王子越, 王 芳

(1.包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

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人白細(xì)胞抗原-G在子宮腺肌癥患者子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞中通過白細(xì)胞介素-10誘導(dǎo)后對(duì)自然殺傷細(xì)胞的影響

王子越1, 王 芳2

(1.包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

目的：從臨床提取子宮腺肌癥患者子宮內(nèi)膜組織與同時(shí)提取的相應(yīng)患者的外周血自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞共培養(yǎng)，加入白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)干預(yù)，從而產(chǎn)生人白細(xì)胞抗原-G(human leucocyte antigen-G,HLA-G)，觀察前者對(duì)NK細(xì)胞的影響。方法：首先從臨床先后提取20例子宮腺肌癥患者的子宮內(nèi)膜組織，將組織細(xì)胞分離，棄去間質(zhì)細(xì)胞，剩余的腺細(xì)胞分為A、B、C3組，同時(shí)每一組分為2個(gè)部分，即干預(yù)組和非干預(yù)組，用含有10 %胎牛血清和1%的雙抗DMEM F12培養(yǎng)基體外培養(yǎng)以上3組細(xì)胞。同時(shí)干預(yù)組加入20 ng/mL的IL-10，非干預(yù)組添加等量的培養(yǎng)基。24 h后，A組細(xì)胞利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)分別測(cè)定干預(yù)組與非干預(yù)組的HLA-G的表達(dá)程度。隨后應(yīng)用免疫磁珠法從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中分選出CD56+單核細(xì)胞，即NK細(xì)胞，將NK細(xì)胞與B組、C組細(xì)胞共培養(yǎng)，48 h后，B組用流式細(xì)胞儀檢測(cè)干預(yù)組與非干預(yù)組的NK細(xì)胞凋亡率。C組用單純計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)干預(yù)組與非干預(yù)組的NK細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果：A組中，干預(yù)組HLA-G濃度平均為11.2 ng/mL，非干預(yù)組HLA-G濃度平均為3.2 ng/mL。B組中，加入IL-10的干預(yù)組與非干預(yù)組的NK細(xì)胞凋亡率分別平均為8.5 %與4.2 %。C組中，干預(yù)組與非干預(yù)組的NK細(xì)胞計(jì)數(shù)分別平均為2.5×105個(gè)/mL與1.7×105個(gè)/mL，48 h后干預(yù)組與非干預(yù)組的NK細(xì)胞計(jì)數(shù)分別平均為1.5×105個(gè)/mL與1.6×105個(gè)/mL。結(jié)論：IL-10增加了HLA-G表達(dá)，同時(shí)HLA-G的表達(dá)對(duì)NK細(xì)胞的凋亡影響并不明顯，但NK細(xì)胞數(shù)量減少，說明HLA-G對(duì)NK細(xì)胞有一定的抑制作用。

人白細(xì)胞抗原-G；自然殺傷細(xì)胞；磁珠分選；流式檢測(cè)；子宮腺肌癥；細(xì)胞計(jì)數(shù)

