岳燕科，閆 斌，于躍利

(1.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭 014010；2.包頭醫(yī)學(xué)院2013級(jí)研究生)

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MLK3在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

岳燕科1,2，閆 斌1，于躍利1

(1.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭 014010；2.包頭醫(yī)學(xué)院2013級(jí)研究生)

目的：研究混合譜系激酶3(mixed lineage kinase 3，MLK3)在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法：采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)65例胃癌組織、65例癌旁組織以及18例正常胃黏膜組織中MLK3的表達(dá)情況。結(jié)果：MLK3在正常胃黏膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為11.11 %，在胃癌及癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.54 %和35.38 %，胃癌組織中MLK3的表達(dá)水平分別高于癌旁組織及正常胃黏膜組織(P<0.05)，其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤(rùn)程度無(wú)關(guān)(P>0.05)。結(jié)論：MLK3表達(dá)水平升高與胃癌密切相關(guān)，可能參與胃癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。

胃癌；MLK3；免疫組化；信號(hào)通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號(hào)通路是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，介導(dǎo)于多種信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，參與細(xì)胞周期調(diào)控。另外，MAPK信號(hào)通路可被多種細(xì)胞外刺激因子激活，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，成為近年研究的熱點(diǎn)[1]。

混合譜系激酶3(mixed lineage kinase 3，MLK3)的分子量約為97 kDa，可以激活MAPK信號(hào)通路。MLK3及其家族成員已被證實(shí)在乳腺癌、卵巢癌、大腸癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，其活化后參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及凋亡，誘導(dǎo)癌細(xì)胞遷移、侵襲等多種生物學(xué)活動(dòng)[2]。近年來(lái)，MLK3在胃癌中的作用報(bào)道相對(duì)較少。為了更進(jìn)一步了解MLK3與胃癌的關(guān)系，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)MLK3在人胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況，分析其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2014年2月至2015年9月包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的原發(fā)性胃癌標(biāo)本65例，所有患者術(shù)前均未行放療、化療等相關(guān)治療，且具備完整臨床病理資料，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)均為胃腺癌。其中男性49例，女性16例；年齡(61.0±9.4)歲；高分化腺癌18例，中低分化腺癌47例；癌組織局限于黏膜及黏膜下層者11例，浸潤(rùn)深度超過(guò)肌層以上者54例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例，未轉(zhuǎn)移15例。TNM分期：Ⅰ期+Ⅱ期共23例，Ⅲ期+Ⅳ期共42例。設(shè)立胃癌組65例、癌旁組(65例與癌灶距離>5 cm的正常組織)和正常對(duì)照組(18例胃鏡下取的正常胃黏膜標(biāo)本)進(jìn)行比較分析。

1.2 試劑與方法 兔抗人MLK3抗體(bs-2992R)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。首先，取所有組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度4 μm)、脫蠟至水化，采用檸檬酸鈉緩沖液高溫抗原修復(fù)，3 % H2O2室溫孵育5 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；滴加正常山羊血清，室溫孵育30 min，以封閉非特異性反應(yīng)部位；傾去血清，勿洗，滴加兔抗人MLK3抗體(工作濃度1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，次日37 ℃復(fù)溫20 min，PBS沖洗3次，5 min/次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min；PBS沖洗3次，5 min/次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素過(guò)氧化物酶工作液，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3 次，5 min/次；用新鮮配制的DAB顯色液染色，并于顯微鏡下控制著色情況，蒸餾水適時(shí)終止顯色。常規(guī)沖洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組MLK3的陽(yáng)性表達(dá)情況并進(jìn)行攝片。

1.3 結(jié)果判定 以細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性染色。每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)200倍視野，取其均值，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量?jī)身?xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)分判定。染色強(qiáng)度：無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù))：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，<25 %為1分，26 %～49 %為2分，>50 %為3分。將2項(xiàng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)相乘，得出綜合評(píng)分：0～3分為陰性，4～6分為陽(yáng)性(+)，>7分為強(qiáng)陽(yáng)性(++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MLK3在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá) 光鏡下可見MLK3的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色/棕褐色顆粒狀或塊狀。在部分胃癌組織中，癌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大量深染棕褐色顆粒，呈強(qiáng)陽(yáng)性；部分胃癌組織癌細(xì)胞胞漿內(nèi)則可見棕黃色顆粒，呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)；而在大多數(shù)癌旁組織及正常胃黏膜組織中，細(xì)胞漿中未見陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物。見圖1。

A：胃癌組織中MLK3表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性(++)；B：胃癌組織中MLK3表達(dá)陽(yáng)性(+)；

