羅愛蓮，程勝邦，沈　磊，陳俊雅，郭美仙

（云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理671000）

紫茉莉提取物對乙醇誘導L-02肝細胞損傷的影響

羅愛蓮，程勝邦，沈磊，陳俊雅，郭美仙*

（云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理671000）

目的：研究紫茉莉提取物對乙醇體外誘導L-02肝細胞損傷的作用。方法：選取處于對數(shù)生長期的L-02肝細胞，以終濃度為100 mmol/L的乙醇誘導損傷8 h后，加入不同濃度的紫茉莉提取物，繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，MTT法檢測乙醇對肝細胞的抑制率，酶標法檢測培養(yǎng)液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。結(jié)果：8 mg/mL或更高生藥濃度的紫茉莉能減小乙醇對L-02肝細胞的抑制率，降低受損細胞培養(yǎng)液中的ALT和AST活性，增強SOD活性，減少MDA含量。結(jié)論：紫茉莉提取物對乙醇誘導L-02肝細胞損傷有一定的保護作用。

紫茉莉；乙醇；L-02肝細胞；保護作用

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.002

長期大量飲酒或飲用含酒精飲料易造成酒精性肝損害，通常表現(xiàn)為酒精性肝炎、脂肪肝、肝硬化等〔1〕。酒精性肝損害已成為危害全球的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢，但至今為止，仍未找到對其有效的防治藥物〔2〕。過氧化損傷是酒精性肝損害的公認發(fā)病機制之一〔3〕。紫茉莉俗名地雷花、胭脂花等〔4〕，全草均可入藥，藥用價值高，收載于《本草綱目拾遺》?，F(xiàn)代研究表明紫茉莉具有抗氧化、抗癌、抗菌、收縮子宮平滑肌等多種藥理作用〔5-8〕。李凌智等〔9〕研究表明紫茉莉中含有抗氧化物質(zhì)——黃酮，黃酮對實驗性肝損傷有一定的保護作用。因此，本實驗就紫茉莉提取物對乙醇誘導損傷的L-02肝細胞的影響進行了研究。

1　材料

1.1樣品紫茉莉采于云南省大理市，由大理大學藥學與化學學院張德全副教授鑒定為紫茉莉科紫茉莉?qū)僦参镒宪岳颍∕irabilis jalapa L.）。將紫茉莉洗凈，晾干，粉碎。稱取5 kg用無水乙醇冷浸提取3次，混合并濃縮冷浸液，得浸膏294.56 g（1 g浸膏約相當于17 g生藥），冰箱保存?zhèn)溆谩?0〕。無菌條件下∶加藥前24 h配制母液，密封冰箱保存過夜；加藥前，用PBS（磷酸鹽緩沖液）稀釋母液，得81、27、9、3、1 mg/mL藥液〔10〕。

1.2藥品與試劑RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；MTT（噻唑藍，Sigma公司），胰蛋白酶（Sigma公司），DMSO（二甲基亞砜，Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；0.25%胰蛋白酶和1%雙抗（Amresc公司生產(chǎn)）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒、超氧化物岐化酶測定試劑盒及丙二醛試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3儀器ES-315型高壓滅菌鍋（TOMY公司）；3-111型培養(yǎng)箱（Thermo公司）；AE-21型倒置生物數(shù)碼顯微鏡（MOTIC公司）；0408-2型臺式低速離心機（上海醫(yī)療器械集團有限公司手術(shù)器械廠）；多功能酶標儀（BioTek公司）。

2　方法

2.1肝細胞（L-02）培養(yǎng)用含20%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基），置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1～2 d更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞長滿培養(yǎng)瓶底部80%以上時，以1∶2或1∶3進行傳代，繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2肝細胞損傷模型的建立以1×105個/mL的細胞懸液種板（96孔板，90 μL/孔）。設(shè)正常組和3個濃度乙醇組，每組重復8孔，另設(shè)空白組8孔，加入完全培養(yǎng)基（90 μL/孔）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，空白組和正常組加入完全培養(yǎng)基（10 μL/孔），乙醇低濃度組、乙醇中濃度組、乙醇高濃度組分別加入對應濃度（500、1 000、2 000 mmol/L）的乙醇（10 μL/孔）。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，去培養(yǎng)液，各孔加入5 mg/mL MTT（100 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，去上清液，各孔加入DMSO（200 μL/孔），570 nm處檢測吸光度（A值），實驗重復3次，計算不同乙醇濃度下肝細胞抑制率。選擇能使肝細胞抑制率達到50%的乙醇濃度進行實驗〔10-13〕。

