任　榮，張　艷，芝　敏，張 蕾

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院腎病科,烏魯木齊　830011)

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高糖對(duì)腎小管上皮細(xì)胞泛素-核糖體蛋白52與TGF-β/Smad信號(hào)通路mRNA表達(dá)的影響

任榮，張艷，芝敏，張 蕾

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院腎病科,烏魯木齊830011)

目的探討高糖對(duì)腎小管上皮細(xì)胞泛素-核糖體蛋白(ubiquitin-ribosomal protein 52，UBA52)與TGF-β/Smad信號(hào)通路mRNA表達(dá)的影響及其UBA52在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用與可能機(jī)制。方法根據(jù)培養(yǎng)基葡萄糖濃度不同分成葡萄糖低濃度組(5.6 mmol/L葡萄糖)、葡萄糖+甘露醇組(5.6 mmol/L葡萄糖+24.6 mmol/L甘露醇)、葡萄糖中濃度組(20 mmol/L葡萄糖)、葡萄糖高濃度組(30 mmol/L葡萄糖)，分別干預(yù)48 h。觀察不同糖濃度對(duì)鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)形態(tài)的影響；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)并比較不同葡萄糖濃度下UBA52、Smad7、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)與α-SMA mRNA水平。結(jié)果高糖可致NRK-52E向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；葡萄糖低濃度組、葡萄糖+甘露醇組、葡萄糖中濃度組、葡萄糖高濃度組腎小管上皮細(xì)胞UBA52 mRNA的表達(dá)分別為( 1.002±0.075)、(0.092±0.083)、(1.994±0.146)、(2.160±0.210)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TGF-β1的表達(dá)分別為(1.003±0.089)、(1.180±0.060)、(1.214±0.169)、(2.158±0.266)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；Smad7mRNA表達(dá)分別為(1.002±0.078)、(1.106±0.049)、(0.952±0.044)、(0.332±0.110)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；α-SMA mRNA表達(dá)分別為(1.002±0.007)、(1.046±0.091)、(1.720±0.032)、(2.885±0.254)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；伴隨著葡萄糖濃度的升高，UBA52、TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)逐漸增加，而Smad7 mRNA的表達(dá)逐漸下降。UBA52與TGF-β1 mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.58，P<0.05)，與 Smad7mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.61，P<0.05)。結(jié)論腎小管上皮細(xì)胞泛素前體UBA52、TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)呈葡萄糖濃度依賴性增加，而Smad7基因表達(dá)呈葡萄糖濃度依賴性下降，UBA52可能參與了高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞TGF-β/Smad信號(hào)通路的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

糖尿病腎病；泛素-核糖體蛋白52(UBA52)；Smad7；腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化

糖尿病腎病中，Smad7通過(guò)泛素蛋白酶體途徑被泛素化降解，從而使轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)被持續(xù)激活是腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的原因之一，而泛素蛋白酶體抑制劑MG132可改善高糖環(huán)境下的腎小管上皮細(xì)胞纖維化[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病小鼠及糖尿病腎病患者血液及尿液中泛素的前體泛素-核糖體蛋白52( ubiquitin-ribosomal protein 52，UBA52)大量表達(dá)[3]，但其是否參與及如何參與糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，目前研究較少。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察不同糖濃度對(duì)UBA52及TGFβ1/Smad7mRNA表達(dá)的影響，探討腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中UBA52與TGFβ1/Smad7的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK52E(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供)，DMEM低糖培養(yǎng)基(Life technologies公司，美國(guó))，胎牛血清(Life technologies公司，美國(guó))，青霉素-鏈霉素雙抗(10 000 U)(Hyclone公司，美國(guó))，Trizol(美國(guó) MRC)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Select Master Mix(ABI公司，美國(guó))。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力康儀器有限公司 Smart Cell HF-90)，熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司 Eclipse TS100-F)，PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)Thermo公司),凝膠成像系統(tǒng)(中國(guó)上海天能科技有限公司)。

1.2細(xì)胞分組及處理用含有10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基(5.6 mmol/L)培養(yǎng) NRK52E細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2孵育箱，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%時(shí)使用無(wú)胎牛血清的 DM EM 培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。24 h后棄去舊培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度葡萄糖完全培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為葡萄糖低濃度組(5.6 mmol/L葡萄糖)、葡萄糖+甘露醇組(5.6 mmol/L葡萄糖+24.6 mmol/L甘露醇)、葡萄糖中濃度組(20 mmol/L葡萄糖)、葡萄糖高濃度組(30 mmol/L葡萄糖)，每組5個(gè)重復(fù)，置于37℃培養(yǎng)48 h。