C:胃癌旁組織中MLK3陰性(-)；D：正常胃黏膜組織中MLK3陰性(-)。

MLK3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞如箭頭所示。

胃癌組MLK3的陽(yáng)性表達(dá)率為81.54 %，癌旁組和正常對(duì)照組中MLK3的陽(yáng)性表達(dá)率分別為35.38 %和11.11 %。胃癌組MLK3的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于癌旁組和正常對(duì)照組(P<0.05)；癌旁組和正常對(duì)照組的MLK3陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 MLK3在胃癌中的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 MLK3的表達(dá)與患者年齡、性別、腫塊大小、浸潤(rùn)深度無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。MLK3在高分化腺癌的陽(yáng)性表達(dá)率為55.56 %,在中低分化腺癌的陽(yáng)性表達(dá)率為91.49 %，二者對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織MLK3陽(yáng)性表達(dá)率為94.00 %，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織MLK3的陽(yáng)性表達(dá)率為40.00 %，二者對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在胃癌的分期中可見，Ⅰ+Ⅱ期胃癌中MLK3陽(yáng)性表達(dá)率為56.52 %，Ⅲ+Ⅳ期胃癌中MLK3陽(yáng)性表達(dá)率為95.24 %，二者對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 MLK3在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)

a為與癌旁組比較，P<0.05；b為與正常對(duì)照組比較，P>0.05；c為與胃癌組比較，P<0.05

表2 MLK3在胃癌中的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

臨床病理特征NMLK3的表達(dá)陰性(-)陽(yáng)性(+)強(qiáng)陽(yáng)性(++)陽(yáng)性率(%)P年齡(歲) <60 ≥6027385617752581.4884.211.000性別 男 女49166633910187.7662.500.057腫瘤直徑 >4cm ≤4cm31343923195690.3273.530.113分化程度 高分化 中低分化1847846364755.5691.490.002浸潤(rùn)程度 黏膜及黏膜下層 肌層以上115421083411081.8281.481.000淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有 無(wú)5015393849294.0040.000.000TNM分期 Ⅰ+Ⅱ Ⅲ+Ⅳ23421028345656.5295.240.000

3 討論

我國(guó)是胃癌高發(fā)區(qū)，且胃癌的發(fā)病年齡趨于年輕化。到目前為止，外科手術(shù)仍是治療胃癌最有效的手段，但鑒于早期胃癌的診斷困難及其獨(dú)特的生物學(xué)特性，預(yù)后較差，化療和放療效果亦不理想[3]。近年來(lái)，隨著人們?cè)谀[瘤分子生物學(xué)和分子靶向治療上的諸多發(fā)現(xiàn)，對(duì)胃癌的診斷和治療也有了全新的認(rèn)識(shí)。

研究表明，多種細(xì)胞信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而MLK3是一種新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)基因，已被證實(shí)參與多種腫瘤相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但具體作用仍不清楚。MLK3由1個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域、1個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域、雙重亮氨酸拉鏈、1個(gè)Cdc42/Rac互動(dòng)結(jié)合模體和一個(gè)富含脯氨酸的C-端組成。MLK3以其獨(dú)特的分子形式處于自身抑制狀態(tài)，而MLK3的活化可由多種信號(hào)刺激介導(dǎo)[4]。另外，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、熱休克蛋白90等也可參與MLK3信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。由此可見，MLK3的活性是受多種因素調(diào)節(jié)的。有文獻(xiàn)報(bào)道MAPK家族中的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，參與癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程[5]。而MLK3作為MAPK信號(hào)通路的上游激酶，其激活與否對(duì)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路具有重要意義。

有研究發(fā)現(xiàn)，胃泌素(G17)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移及侵襲，而此過(guò)程主要是依靠MLK3/JNK信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在對(duì)目標(biāo)細(xì)胞使用了MLK3抑制劑CEPl347或JNK抑制劑SP600125進(jìn)行干預(yù)處理之后，這種遷移和侵襲過(guò)程會(huì)明顯減弱[6]。為了更進(jìn)一步了解MLK3與胃癌的關(guān)系，本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)65例胃癌組織及其癌旁組織、18例正常胃黏膜組織中MLK3的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLK3在胃癌組織相對(duì)于癌旁組織及正常胃黏膜組織表達(dá)增高，且與分化程度、病理學(xué)轉(zhuǎn)移、分期特征密切相關(guān)，說(shuō)明MLK3可能是導(dǎo)致胃癌發(fā)生、發(fā)展的因素之一，MLK3高表達(dá)是胃癌發(fā)生中重要的分子事件。

綜上所述，MLK3在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，檢測(cè)MLK3蛋白有望成為提高早期胃癌診斷率及評(píng)價(jià)患者預(yù)后的重要手段。但MLK3高表達(dá)引起胃癌發(fā)生的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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于躍利

2016-01-05)