楊　爍，楊　敏，劉清瑋，張　鑫

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院，吉林　吉林 132001）

超聲波-酶法聯(lián)合提取葛花總黃酮工藝研究*

楊爍，楊敏△，劉清瑋，張鑫

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院，吉林吉林 132001）

為了研究葛花總黃酮最佳工藝，試驗(yàn)采用超聲波-酶法聯(lián)合提取葛花總黃酮，確定最佳的提取工藝條件。結(jié)果表明：葛花：料液比1：30，酶解時間為4.5h，酶解溫度為50℃，酶濃度為1.2%。超聲時間80min，溫度80℃，液料比1：30，乙醇濃度70%。在最優(yōu)條件下，提取率為4.307%。優(yōu)選提取工藝簡單可行，速度快，可提高葛花人參中有效成分的收率。

葛花；超聲波；纖維素酶解；提取工藝

葛花為豆科植物葛Puerarialobata（Willd.）Ohwi的干燥花，是一種名貴的中藥材。用于飲酒過度，頭痛，頭昏，煩渴，胸膈飽脹，嘔吐酸水等傷及胃氣之癥［1］。現(xiàn)代藥理表明［2］，葛花總黃酮還有收縮和保護(hù)胃腸黏膜，抑制乙醇在消化道的吸收，加強(qiáng)乙醇在胃腸道的首過效應(yīng)，阻礙乙醇快速并且大量地進(jìn)入血液循環(huán)，降低血液中乙醇濃度。戴雨霖［2］實(shí)驗(yàn)表明，無論酒前還是酒后給小鼠灌胃葛花提取液，都可以有效減少小鼠醉酒情況，降低小鼠死亡率。

本試驗(yàn)采用超聲波-酶法聯(lián)合提取的技術(shù)，以葛花總黃酮含量為主要考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法探討了不同提取條件對總黃酮的影響，為葛花的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，以充分利用我國的物質(zhì)資源。

1　試驗(yàn)材料

葛花，2015年購于吉林大藥房；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 （寧夏和氏璧生物科技有限公司）；纖維素酶（HJ0721SB14，上海源葉生物科技有限公司）；冰醋酸 （天津政成化學(xué)制品有限公司）；香草醛 （香蘭素）（天津政成化學(xué)制品有限公司）；硫酸（天津政成化學(xué)制品有限公司）；亞硝酸鈉（天津政成化學(xué)制品有限公司）；硝酸鋁（天津政成化學(xué)制品有限公司）；氫氧化鈉（天津政成化學(xué)制品有限公司）；無水乙醇 （沈陽市新化試劑廠）；甲醇（天津福晨化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水等均為分析純。

2　葛花試驗(yàn)方法

2.1葛花樣品制備

取葛花藥材適量，粉碎，過100目篩，在100℃的條件下，烘干至恒重，兩次稱量之差要小于0.03g，備用。

2.2單因素試驗(yàn)

精確稱量0.25g葛花粉末，按照一定的液料比，酶解時間，溫度，酶濃度進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解反應(yīng)后，進(jìn)行抽濾，殘?jiān)藕嫦渲杏?00℃烘干。再按照超聲時間80min，溫度80℃，液料比1：30，乙醇濃度70%進(jìn)行超聲［3］。超聲后抽濾，將兩次的濾液合并，離心（4000r/min，10min），稱量體積，并定容在50mL容量瓶中［4］。精密量取1mL于10mL容量瓶中，按照2.2所示方法在506nm處測吸光度。

2.2.1料液比的選擇

稱量葛花粉末0.25g，共4份，按照料液比1：10、1：20、1：30、1：40的比例進(jìn)行添加，比較不同料液比對葛花總黃酮提取效果的影響。

2.2.2酶解時間的選擇

稱量葛花粉末0.25g，共4份，分別提取2h，3h，4h，5h比較不同時間對葛花總黃酮提取效果的影響。

2.2.3酶解溫度的選擇

稱量葛花粉末0.25g，共4份，在35℃，40℃，45℃，50℃條件下進(jìn)行提取，比較不同溫度對葛花總黃酮提取效果的影響。

2.2.4酶濃度的選擇

稱量葛花粉末0.25g，共4份，在0.6%，0.8%，1%，1.2%條件下進(jìn)行提取，比較不同酶濃度對葛花提取率的影響。

2.3葛花總黃酮提取正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將酶解時間、酶解溫度、酶濃度3個因素作為考察的對象，并設(shè)計(jì)正交表L9（34），考察這3個因素對超聲波-酶法聯(lián)合提取對總黃酮含量的影響，確定最佳提取工藝條件。