2.3紫茉莉提取物對乙醇損傷的L-02肝細胞的影響以1×105個/mL的細胞懸液種板（96孔板，90 μL/孔）。設(shè)正常組、模型組、溶媒組和紫茉莉5個劑量組（A組、B組、C組、D組、E組），每組重復6孔，另設(shè)空白組6孔，加入完全培養(yǎng)基（90 μL/孔）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，空白組和正常組各孔加入完全培養(yǎng)基（10 μL/孔），其余各組各孔加入1 000 mmol/L乙醇（10 μL/孔）。繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，空白組、正常組和模型組各孔加入完全培養(yǎng)基（10 μL/孔），溶媒組各孔加入1%DMSO（10 μL/孔），紫茉莉A組、B組、C組、D組、E組分別依次加入對應濃度（1、3、9、27、81 mg/mL）的紫茉莉提取物（10 μL/孔）。繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，吸取培養(yǎng)液檢測ALT活性（波長510 nm）、AST活性（波長510 nm）及SOD活性（波長450 nm）和MDA含量（波長530 nm）。各孔加入5 mg/mL MTT（100 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，去上清液，各孔加入DMSO（200 μL/孔），酶標儀檢測A值（波長570 nm），計算各組肝細胞抑制率〔10-13〕。實驗重復3次。

2.4數(shù)據(jù)處理所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和組間t檢驗。

3　結(jié)果與分析

3.1不同濃度乙醇對L-02肝細胞抑制率的影響乙醇終濃度為50 mmol/L時，肝細胞抑制率為32.22%，與正常組比較吸光度值明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；乙醇終濃度為100 mmol/L和200 mmol/L時，肝細胞抑制率分別為51.79%、71.95%，與正常組比較吸光度值均明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。因此，選擇中濃度乙醇（1 000 mmol/L）進行實驗。見表1。

表1　不同濃度乙醇對L-02肝細胞抑制率的影響

表1　不同濃度乙醇對L-02肝細胞抑制率的影響

注：與正常組比較△△P＜0.01。

分組正常組乙醇低濃度組乙醇中濃度組乙醇高濃度組終濃度/（mmol/L）—50 100 200 A值0.435±0.056 0.312±0.030△△0.220±0.055△△0.167±0.034△△細胞抑制率/%—32.22±6.04 51.79±7.93 71.95±4.63

3.2紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細胞抑制率的影響模型組肝細胞抑制率為53.38%，與正常組比較吸光度值明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明造模成功。紫茉莉生藥終濃度為45.9 mg/mL時肝細胞抑制率為36.03%，與模型組比較明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；紫茉莉生藥終濃度為137.7 mg/mL時肝細胞抑制率為27.21%，與模型組比較明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2　紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細胞抑制率的影響（

表2　紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細胞抑制率的影響（

注：與正常組比較△△P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

分組正常組模型組溶媒組紫茉莉A組紫茉莉B組紫茉莉C組紫茉莉D組紫茉莉E組生藥終濃度/（mg/mL）——1.7 5.1 15.3 45.9 137.7 A值0.389±0.051 0.181±0.028△△0.185±0.027△△0.191±0.030△△0.192±0.046△△0.217±0.038△△0.249±0.041△△* 0.283±0.038△△**細胞抑制率/%—53.38±7.19 52.40±6.92 51.03±7.87 50.73±11.81 44.26±12.45 36.03±10.57* 27.21±9.68**

3.3紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性的影響與正常組比較，模型組肝細胞ALT和AST活性均明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明造模成功。紫茉莉生藥終濃度為15.3 mg/mL時肝細胞ALT和AST活性明顯減弱，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。紫茉莉生藥終濃度為45.9 mg/mL和137.7 mg/mL時肝細胞ALT和AST活性均明顯減弱，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3　紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性的影響

表3　紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性的影響

注：與正常組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

分組正常組模型組溶媒組紫茉莉A組紫茉莉B組紫茉莉C組紫茉莉D組紫茉莉E組生藥終濃度/（mg/mL）——1.7 5.1 15.3 45.9 137.7 ALT活性/（IU/L）1.71±0.29 3.42±0.50△△3.06±0.56△△2.97±0.48△△2.89±0.71△△2.63±0.42△△* 2.40±0.41△△** 2.27±0.45△** AST活性/（IU/L）2.12±0.20 3.76±0.58△△3.58±0.74△△3.41±0.65△△3.30±0.52△△3.02±0.45△△* 2.79±0.37△△** 2.56±0.43△**