人白細(xì)胞抗原-G(human leucocyte antigen-G,HLA-G)是位于人第6號(hào)染色體短臂上的一群緊密連鎖基因群，具有多種結(jié)構(gòu)形式，屬于人類一種非經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)的Ⅰ類分子，選擇性高表達(dá)于侵入子宮蛻膜的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞。近年來對(duì)HLA-G的研究越來越深入，尤其是對(duì)成人病理狀態(tài)下的功能研究有著很大的進(jìn)展，它在各種腫瘤組織中均有表達(dá)，其中有研究發(fā)現(xiàn)HLA-G的表達(dá)與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和免疫反應(yīng)的降調(diào)相關(guān),并且發(fā)現(xiàn)HLA-G具有抑制免疫細(xì)胞的功能，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞以及自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞，它可以促進(jìn)這些免疫細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃避[1]。除此之外，膠質(zhì)瘤表達(dá)HLA-G的膜結(jié)合的HLA-G1亞型，保護(hù)其不受同種異體T細(xì)胞和NK細(xì)胞殺傷破壞[2]；神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者血漿中提取的可溶性HLA-G分子，也能抑制NK細(xì)胞和CTL介導(dǎo)的細(xì)胞裂解[3]。子宮腺肌癥患者的病理改變主要表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜異常增生，因此，它與惡性腫瘤的發(fā)展有一定的相似性。研究發(fā)現(xiàn)子宮腺肌癥患者的子宮內(nèi)膜在白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的刺激誘導(dǎo)下可表達(dá)大量的HLA-G，并且發(fā)現(xiàn)HLA-G主要在子宮腺肌癥患者子宮內(nèi)膜組織中的腺細(xì)胞中表達(dá)最多[4]，因此考慮在子宮腺肌癥患者體內(nèi)，免疫系統(tǒng)同樣受到了HLA-G的影響，為了進(jìn)一步探索HLA-G與免疫系統(tǒng)的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)在以上研究的基礎(chǔ)上，從臨床提取20例子宮腺肌癥患者的子宮內(nèi)膜組織，分離出腺細(xì)胞與相應(yīng)患者外周血中的NK細(xì)胞共培養(yǎng)，在IL-10干預(yù)的條件下，檢測(cè)HLA-G的表達(dá)并且分析NK細(xì)胞在HLA-G的影響下發(fā)生的變化。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM F12培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破酚邢薰?；磁珠分選試劑盒以及分選柱(MS柱)、分選架(MiniMACS Starting Kit)購(gòu)自Miltenyi Biotec公司；流式檢測(cè)抗體CD56(APC標(biāo)記)、凋亡試劑AnnexinⅤ(FITC標(biāo)記)、PI(PE標(biāo)記)均購(gòu)自BD公司。HLA-G ELISA試劑盒購(gòu)自皓歌生物制品有限公司。

1.2 提取原代細(xì)胞 子宮內(nèi)膜組織取自2015年5月1日至2015年9月31日在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦科因子宮腺肌病行子宮全切術(shù)的20例患者。具體方法為臨床提取子宮腺肌癥患者子宮內(nèi)膜標(biāo)本用F12保存并轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，將組織置于培養(yǎng)皿中，用D-hank's洗標(biāo)本3次，盡量洗去紅細(xì)胞及其他雜質(zhì)。用眼科剪剪碎組織，使其呈漿糊狀，轉(zhuǎn)移標(biāo)本至50 mL離心管，離心2 min，250 g。加入2倍體積膠原酶消化，37 ℃水浴50 min，每10 min震蕩一次。隨后從水浴中取出，加入3倍體積D-hank's液終止消化并震蕩。取3個(gè)燒杯分別加入1∶1的D-hank's液與F12培養(yǎng)基(已加血清及雙抗)。第1個(gè)燒杯上放100目濾網(wǎng)，將消化后的標(biāo)本倒入過濾，收集濾過液。燒杯2放置400目濾網(wǎng)，將上述濾過液繼續(xù)通過400目濾網(wǎng)，此時(shí)再次收集的濾過液為間質(zhì)細(xì)胞。將濾過后的400目濾網(wǎng)反扣在燒杯3上，用D-hank's液沖洗400目濾網(wǎng)，此時(shí)的濾過液為腺上皮細(xì)胞。棄去間質(zhì)細(xì)胞，將腺上皮細(xì)胞移入離心管，離心。用少量F12(已加血清)重懸。準(zhǔn)備6個(gè)培養(yǎng)皿，加入1 mL培養(yǎng)基，并分別加入4滴左右腺上皮細(xì)胞，6個(gè)培養(yǎng)皿分為A、B、C三組，每組2個(gè)培養(yǎng)皿(即干預(yù)組與非干預(yù)組)，將細(xì)胞放置20 ℃二氧化碳孵箱孵育。24 h后換液。同時(shí)，三組培養(yǎng)皿的干預(yù)組中加入20 ng/mL的IL-10，非干預(yù)組加入等量培養(yǎng)基。