3　結(jié)果與分析

3.1葛花總黃酮提取最佳工藝的確定

3.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以總黃酮溶液的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，提取率為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗(yàn)結(jié)果表明，蘆丁在0.01～0.05μg/mL范圍線性良好，回歸方程為：y= 25.18x-0.0024，R2=0.99939。

3.1.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

（1）提取時間：提取率在3-4h增長快速，4-5h后，增長緩慢，最佳的提取時間為5h，如圖1所示。

圖1　酶解時間對葛花總黃酮提取率的影響

（2）提取溫度：溫度為35℃時提取率最低，隨著溫度的增加提取率不斷增大，當(dāng)溫度在45℃后，增長緩慢。最佳溫度為50℃，如圖2所示。

圖2　酶解溫度對葛花提取率的影響

（3）酶濃度：隨著酶濃度的增加，提取率呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢。當(dāng)酶濃度在1.2%時，提取率最大，故最佳酶濃度為1.2%，如圖3所示。

圖3　酶濃度對葛花提取率的影響

（4）料液比：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定最佳料液比為1：40。料液比大約1：30后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果幾乎持平，如圖4所示。

圖4　料液比對葛花提取率的影響

由表1所知，F(xiàn)＜F0.05（3，7）=4.35，則P＞0.05，故在0.05顯著水平上接受H0，說明料液比對葛花總黃酮的提取率沒有有顯著的影響。結(jié)合經(jīng)濟(jì)效益等綜合因素，料液比最后選為1：30。

表1　料液比單因素方差分析表

3.1.3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照表2進(jìn)行正交試驗(yàn)，比較各因素不同水平對葛花總黃酮提取率的影響。

表2　葛花總黃酮正交實(shí)驗(yàn)表

從表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，影響順序由高到低為：酶濃度＞酶解溫度＞酶解時間，最優(yōu)方案為A3B3C3，即酶解時間為5.0h，酶解溫度為55℃，酶濃度為1.2%。

表3　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2方差分析結(jié)果

酶濃度為顯著項(xiàng)，其他因素不顯著。即除酶濃度外的其他因素對該實(shí)驗(yàn)的提取率影響不明顯。因此考慮到經(jīng)濟(jì)等綜合條件，最佳提取工藝為：酶解時間為4.5h，酶解溫度為50℃，酶濃度為1.2%。

4　結(jié)論

本文利用超聲波-酶法聯(lián)合技術(shù)提取葛花中總黃酮，經(jīng)單因素和正交試驗(yàn)得出最佳提取工藝分別為：葛花：料液比1：30，酶解時間為4.5h，酶解溫度為50℃，酶濃度為1.2%。在最優(yōu)條件下，提取率為4.307%。葛花中的黃酮具有氧化還原作用，加速乙醇氧化，氧化的乙醇失去毒性。本文的提取工藝操作簡單，有效率高。此實(shí)驗(yàn)為葛花人參解酒顆粒劑的制備奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 朱華，劉芯蕊，王孝勛.葛花的研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23（12）：2273-2274.

［2］ 戴雨霖.葛花人參解酒護(hù)肝機(jī)制的研究［D］.2014，5.

［3］ 朱中貴，張卓勇，蔡光明.葛花總黃酮提取工藝及抗氧化活性研究［J］.中南藥學(xué)，2009，3（7）：203-205.

［4］ 李甜甜，傅舒，劉曉風(fēng)，李東，王舒雅，鄭濤.酶法結(jié)合超聲提取粉葛根葛根素的研究［J］.食品工業(yè)科技，2015（13）：175-179.

TQ351.3

吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院省級大學(xué)生創(chuàng)新資助項(xiàng)目，合同號：吉農(nóng)院合字［2015］第005號。

△楊敏（1984～），女，吉林省吉林市人，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院教師，碩士。