， Emrich C A， Mathies R A. Lab Chip， 2001， 1（2）： 102-107

50 Lagally E T， Scherer J R， Blazej R G， Toriello N M， Diep B A， Ramchandani M， Sensabaugh G F， Riley L W， Mathies R A. Anal. Chem.， 2004， 76（11）： 3162-317051 Kaigala G V， Huskins R J， Preiksaitis J， Pang X L， Pilarski L M， Backhouse C J. Electrophoresis， 2006， 27（19）： 3753-3763

52 Beyor N， Yi L N， Seo T S， Mathies R A. Anal. Chem.， 2009， 81（9）： 3523-3528

53 Thaitrong N， Toriello N M， Del Bueno N， Mathies R A. Anal. Chem.， 2009， 81（4）： 1371-1377

54 Li Y Y， Zhang C S， Xing D. Microfluid. Nanofluid.， 2011， 10（2）： 367-380

55 Chen L， West J， Auroux P A， Manz A， Day P J. Anal. Chem.， 2007， 79（23）： 9185-9190

56 ZHAO ShuMi， ZHU Ling， ZHU CanCan， LI Yang， WANG HuaDong， ZHANG Long， DU DiWei，DENG GuoQing， WANG An， LIU Yong. Chinese J. Anal.Chem.， 2014， 42（10）： 1393-1399

趙樹彌， 朱 靈， 朱燦燦， 李 陽， 王華東， 張 龍， 堵棣威， 鄧國慶， 王 安， 劉 勇. 分析化學(xué)， 2014， 42（10）： 1393-1399

57 Ramalingam N， Rui Z， Liu H B， Dai C C， Kaushik R， Ratnaharika B， Gong H Q. Sensor. Actuat. BChem.， 2010， 145（1）： 543-552

58 Hatch A C， Ray T， Lintecum K， Youngbull C. Lab Chip， 2014， 14（3）： 562-568

59 Frey O， Bonneick S， Hierlemann A， Lichtenberg J. Biomed. Microdevices， 2007， 9（5）： 711-718

60 Norian H， Field R M， Kymissis I， Shepard K L. Lab Chip， 2014， 14（20）： 4076-4084

61 Sun Y， Zhou X， Yu Y. Lab Chip， 2014， 14（18）： 3603-3610

62 Sun H， Olsen T， Zhu J， Tao J， Ponnaiya B， Amundson S A， Brenner D J， Lin Q. RSC Adv.， 2015， 5（7）： 4886-4893

63 Vogelstein B， Kinzler K W. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1999， 96（16）： 9236-9241

64 Tian Q C， Yu B D， Mu Y， Xu Y A， Ma C C， Zhang T， Jin W， Jin Q H. RSC Adv.， 2015， 5（100）： 81889-81896

65 Pjescic I， Crews N. Lab Chip， 2012， 12（14）： 2514-2519

66 Fang T H， Ramalingam N， Dong X D， Ngin T S， Zeng X T， Lai Kuan A T L， Huat E Y P， Gong H Q. Biosens. Bioelectron.， 2009， 24（7）： 2131-2136

67 Defever T， Druet M， RocheletDequaire M， Joannes M， Grossiord C， Limoges B， Marchal D. J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（32）： 11433-11441

68 Ferguson B S， Buchsbaum S F， Wu T T， Hsieh K， Xiao Y， Sun R， Soh H T. J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（23）： 9129-9135

69 Yeung S S， Lee T M， Hsing I M. J. Am. Chem. Soc.， 2006， 128（41）： 13374-13375

70 Hashimoto M， Barany F， Soper S A. Biosens. Bioelectron.， 2006， 21（10）： 1915-1923

71 Sun Y， Dhumpa R， Bang D D， Handberg K， Wolff A. Diagn. Micr. Infec. Dis.， 2011， 69（4）： 432-439

72 Sun Y， Dhumpa R， Bang D D， Hogberg J， Handberg K， Wolff A. Lab Chip， 2011， 11（8）： 1457-1463

73 Anderson R C， Su X， Bogdan G J， Fenton J. Nucleic Acids Res.， 2000， 28（12）： e60

74 Easley C J， Karlinsey J M， Bienvenue J M， Legendre L A， Roper M G， Feldman S H， Hughes M A， Hewlett E L， Merkel T J， Ferrance J P， Landers J P. P. Natl. Acad. Sci. USA， 2006， 103（51）： 19272-19277

75 Jiang X， Shao N， Jing W， Tao S， Liu S， Sui G. Talanta， 2014， 122： 246-250

76 Chang W H， Wang C H， Lin C L， Wu J J， Lee M S， Lee G B. Biosens. Bioelectron.， 2015， 66： 148-154

77 Chao C Y， Wang C H， Che Y J， Kao C Y， Wu J J， Lee G B. Biosens. Bioelectron.， 2016， 78： 281-289

Advance in Research of Microfluidic Polymerase Chain Reaction Chip

HE QiDi， HUANG DanPing， HUANG Guan， CHEN ZuanGuang*

（School of Pharmaceutical Sciences， Sun Yatsen University， Guangzhou 510006， China）

Abstract Gene is the genetic code of human beings， and has only 0.1‰ difference among individuals but creates a weelthy divesity. Thus it has a huge application value to explore the difference. Polymerase chain reaction （PCR） is one of the technologies mostly used in genetic research. But traditional thermal cyclers are not only time and energyconsuming， but also difficult to be integrated and portable. The combination of microfluidics and PCR can decrease the reaction volume significantly and increase the reaction efficiency with easy integration and miniaturization. In this review， we briefly introduced microchamber PCR chip and continuousflow PCR chip according to their structures， and online detection methods including capillary electrophoresis， fluorescence， electrochemistry and DNA hybridization array. At last， we summarized the recent advances and pointed out the future development about microfluidic PCR chip.

Keywords Microfluidics； Polymerase chain reaction （PCR）； Chip； Review

（Received 21 January 2016； accepted 25 February 2016）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21375152）