3.4紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細胞培養(yǎng)液中SOD活性及MDA含量的影響與正常組比較，模型組肝細胞SOD活性明顯減弱，MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明造模成功。紫茉莉生藥終濃度為15.3 mg/mL時肝細胞SOD活性增強，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；紫茉莉生藥終濃度為45.9 mg/mL和137.7 mg/mL時肝細胞SOD活性均明顯增強，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。紫茉莉生藥終濃度為5.1 mg/mL時肝細胞MDA含量降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；紫茉莉生藥終濃度為15.3 mg/mL、45.9 mg/mL和137.7 mg/mL時肝細胞MDA含量均明顯降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表4。

表4　紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細胞培養(yǎng)液中SOD活性及MDA含量的影響

表4　紫茉莉?qū)σ掖紦p傷的L-02肝細胞培養(yǎng)液中SOD活性及MDA含量的影響

注：與正常組比較△△P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

分組正常組模型組溶媒組紫茉莉A組紫茉莉B組紫茉莉C組紫茉莉D組紫茉莉E組生藥終濃度/（mg/mL）——1.7 5.1 15.3 45.9 137.7 SOD活性/（U/mL）44.08±7.46 17.32±4.15△△17.61±3.79△△18.54±3.69△△20.90±4.31△△22.65±3.47△△* 25.16±2.39△△** 31.80±5.60△△** MDA含量/（nmol/mL）52.37±9.94 121.80±17.34△△118.31±12.50△△111.27±8.49△△104.23±11.98△△* 97.35±12.64△△** 82.06±8.35△△** 70.81±9.53△△**

4　討論

乙醇經(jīng)肝臟代謝，轉(zhuǎn)化為乙醛和多種氧自由基，氧自由基攻擊肝細胞膜，導致肝細胞脂質(zhì)過氧化損傷，產(chǎn)生過氧化物（MDA等）。肝細胞過氧化損傷時，細胞膜通透性增加，ALT和AST由肝細胞內(nèi)釋放，細胞培養(yǎng)液中的ALT和AST活性增強。因此，檢測肝細胞培養(yǎng)液中MDA含量、ALT和AST活性，可以判斷肝細胞被乙醇氧化損傷的程度和藥物治療肝臟損傷的效果?？寡趸窼OD活性的大小，可以反應肝細胞抗氧化能力的強弱，肝細胞代謝乙醇的過程中需要消耗大量的SOD。因此，檢測肝細胞培養(yǎng)液中SOD活性，可以反映細胞抗氧化能力的增強和藥物治療肝臟損傷的效果。

實驗表明，當紫茉莉生藥終濃度達到或高于45.9 mg/mL時，可以使乙醇對L-02肝細胞的抑制率減??；當紫茉莉生藥終濃度達到或高于15.3 mg/mL時，可以使受損的L-02肝細胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性減弱，SOD活性增強，MDA含量減少。表明紫茉莉提取物可以減少乙醇對L-02肝細胞的損害，即紫茉莉提取物對乙醇損傷的L-02肝細胞有一定保護作用，提示紫茉莉在治療酒精性肝損傷方面具有一定的價值。其機制可能與抗氧化有關(guān)，有待進一步研究。

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Effect of Extracts form Mirabilis jalapa on the Damaged L-02 Human Embryo Hepatocytes Induced by Ethanol

Luo Ailian，Cheng Shengbang，Shen Lei，Chen Junya，Guo Meixian*
（Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To study the effect of extracts form Mirabilis jalapa on the damaged L-02 human embryo hepatocytes induced by ethanol.Methods:L-02 human embryo hepatocytes in logarithmic phase were chosen and damaged by ethanol at a final concentration of 100 mmol/L.After 8 hours，different concentrations of the extracts form Mirabilis jalapa were added in.After 16 hours of cultivation，MTT method was used to observe inhibition rate of L-02 human embryo hepatocytes damaged by ethanol，and Elisa method was used to detect the activity of glutamic-pyruvic transaminase（ALT），glutamic-oxalacetic transaminase（AST）and superoxide dismutase（SOD），and the content of malonaldehyde（MDA）in nutrient solution.Results:8 mg/mL or higher crude herbal concentrations of Mirabilis jalapa can significantly decrease inhibition rate of ethanol-induced damaged L-02 cells，obviously reduce ALT and AST activity，increase SOD activity and decrease MDA content in the culture for damaged cells.Conclusion:Extracts form Mirabilis jalapa has protective effect on the damaged L-02 cells induced by ethanol.

Mirabilis jalapa；ethanol；L-02 human embryo hepatocytes；protective effect

R285

A

2096-2266（2016）10-0005-04

（責任編輯李楊）

大理大學大學生科研基金資助項目（YHXSKY201310）

2016-01-13

2016-03-08

羅愛蓮，2011級藥學專業(yè)本科生.

*通信作者：郭美仙，實驗師.