1.3 磁珠分選以及ELISA檢測(cè) 加入IL-10干預(yù)24 h后，當(dāng)日早上抽取上述內(nèi)膜提供者血液，約10 mL。采用密度梯度離心法分離單核細(xì)胞。將單核細(xì)胞用生理鹽水洗2遍，約10 min，250 g。隨后去上清，將細(xì)胞移入EP管，加入適量MACS Buffer重懸細(xì)胞， 鏡下計(jì)數(shù)。隨后離心約300 g 10 min。取出上清液，加入40 μL MACS Buffer/107個(gè)，重懸細(xì)胞。加入10 μL NK cell biotin-antibody cocktail/107個(gè)，4℃冰箱靜置約15 min，離心洗去抗體，加30 μL buffer/107個(gè)，重懸細(xì)胞。隨后加入20 μL NK cell MicroBead cocktail/107個(gè),4 ℃冰箱靜置20 min，離心洗去多余磁珠。加入500 μL Buffer重懸細(xì)胞。用500 μL Buffer沖洗MS柱子。將細(xì)胞懸液倒入柱子，收集流出液體。繼而用500 μL Buffer沖洗柱子3次收集流出液體，最終為濃縮NK細(xì)胞，約2.5 mL。鏡下觀察，細(xì)胞圓滑清亮。將NK細(xì)胞平均分至B、C 2組4個(gè)培養(yǎng)皿中(分配之前對(duì)C組的NK細(xì)胞分別計(jì)數(shù))共培養(yǎng)。同時(shí)，A組的2個(gè)培養(yǎng)皿分別用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)試劑盒檢測(cè)HLA-G的表達(dá)。

1.4 流式檢測(cè)以及細(xì)胞計(jì)數(shù) 共培養(yǎng)48 h后,B組分別上機(jī)進(jìn)行流式檢測(cè)。具體方法為先確定流式條件，取出部分標(biāo)本，加入流式管，500 μL磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞，100 μL磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入CD56(APC標(biāo)記)流式抗體、凋亡試劑AnnexinⅤ(FITC標(biāo)記)、PI(PE標(biāo)記)共3管，避光30 min，上流式機(jī)，確定條件。其中AnnexinⅤ(FITC標(biāo)記)、PI(PE標(biāo)記)在避光之前需要55 ℃水浴15 min。最后將3種流式試劑同時(shí)加入再次確定流式條件。隨后從B組2個(gè)培養(yǎng)皿中各取約100 μL標(biāo)本加入流式管，PBS約500μL洗細(xì)胞，隨后100 μL磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，各加入3種抗體試劑。避光30 min。隨后磷酸鹽緩沖液洗去抗體，500 μL磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，上流式。分別檢測(cè)2個(gè)樣本APC標(biāo)記的CD56信號(hào)以及凋亡信號(hào)(另取一管不加入抗體作為陰性對(duì)照)。隨之算出B組中干預(yù)組與非干預(yù)組樣本的凋亡率。同時(shí)C組2個(gè)培養(yǎng)皿在顯微鏡下分別利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算方法為，4個(gè)角的格子即64個(gè)格子的細(xì)胞數(shù)除以4乘以104，該結(jié)果與48 h前的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以其算術(shù)平均數(shù)表示，比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)結(jié)果 A組中干預(yù)組與非干預(yù)組之間HLA-G的濃度改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，20例子宮腺肌癥患者，干預(yù)組中HLA-G的濃度平均為11.2 ng/mL，非干預(yù)組中HLA-G的濃度平均為3.2 ng/mL，即非干預(yù)組HLA-G濃度低于干預(yù)組HLA-G濃度(P<0.05)。

