單　華，劉子琦，陳穎志，張盼盼，陳　浩，姜　北*

（1.大理大學藥物研究所，云南大理671000；2.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000）

24種白族慣用植物β-羥高鐵血紅素形成抑制活性

單華1，2，劉子琦1，2，陳穎志1，2，張盼盼1，2，陳浩1，2，姜北1，2*

（1.大理大學藥物研究所，云南大理671000；2.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000）

目的：研究24種白族慣用植物藥的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，為從天然產(chǎn)物中尋找新型抗瘧藥物提供實驗依據(jù)。方法：植物樣品依次用75%乙醇和蒸餾水回流提取，提取物經(jīng)冷凍干燥后，采用β-羥高鐵血紅素形成抑制實驗進行活性測試，以IC50值評價其潛在的抗瘧活性效果。結(jié)果：在供試的24種植物樣品中，滇紫草水提物具有一定的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，IC50值為（1 254.1±3.9）μg/mL；鞭打繡球、天南星、滇橄欖3種植物水提物也有微弱的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，IC50值均大于1 388.9 μg/mL。結(jié)論：滇紫草、鞭打繡球、天南星、滇橄欖4種植物具有不同程度的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，值得進一步深入研究。

白族；慣用植物藥；粗提物；抗瘧活性；β-羥高鐵血紅素形成抑制實驗

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.001

瘧疾（Malaria）是通過雌性按蚊叮咬或輸入帶瘧原蟲者血液導致瘧原蟲寄生于人體而引起的蟲媒傳染病，其與艾滋病、結(jié)核病并稱為世界最嚴重的三大傳染病〔1-2〕。目前，瘧疾是全球最為流行的寄生蟲病之一，嚴重威脅患者的生命安全。全球有108個國家和地區(qū)流行瘧疾，約33億人受威脅，每年發(fā)病人數(shù)達3～4億，平均年死亡人數(shù)近百萬〔3〕。在我國，瘧疾曾流行于80%（甚至80%以上）的地區(qū)〔4〕。近年來，經(jīng)過不懈的努力，我國的預防和治療瘧疾工作取得了很大成效，已基本控制了該疾病的大規(guī)模流行，但在一些較偏遠的地區(qū)，如云南、海南、安徽等地瘧疾疫情仍時有發(fā)生，其中云南因毗鄰瘧害嚴重的東南亞各國而成為我國瘧疾發(fā)病率最高的地區(qū)，防瘧形勢異常嚴峻。

我國傳統(tǒng)方法治療瘧疾主要有中草藥法和針灸療法。在西方國家，金雞納曾是治療瘧疾最主要的藥物，但因長期使用療效下降而逐漸被淘汰。20世紀70年代以來，青蒿素成為治療瘧疾最有效的藥物〔5〕，然而由于瘧原蟲對長期使用的藥物會逐步產(chǎn)生抗藥性，靠單一種類抗瘧藥物控制瘧疾前景不容樂觀，因此，新一代抗瘧藥物研發(fā)刻不容緩。云南藥用植物資源豐富、少數(shù)民族眾多，長期傳承形成了豐富多彩的民族醫(yī)藥文化。大理為白族主要聚居地，以白族慣用植物藥為基礎(chǔ)探尋新型抗瘧藥物具有較好的基礎(chǔ)條件。

β-羥高鐵血紅素形成抑制實驗主要以血紅素為紅內(nèi)期抗瘧藥物的作用靶點，通過模擬阻止瘧原蟲把有毒血紅素轉(zhuǎn)化成一種不被溶解和吸收的無毒復合物（瘧色素）來達到評估樣品的抗瘧疾效果〔6-8〕。本實驗以大理州境內(nèi)24種白族慣用植物藥為研究對象，采用β-羥高鐵血紅素形成抑制實驗評價抗瘧活性〔6，9〕，為從云南豐富的藥物資源中尋找新型抗瘧先導成分提供了思路。

1　材料與方法

1.1植物樣品供試的24種白族慣用植物參照相關(guān)白族醫(yī)藥文獻記錄確定〔10〕，植物樣品于2014年采自大理州境內(nèi)，由大理大學藥學與化學學院生藥學教研室張德全副教授鑒定。

1.2試劑及儀器

1.2.1試劑氯高鐵血紅素、氯喹二磷酸鹽、HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸，美國Sigma公司）；乙酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；吡啶、冰醋酸（上海申博化工有限公司）；氫氧化鈉（重慶川東化工集團有限公司）；鹽酸（西隴化工股份有限公司）；DMSO（二甲基亞砜，天津化學試劑有限公司），以上試劑均為分析純。

1.2.2儀器COOL SAFE 95-15冷凍干燥機（Gene Company Limited）；MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；多功能酶標儀（美國Bio Tek儀器公司）；AL204電子天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3實驗方法

