吳道勛，劉　璐，劉　熙，馬　嬌，王　瑩，張海珠*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000；3.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)，云南大理671000）

云南松松塔二萜類成分的指紋圖譜研究

吳道勛1，2，劉璐1，劉熙1，2，馬嬌3，王瑩1，2，張海珠1，2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000；3.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)，云南大理671000）

目的：通過(guò)比較不同產(chǎn)地云南松松塔中二萜類成分的HPLC指紋圖譜，分析不同采樣地點(diǎn)的云南松松塔是否具有差異性。方法：采集云南省不同產(chǎn)地的云南松松塔樣品20份，通過(guò)HPLC法建立云南松松塔中二萜類化合物的指紋圖譜，對(duì)其指紋圖譜中的共有峰進(jìn)行標(biāo)記。結(jié)果：確立了云南松松塔二萜類化合物色譜指紋圖譜的高效液相分析條件，確定11個(gè)共有峰。不同產(chǎn)地的云南松松塔的二萜類化合物色譜指紋圖譜存在一定差異。結(jié)論：采用HPLC法，制定云南松松塔的二萜類化合物色譜指紋圖譜，其二萜類成分得到較好的分離度，方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，為云南松松塔質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)。

云南松；松塔；二萜類化合物；HPLC法

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.005

松科松屬植物全世界約100種，分布于北半球至北極圈。全國(guó)常見(jiàn)的松樹(shù)約18種，主要分布在云南的云南松Pinus yunnanensis Franch.資源十分豐富。松塔是松科植物的球果，《本草綱目》記載了松塔具有祛痰、止咳平喘、祛風(fēng)、潤(rùn)腸、安神等功效。松塔含有多種具有藥理活性的成分，作為藥物可以治療風(fēng)濕病，還具有抗感染、抗菌、抗病毒等功效。但是，這一豐富的資源并沒(méi)有得到重視和利用，每年至少有上萬(wàn)噸的云南松松塔廢棄于山林中或被農(nóng)民當(dāng)作燃料燒掉。

國(guó)內(nèi)大量學(xué)者對(duì)松塔進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，其中周萍等研究了其木質(zhì)素-糖復(fù)合物中的含糖量〔1〕；劉光明等對(duì)其作了抗HIV活性成分的研究〔2〕；張志琴等研究了其莽草酸的提取工藝〔3〕；李寅珊等對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了研究〔4〕；呂小滿等對(duì)其化學(xué)成分及生物活性的研究展開(kāi)了一次綜合性的論述〔5〕；經(jīng)研究還發(fā)現(xiàn)松塔的抗癌活性成分具有高效、低毒的特點(diǎn)〔6-7〕。由此可見(jiàn)，松塔的化學(xué)成分及其藥理活性，具有很好的研究潛力與研究?jī)r(jià)值，可為其今后的藥用開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

李寅珊等從云南松松塔中分離出二萜類化合物〔4，8-10〕。二萜類化合物具有多種藥理活性，如∶抗腫瘤〔11〕、鎮(zhèn)痛〔12〕、抗血小板凝結(jié)〔13〕等。上述研究對(duì)松塔中的化學(xué)成分做了大量基礎(chǔ)性的探索工作，但國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)與本項(xiàng)目所涉及的對(duì)云南松松塔中二萜類化合物的指紋圖譜的相關(guān)研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用靈敏度和準(zhǔn)確度高的HPLC法，建立其二萜類成分的色譜指紋圖譜，標(biāo)記其共有峰，并計(jì)算相似度，以多指標(biāo)成分替代單一指標(biāo)成分，全面控制其質(zhì)量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及藥用資源的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象采于云南省各地（大理、昭通、曲靖等地）云南松松塔20份。標(biāo)本由大理大學(xué)段寶忠副教授鑒定為云南松松塔（P.yunnanensis Franch.），粉碎，過(guò)60目篩，置于陰暗處備用。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；AL104電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-3000（上海亞榮生化儀器廠）。流動(dòng)相甲醇（色譜純，Merck公司）；其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜條件Phenomenex Gemini C18（250 mm ×4.60 mm，5 μm）色譜柱；甲醇-0.5%磷酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫。見(jiàn)表1。流速1 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)241 nm，進(jìn)樣量10 μL〔4，9，14-15〕。

表1　梯度洗脫

1.2.2供試品溶液的制備稱取松塔粉末2.0 g，置50 mL圓底燒瓶中，加入30 mL無(wú)水丙酮浸泡提取12 h，過(guò)濾，減壓濃縮，回收丙酮，得浸膏，用適量甲醇溶解，置于25 mL量瓶中，并用甲醇定容至刻度，即得供試品液。

1.2.3精密度試驗(yàn)取同一供試品液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄結(jié)果。

1.2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品液，每隔4 h進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄結(jié)果。

1.2.5重復(fù)性試驗(yàn)取同批樣品6份，按照“1.2.2”供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，測(cè)定，記錄結(jié)果。

1.2.6樣品來(lái)源見(jiàn)表2。

2　結(jié)果與分析

2.1精密度試驗(yàn)結(jié)果取同一供試品液，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為1.57%，精密度良好。