2.2 流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果 B組中，加入IL-10的干預(yù)組與未加入IL-10的非干預(yù)組NK細(xì)胞凋亡率分別平均為8.5 %與4.2 %。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算發(fā)現(xiàn)干預(yù)組與非干預(yù)組之間NK細(xì)胞凋亡率差別不明顯(P>0.05)。見圖1。圖中1A、2A、3A為干預(yù)組，4A、5A、6A為非干預(yù)組。1A、4A分別為干預(yù)組與非干預(yù)組所選的CD56(APC標(biāo)記)陽(yáng)性的細(xì)胞群，2A、5A是在所選定1A、4A中的細(xì)胞群中分別顯示干預(yù)組與非干預(yù)組中CD56與凋亡試劑AnnexinⅤ(FITC標(biāo)記)之間的關(guān)系，3A、6A也是在所選定1A、4A中的細(xì)胞群中分別顯示干預(yù)組與非干預(yù)組中凋亡試劑AnnexinⅤ(FITC標(biāo)記)與PI(PE標(biāo)記)之間的關(guān)系，其中PI標(biāo)記壞死細(xì)胞，所以圖中Q4-2，即PI陰性同時(shí)AnnexinⅤ陽(yáng)性的即為凋亡的NK細(xì)胞，其所占1A、4A細(xì)胞群的比例即為細(xì)胞凋亡率。

2.3 計(jì)數(shù)結(jié)果 C組中，將20例干預(yù)組48 h前后的細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，48 h前20例的細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值約為2.5×105個(gè)/mL，48 h后20例的細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值約為1.5×105個(gè)/mL。干預(yù)組48 h前后細(xì)胞計(jì)數(shù)變化有差異，即干預(yù)48 h后NK細(xì)胞計(jì)數(shù)減少(P<0.05)。同理，將20例非干預(yù)組48 h前后的細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，48 h前20例的細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值約為1.7×105個(gè)/mL，48 h后20例的細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值約為1.6×105個(gè)/mL。非干預(yù)組48 h前后細(xì)胞計(jì)數(shù)變化不明顯，即非干預(yù)組48 h后NK細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯變化(P>0.05)。

3 討論

NK細(xì)胞即自然殺傷細(xì)胞，目前認(rèn)為NK細(xì)胞是直接從骨髓中衍生的，在人的免疫機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[5]，可以認(rèn)為是免疫系統(tǒng)的一個(gè)代表，一旦NK細(xì)胞受損就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，從而罹患各種疾病。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，在相同條件下，加入IL-10的干預(yù)組有大量的HLA-G表達(dá)，非干預(yù)組只有少量的HLA-G表達(dá)，這也證實(shí)了以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。另一方面，在大量HLA-G表達(dá)的干預(yù)組中，與NK細(xì)胞共培養(yǎng)一段時(shí)間后，干預(yù)組的NK細(xì)胞數(shù)少于非干預(yù)組的NK細(xì)胞數(shù)。這進(jìn)一步表明NK細(xì)胞受到了HLA-G的影響，并且表現(xiàn)為抑制作用。然而B組中，干預(yù)組的NK細(xì)胞凋亡率與非干預(yù)組相比并沒有明顯的變化，這與預(yù)期結(jié)果相反，考慮可能HLA-G抑制NK細(xì)胞的機(jī)制并不是通過影響其凋亡率，亦或是由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平欠佳導(dǎo)致?？傊訉m腺肌癥患者的免疫系統(tǒng)確實(shí)受到了HLA-G的負(fù)面影響。除此之外，既然HLA-G可以抑制NK細(xì)胞，并且鑒于子宮腺肌癥與一些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定的相似性，那么可以據(jù)此推測(cè)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，HLA-G起到了很大的作用。而具體作用或許是一方面介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的免疫耐受，逃避了NK細(xì)胞的殺傷。并且有研究發(fā)現(xiàn)HLA-G可直接抑制免疫細(xì)胞的功能，其原因被確認(rèn)是以其表面表達(dá)的一種或更多的HLA-G抑制性受體為基礎(chǔ)。HLA-G是3種抑制性受體的配體，這些受體差異性的表達(dá)在B、T淋巴細(xì)胞、蛻膜和外周血的NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞上，一旦這些受體與配體特異性結(jié)合，即可使NK細(xì)胞失去其殺傷功能，從而使腫瘤細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞的攻擊。并且HLA-G的細(xì)胞亞群影響的研究顯示，HLA-G能抑制NK細(xì)胞的殺傷功能、CD8+T細(xì)胞的抗原特異性殺傷功能及CD4+T細(xì)胞的同種異體的增殖反應(yīng)。有相關(guān)文獻(xiàn)提示HLA-G在腫瘤組織中發(fā)揮作用是依靠改變腫瘤局部微環(huán)境，抑制局部NK細(xì)胞的腫瘤殺傷作用，產(chǎn)生局部免疫耐受，使腫瘤組織逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視，最終產(chǎn)生免疫逃逸作用。另一方面是抑制了免疫細(xì)胞，從本實(shí)驗(yàn)可推測(cè)，NK細(xì)胞的減少與HLA-G的表達(dá)有著密不可分的關(guān)系，根據(jù)HLA-G使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃避的機(jī)制，可推測(cè)HLA-G應(yīng)該同樣作用于NK細(xì)胞表面某種表面受體，如KIR2DL4，從而導(dǎo)致NK細(xì)胞壽命縮短即發(fā)生凋亡。具體機(jī)制尚有待研究?？偠灾琀LA-G通過在子宮腺肌癥患者子宮內(nèi)膜中大量表達(dá)，從而影響患者的免疫功能，導(dǎo)致疾病不斷發(fā)展惡化。