1.3.1供試樣品的制備植物樣品干燥后稱取約70 g粉碎，先后用75%乙醇和水回流，各提取3次，每次500 mL溶劑，合并提取液，減壓濃縮后冷凍干燥成粉末，密封保存，得相應(yīng)醇提物與水提物。按公式［凍干粉重量（g）/提取植物樣品干重（g）］× 100%計算提取率。

精確稱取植物粗提物5 mg，溶解在1 mL蒸餾水中，并用蒸餾水按比例（1∶4）稀釋成梯度濃度溶液，作為供試溶液備用。最終供試樣品的梯度濃度為1 388.9、277.8、55.6、11.1、2.2 μg/mL。

1.3.2羥高鐵血紅素標準曲線的制備分別移取10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μL氯高鐵血紅素儲備液（氯高鐵血紅素溶解于DMSO中，濃度為0.2 mmol/L）置96孔板中，一式3份。之后每孔加入30%（v/v）的吡啶-HEPES（20 mmol/L，pH 7.5）溶液至250 μL（氯高鐵血紅素在堿性條件下Cl-被OH-置換，生成羥高鐵血紅素），于405 nm波長處測定吸收值；每個濃度平行重復3次。以羥高鐵血紅素濃度（C）為橫坐標，各濃度平均吸光度值（A）為縱坐標作標準曲線，得回歸方程A=61.545C+0.366 2（r= 0.993 4）。結(jié)果表明羥高鐵血紅素的濃度和吸光度之間有良好的線性關(guān)系。見圖1。

1.3.3β-羥高鐵血紅素形成抑制實驗以氯喹二磷酸鹽作為陽性對照、蒸餾水作為陰性對照，將50 μL不同濃度的供試品溶液、50 μL氯高鐵血紅素儲備液、80 μL醋酸鹽緩沖液依次加入96孔板中，于50℃培養(yǎng)箱中孵育5 h，取出待室溫后于每孔加入100 μL 30%（v/v）的吡啶-HEPES（20 mmol/L，pH 7.5）溶液，室溫放置過夜后于每孔中移取50 μL上清液至另一96孔板，加200 μL吡啶-HEPES溶液進行稀釋，于405 nm波長處測定吸收值。由羥高鐵血紅素標準曲線和測定的吸光度值得出未反應(yīng)羥高鐵血紅素的濃度，若供試樣品在最高濃度下平均抑制率小于5%，則視為樣品對β-羥高鐵血紅素形成無抑制作用；若平均抑制率大于5%，則認為樣品對β-羥高鐵血紅素形成有一定的抑制作用（即IC50＞1 388.9 μg/mL）；當平均抑制率大于50%，按公式［未反應(yīng)羥高鐵血紅素的濃度/初始配制濃度］×100%，計算供試樣品相應(yīng)的對β-羥高鐵血紅素形成的抑制濃度（以IC50表示）〔11-14〕。

圖1　羥高鐵血紅素的標準曲線

2　結(jié)果與分析

2.124種植物的名稱及粗提率24種采自大理州境內(nèi)的白族慣用植物樣品醇提法提取率為8.29%～45.90%，水提法提取率為3.20%～20.70%。見表1。

2.2供試樣品β-羥高鐵血紅素形成抑制實驗結(jié)果供試白族慣用植物樣品β-羥高鐵血紅素形成抑制實驗結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，鞭打繡球、天南星、滇橄欖3種植物的水提物均具有不同程度的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，IC50值均大于1 388.9 μg/mL。滇紫草水提物活性較好，IC50為（1 254.1±3.9）μg/mL。采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對滇紫草和陽性對照氯喹二磷酸鹽進行兩獨立樣本均數(shù)t檢驗，P＜0.001為差異有統(tǒng)計學意義。