2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果取同一供試品液，分別在0、4、8、12、16、20 h進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3%，相對(duì)峰面積的RSD為2.36%，表明20 h內(nèi)供試液溶液穩(wěn)定性較好。

表2　樣品來(lái)源

2.3重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果取同批樣品6份，按照“1.2.2”供試品溶液制備方法進(jìn)行操作，測(cè)定。11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3%，相對(duì)峰面積的RSD為2.76%，表明此方法重現(xiàn)性良好。

2.4指紋圖譜的建立及分析

2.4.1共有峰的標(biāo)定根據(jù)20批樣品測(cè)定所得結(jié)果表明∶云南松松塔丙酮冷浸提取共標(biāo)定11個(gè)共有峰作為特征峰構(gòu)成指紋圖譜。共有峰及相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果見(jiàn)表3～4；指紋圖譜見(jiàn)圖1。

2.4.2非共有峰面積比值統(tǒng)計(jì)計(jì)算各樣品非共有峰與總峰面積比值，結(jié)果顯示，非共有峰面積占總峰面積百分比均小于5%，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.4.3各地云南松松塔二萜類化合物指紋圖譜相似度20批樣品的圖譜相似度分別為∶0.965、0.927、0.965、0.965、0.965、0.873、0.873、0.927、0.965、0.927、0.927、0.977、0.977、0.906、0.873、0.873、0.949、0.949、0.855、0.704。

表3　不同樣品共有指紋峰相對(duì)峰面積

表4　不同樣品共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間

續(xù)表4

圖1　云南松松塔HPLC指紋圖譜

3　討論

3.1提取方法查閱文獻(xiàn)得出，在提取二萜類化合物時(shí)，多采用熱回流方法，此方法操作時(shí)間長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，溶劑損失量大，容易造成提取物的損失〔16-18〕。本實(shí)驗(yàn)采用丙酮冷浸法，提取二萜類化合物，提取效率高，操作簡(jiǎn)便，適宜推廣〔14〕。

3.2流動(dòng)相的選擇文獻(xiàn)中〔14，16-17，19〕，流動(dòng)相多采用乙腈-冰醋酸、甲醇-冰醋酸、乙腈-磷酸，正己烷-醋酸乙酯-乙腈等系統(tǒng)，但乙腈價(jià)格較昂貴，本實(shí)驗(yàn)中將流動(dòng)相優(yōu)化以甲醇-0.5%磷酸水溶液梯度洗脫，分離效果良好，且價(jià)格低廉，實(shí)用性強(qiáng)。

綜上所述，對(duì)不同采集地點(diǎn)的云南松松塔中二萜類化合物的指紋圖譜的研究得出，不同產(chǎn)地的云南松松塔的指紋圖譜有一定差異，同一采集地點(diǎn)的大理市斜陽(yáng)峰的也存在一點(diǎn)差異，可能是由于生長(zhǎng)環(huán)境、氣候因素、采集時(shí)間等原因造成。因此，今后應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)云南松的研究觀測(cè)，為其今后的藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

〔1〕周萍，林樊，劉潔，等.云南松松塔木質(zhì)素-糖復(fù)合物中的糖含量測(cè)定〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（8）：1820-1821.

〔2〕劉光明，呂永俊，李好枝，等.云南松松塔中抗HIV活性成分的研究初報(bào)〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，8（2）：69-71.

〔3〕張志琴，劉光明，楊永壽，等.云南松松塔中莽草酸的提取工藝研究〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（30）：18512-18513.

〔4〕李寅珊，李冬梅，蔣凌云，等.云南松松塔的化學(xué)成分〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（2）：119-121.

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Study on Fingerprints of Diterpenoid Compound in the Pine Cone of Pinus yunnanensis Franch

Wu Daoxun1，2，Liu Lu1，Liu Xi1，2，Ma Jiao3，Wang Ying1，2，Zhang Haizhu1，2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Dali，Yunnan 671000，China；3.West Yunnan University of Applied Sciences，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To compare the HPLC fingerprints of diterpenoid compound in pine cones of Pinus yunnanensis Franch from different habitats，and to analyze the differences among the pine cones from different sampling sites.Methods:20 pine cone samples of Pinus yunnanensis Franch from different places in Yunnan were collected and the fingerprints of diterpenoid compound in the pine cone of Pinus yunnanensis Franch were established through HPLC method with the marking the common peak.Results:High performance liquid chromatography analysis condition of the fingerprints of diterpenoid compound in pine cones of Pinus yunnanensis Franch were established and 11 common peaks were confirmed.There are differences among the chromatographic fingerprints of diterpenoid compound in pine cones of Pinus yunnanensis Franch from different places.Conclusion:HPLC method is used to develop chromatographic fingerprint of diterpenoid compound in pine cone of Pinus yunnanensis Franch with good resolution of diterpenoid，which lays the quality specification study foundation of pine cone of Pinus yunnanensis with a stable，accurate and reproducible method.

Pinus yunnanensis Franch；pine cone；diterpenoid；HPLC method

R284

A

2096-2266（2016）10-0018-05

（責(zé)任編輯李楊）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81260632；81450053）；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（2014Z132）

2015-08-23

2016-03-08

吳道勛，碩士研究生，主要從事天然藥物質(zhì)量控制研究.

*通信作者：張海珠，副教授.