杜義龍，李明臣，王領(lǐng)弟，李艷榮，潘海峰

（河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

HPLC法測定不同采收期承德產(chǎn)山里紅葉牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量

杜義龍，李明臣，王領(lǐng)弟，李艷榮，潘海峰△

（河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

目的：采用高效液相色譜（HPLC）法測定承德地區(qū)不同采收期山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量。方法：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5?m）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液-乙腈-四氫呋喃溶液，梯度洗脫；檢測波長：340nm；流速1.0ml/min；柱溫30℃。結(jié)果：牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的線性范圍是0.001-0.16mg/ml；平均加樣回收率為100.2%（RSD=2.8%）；5-10月承德不同產(chǎn)地山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量均值分別為灤平縣3.00mg/g，雙橋區(qū)4.00mg/g，承德縣2.84mg/g。結(jié)論：承德地區(qū)山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量在8月份達(dá)到最高，為最佳采收期，以承德市雙橋區(qū)產(chǎn)的山里紅葉含量最高，為最佳產(chǎn)地。

山里紅葉；牡荊素-4″-O-葡萄糖苷；高效液相色譜法；含量測定

山里紅葉為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N. E. Br.的干燥葉，主產(chǎn)于河北承德、山東和遼寧等地［1-3］。山里紅葉藥材化學(xué)成分復(fù)雜，主要為黃酮類和有機(jī)酸類［1］?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，山里紅葉具有降血脂、抑制血小板聚集、改善冠脈流量保護(hù)心肌和清除自由基、抗氧化等作用［4-7］。黃酮類化合物是山里紅葉生理活性的主要成分，包括牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素等，其中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷在山里紅葉中含量較高［8］。本研究采用HPLC法測定了承德地區(qū)三個(gè)產(chǎn)地不同月份山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量，以期找到牡荊素-4″-O-葡萄糖苷含量變化的規(guī)律，從而確定針對牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的最佳采集時(shí)間，為承德山里紅葉資源的開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1200 Series液相色譜儀（G1322A在線脫氣機(jī)、G1311A二元泵、G1316A柱溫箱、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1315D二極管陣列檢測器）；Agilent Chemstation色譜工作站；KQ-700型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率700W，頻率40KHz），梅特勒-托利多AG245電子分析天平，HC-2062高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 藥材 山里紅葉藥材均由河北民族師范學(xué)院董建新教授鑒定為薔薇科山楂屬植物山里紅的干燥葉，藥材分別于2011年6月、7月、8月、9月、10月采自承德市灤平縣、雙橋區(qū)和承德縣。對照品：牡荊素-4″-O-葡萄糖苷（批號，A0513），成都曼思特生物科技有限公司，純度＞99%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）-四氫呋喃（C），梯度洗脫方式：0-20-30-40-50min，A（90%-84%-84%-78%-74%）、B（8%-14%-14%-20%-24%）、C（2%-2%-2%-2%-2%）；色譜柱：Agilent ZORBAX SBC18（4.6mm×250mm，5?m）；檢測波長：340nm；流速1.0ml/ min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10?l。山里紅葉牡荊素-4″-O-葡萄糖苷色譜圖見附圖。

2.2 供試品溶液的制備 將山里紅葉去除雜質(zhì)后，65℃干燥至恒重（約2h），粉碎機(jī)粉碎后過80目篩；取山里紅粉末0.5g，置于50ml具塞三角瓶中，加入80%甲醇25ml，稱重；超聲提取30min，稱重，補(bǔ)足失量；過濾，續(xù)濾液過0.45?m濾膜，即得。

附圖 山里紅葉HPLC色譜圖

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取牡荊素-4″-O-葡萄糖苷適量，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成每ml含牡荊素-4″-O-葡萄糖苷0.16mg的對照品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 以對照品溶液為1號溶液，采用倍比稀釋法將對照品溶液制成系列濃度溶液，得2-5號對照品溶液。以2.1的色譜條件，分別取上述系列對照品溶液各10 μ l進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，對照品濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為A=15875C-9.6313（r=1.0000）。牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的線性范圍是0.001-0.16mg/ml。

2.5 精密度試驗(yàn) 按2.2的方法制備供試液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.1的色譜條件測定，記錄峰面積，峰面積RSD＜0.5%（n=6）。表明儀器的精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批山里紅葉藥材，按2.2的方法制備6份供試品溶液，按2.1的色譜條件測定，記錄峰面積，峰面積RSD＜1.5%（n=6）。表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，峰面積RSD＜3%（n=6）。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知牡荊素-4″-O-葡萄糖苷含量的山里紅葉6份，每份0.25g，加入牡荊素-4″-O-葡萄糖苷適量，按2.2的方法制備供試品溶液，按2.1的色譜條件測定峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量，計(jì)算平均回收率和RSD。結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定 取各批次山里紅葉樣品，按2.2的方法制備供試品溶液各3份，按2.1的色譜條件測定分析，通過回歸方程計(jì)算山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量。結(jié)果見表2：承德地區(qū)三個(gè)產(chǎn)地的山里紅葉中，8月份牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量最高，在8月份達(dá)到最高值后逐月減少；三個(gè)產(chǎn)地中以承德市雙橋區(qū)山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量最高。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 不同采收期藥材中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷含量測定結(jié)果（mg/g）

3 討論

研究不同采收時(shí)期藥材有效成分含量的變化，對確定目標(biāo)產(chǎn)物最佳采收期具有重要意義。本研究對承德地區(qū)6月到10月山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示8月份牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量最高，為最佳采收期；三個(gè)產(chǎn)地中，以承德市雙橋區(qū)產(chǎn)山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷的含量最高，為最佳產(chǎn)地。

［1］陳忠，盧樹杰，張維庫，等.HPLC測定山楂葉總黃酮中牡荊素鼠李糖苷含量［J］.中成藥，2009，31（10）：1615-1616.

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［3］張文潔，楊英，張輝.山楂葉提取物對高血脂大鼠的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2008，35（2）：307-308.

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［7］王領(lǐng)弟，李艷榮，張曉峰，等.山楂葉指紋圖譜研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（19）：74-78.（收稿日期：2015-10-12）

CONTENT DETERMINATION OF VITEXIN -4”-O-GLUCOSIDE IN CHENGDE HAWTHORN LEAF AT DIFFERENT COLLECTING TIME BY HPLC

DU Yi-long， LI Ming-chen， WANG Ling-di， et al
（Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine， Institute of Chinese Materia Medica，Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective: To determine the content of vitexin -4”-O-glucoside in Chengde hawthorn leaf at different collecting time by HPLC. Methods: The separation was carried out in Agilent ZORBAX SB-C18column （4.6mm×250mm，5μm） with 0.1% formic acid， acetonitrile and tetrahydrofuran as mobile phase in gradient elution model （detection wave: 340nm， fl ow rate:1.0ml/min， column temperature:30℃）. Results: The linear range of vitexin -4”-O-glucoside was 0.001-0.16 mg/ml. The average recovery rate was 100.2% （RSD=2.8%）. The average content of vitexin -4”-O-glucoside in Chengde hawthorn leaf from May to October was respectively 3.00mg/g from Luanping County， 4.00mg/g from Shuangqiao District and 2.84mg/g from Chengde County. Conclusions: According to the content of vitexin -4”-O-glucoside， August is the optimum collecting time and Shuangqiao District is the optimal producing area.

Hawthorn leaf； Vitexin -4”-O-glucoside； HPLC； Content determination

△

R284.1

A

1004-6879（2016）02-099-03