[1] 王飛.免疫耐受相關(guān)分子HLA-G和IL-10在子宮腺肌病中的表達(dá)及意義[D].濟(jì)南：山東大學(xué),2008.

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[4] 石珊珊,王飛,楊鐘莉.rIL-10誘導(dǎo)下子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞HLA-G的表達(dá)變化[J].新醫(yī)學(xué),2013,44(3):157-161.

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Effect of HLA-G on NK cells in endometrial cells extracted from adenomyosis patients induced by IL-10

WANG Ziyue,WANG Fang

(1.BaotouMedicalcollege,Baotou014040,China;2.TheFirstAffiliatedhospitalofBaotoumedicalcollege,Baotou014000,China)

Objective:To observe the effects of human leucocyte antigen-G(HLA-G) on natural killer (NK) cells when endometrial tissue extracted from adenomyosis patients and peripheral blood NK cell are added with interleukin-10(IL-10) to produce HLA-G. Method:20 cases of uterine adenomyosis patients were selected to extract endometrial tissue successively. With tissue cells separated and interstitial cell abandoned, the remaining gland cells were divided into group A, B and C, with two parts in each group, the intervention group and non-intervention group. Cells in the three groups were cultured in vitro with 10 % fetal bovine serum and 1 % of the double resistance DMEM F12 medium. IL-10 (20 ng/mL) was added into the intervention group and the same amount of medium into the non-intervention group. 24 hours later, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method was adopted to detect the expressions HLA-G in the two groups. The immunomagnetic sand method was then used to sort out CD 56+mononuclear cells, namely the NK cells, from human peripheral blood mononuclear cells. The sorted NK cells and cells in group B and C were co-cultured. 48 hours later, flow cytometry was performed to analyze the NK cells apoptosis ratio in group B. Counting method was used to count cells in group C. Results:In group A, HLA-G concentration averaged 11.2 ng/ml in the intervention group and 3.2 ng/ml in the non-intervention group. In group B, the NK cells apoptosis rates averaged 8.5 % and 4.2 % respectively in the intervention group and in the non-intervention group. In group C, NK cells counting in the intervention group and in the non-intervention group averaged 2.5×105/mL and 1.7×105/mL, with an average of 1.5×105/mL and 1.6×105/mL 48 hours later. Conclusion:IL-10 significantly increased the expression of HLA-G with no obvious effects on NK cells apoptosis, while the number of NK cells decreasing significantly showed HLA-G has certain inhibitory effect on NK cells.

Human leukocyte antigen-G; NK cell; Adenomyosis; Endometrial glandular cell

王 芳

2015-09-04)