表1　24種白族慣用植物藥樣品β-羥高鐵血紅素形成抑制活性

表1　24種白族慣用植物藥樣品β-羥高鐵血紅素形成抑制活性

植物氯喹二磷酸鹽云南紅景天車前草植物拉丁名稱Chloroquine diphosphate Pinus yunnanensis供試部位—粗提物提取率/—%—全株｛全株｛豬殃殃荷蓮豆草翠雀花粗莖秦艽豬毛菜Plantago depressa Galium aparine var. echinospermum Drymaria cordata地上｛全株｛乙醇水乙醇水乙醇水乙醇Delphinium tatsienense Gentiana crassicaulis Salsola collina全株｛全株｛水—水乙全株｛醇水乙銀杏鞭打繡球纈草Ginkgo biloba Hemiphragma heterophyllum Valeriana officinalis地上｛全株｛全株｛醇水—水—水乙天南星全株｛醇水乙透骨草全株｛醇水乙葉上花地上｛醇—乙密蒙花地上｛醇水乙合歡地上｛醇—乙青刺尖Arisaema erubescens Gaultherialeucocarpa var.yunnanensis Helwingia chinensis Buddleja officinalis Albizia julibrissin Prinsepia utilis 地上｛醇水乙青刺尖Prinsepia utilis 果實｛醇水乙滇橄欖全株｛醇—乙伸筋草全株｛小白薇Phyllanthus emblica Lycopodium japonicum Tylophora yunnanensis 全株｛雞肉參Incarvillea mairei 全株｛醇水—水—水—水11.80 7.12 10.20 6.60 22.10 9.00 21.50 5.86—7.70 45.90 17.60 12.10 7.52 15.40 3.52 14.40 5.59 23.30 3.40 35.20 20.70 40.60—15.50 4.60 12.90—19.30 7.10 17.50 3.20 8.61—14.60 5.10—6.50—4.40—5.80 IC50/（μg/mL）36.2±1.8*無活性無活性無活性無活性無活性無活性無活性無活性—無活性無活性無活性無活性無活性—無活性—＞1 388.9無活性無活性無活性＞1 388.9無活性—無活性無活性無活性—無活性無活性無活性無活性無活性—無活性＞1 388.9—無活性—無活性—無活性

續(xù)表1

3　討論

隨著青蒿素的問世和人工合成抗瘧藥物的不斷發(fā)展使得瘧疾的危害暫時得到有效控制，但瘧疾的治療仍是一個世界級難題，研發(fā)新的安全有效的抗瘧藥物仍迫在眉睫。雖然抗瘧藥物篩選采用體外連續(xù)培養(yǎng)惡性瘧原蟲株和建立伯氏瘧原蟲鼠瘧模型更加可靠，但實驗成本高、操作復雜，無法實現(xiàn)高通量篩選，因此對于樣本量較大的活性檢測選擇一種簡便高效的方法十分重要。本實驗采用一種間接的方法測定樣品的抗瘧活性，作用靶點為瘧原蟲的紅內(nèi)期，其他成分如9-表奎寧和8-羥基喹啉等非活性物質(zhì)以及紅外期抗瘧藥伯氨喹等均不干擾此聚合反應(yīng)〔15〕，具有操作簡便、快速、微量等高通量篩選實驗的特性，非常適合多樣品快速檢測分析。同時，本研究充分利用了民族植物藥治療疾病的傳統(tǒng)優(yōu)勢，有針對性地對24種采自云南大理地區(qū)的白族慣用植物進行了抗瘧活性初探，所選的供試藥用植物涵蓋21個科24個屬，科屬分類跨度較大，有一定的代表性。

實驗測定中考慮到供試樣品來源廣泛，為防止出現(xiàn)因濃度范圍小而漏篩的情況，實驗中樣品濃度梯度設(shè)定跨度較大，按參考文獻〔10-11〕的方法進行預實驗后，最終采用樣品濃度5倍稀釋梯度作為實驗測定范圍。此外，從實驗篩選結(jié)果看，鞭打繡球、天南星、滇橄欖3種植物的水提物均具有不同程度的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，雖與陽性對照物等活性顯著的單體成分相比抗瘧活性有較大差距，但鑒于供試樣品為粗提物，不排除其中可能會含有活性較好的單體成分或先導化合物，篩選結(jié)果可為下一步深入研究指明方向，因此具有一定的學術(shù)意義。

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Study on β-hematin Formation Inhibition Activities of 24 Common-used Herbal Medicines of Bai Nationality

Shan Hua1，2，Liu Ziqi1，2，Chen Yingzhi1，2，Zhang Panpan1，2，Chen Hao1，2，Jiang Bei1，2*
（1.Institute of Materia Medica of Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To study β-hematin formation inhibition activity of 24 herbal medicines often used by Bai nationality and to provide the experimental evidence for finding new effective antimalarial medicines from natural products.Methods:Plant materials were extracted with 75%ethanol and distilled water using the reflux method.After the extract solutions were combined and concentrated under reduced pressure，the resulting residue was completely dried by lyophilization.The dried samples were screened for antimalarial activity by using β-hematin formation inhibition assay.Bioactivity results were evaluated by IC50values.Results:Among the 24 plant samples，water extracts of Onosma paniculatum showed the best activity to inhibit β-hematin formation with the IC50value of（1 254.1±3.9）μg/mL.Water extracts of Hemiphragma heterophyllum，Arisaema erubescens and Phyllanthus emblica had weak activity to inhibit β-hematin formation with the IC50values over 1 388.9 μg/mL.Conclusion:O.paniculatum，H.heterophyllum，A. erubescens and P.emblica reveal potential antimalarial activity and deserve further study in the future.

Bai nationality；herbal medicines；crude extract；antimalaria；β-hematin formation inhibition assay

R978.61

A

2096-2266（2016）10-0001-04

（責任編輯李楊）

國家自然科學基金資助項目（81460532）

2016-04-18

2016-06-06

單華，碩士研究生，主要從事天然藥物藥理學研究. *通信作者：姜北，教授，博士.