1.3RNA抽提及RT-PCR用 Trizol 分別提取各組細(xì)胞的總RNA，RNA 樣本溶于DEPC水中，測(cè)260/280 A比值，計(jì)算RNA得率，調(diào)整RNA濃度。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，步驟如下：RNA模板2.5 μg，Oligo d T 1 μL，DEPC水補(bǔ)足至11 μL，70℃水浴5 min，立即冰浴，5×buffer 4 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，d NTP 2 μL，DEPC水1.5 μL，37℃水浴5 min，加入反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，42℃水浴1 h，70℃滅活10 min。

用SYBR Green 染料檢測(cè)細(xì)胞目的基因的表達(dá)情況，并將β-actin作為內(nèi)參照，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為：PCR mix 10 μL、primer F 0.4 μL、primer R 0.4 μL、CDNA 1.0 μL、ddH2O 8.2 μL，總反應(yīng)體積為20 μL。反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 2 min預(yù)變性后，95℃ 15 s，60℃ 60 s 共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量公式:2-△△Ct,[△Ct=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，△△Ct=△Ct (實(shí)驗(yàn)樣本)-△Ct (對(duì)照樣本)]，計(jì)算細(xì)胞目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1　引物序列

2　結(jié)果

2.1高糖對(duì)NRK52E形態(tài)的影響葡萄糖中濃度組及葡萄糖高濃度組部分腎小管上皮細(xì)胞呈梭形或星形，并有廣泛的偽足形成，呈現(xiàn)出肌成纖維細(xì)胞特征(如圖1所示)。提示高糖條件下，腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

圖1高糖下腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(×200)

2.2高糖對(duì)NRK52E 中UBA52的表達(dá)及TGF/samd信號(hào)通路mRNA的影響葡萄糖中濃度組及葡萄糖高濃度組腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)UBA52 mRNA較葡萄糖低濃度組及葡萄糖+甘露醇組明顯增多(P<0.05)；兩兩比較的結(jié)果:葡萄糖高濃度組比葡萄糖中濃度組腎小管上皮細(xì)胞UBA52 mRNA表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；葡萄糖低濃度組與葡萄糖+甘露醇組腎小管上皮細(xì)胞UBA52 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)，提示UBA52基因表達(dá)增加呈葡萄糖濃度依賴性，滲透壓增加不影響UBA52基因表達(dá)。葡萄糖中濃度組及葡萄糖高濃度組腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)Smad7 mRNA較葡萄糖低濃度組及葡萄糖+甘露醇組明顯減少(P<0.05)；兩兩比較的結(jié)果顯示葡萄糖高濃度從低濃度、中濃度組到高濃度組腎小管上皮細(xì)胞Smad7 mRNA表達(dá)逐步減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；葡萄糖低濃度組與葡萄糖+甘露醇組腎小管上皮細(xì)胞Smad7 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。葡萄糖中濃度組及葡萄糖高濃度組腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1及α-SMA mRNA較葡萄糖低濃度組及葡萄糖+甘露醇組明顯增加(P<0.05)；兩兩比較的結(jié)果顯示葡萄糖濃度從低濃度組、中濃度組到高濃度組腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1及α-SMA mRNA表達(dá)逐步增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；葡萄糖低濃度組與葡萄糖+甘露醇組腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1及α-SMA mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05),提示伴隨著葡萄糖濃度的增加，UBA52、TGF-β1及α-SMA mRNA表達(dá)逐步增多，而Smad7表達(dá)逐步減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但滲透壓增加不能改變腎小管上皮細(xì)胞對(duì)UBA52、Smad7、TGF-β1及α-SMA的基因表達(dá)(表2)。

表2　不同葡萄糖濃度對(duì)NRK52E轉(zhuǎn)分化相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)的影響

注：與葡萄糖低濃度組比較，*P<0.05；與葡萄糖+甘露醇組比較，▲P<0.05；與葡萄糖中濃度組比較，▽P<0.05。

2.3UBA52與TGF-β/Smad信號(hào)通路的相關(guān)性分析對(duì)各組NRK52E 細(xì)胞中UBA52 mRNA與 TGF-β1 和Smad7 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，UBA52 mRNA與TGF-β1 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.58，P<0.05)；UBA52與 Smad7表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.61，P<0.05)。

3　討論

我國(guó)目前糖尿病患病率已達(dá)到11.6%，而其中約34.7%的患者并發(fā)不同程度的糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)[4]。糖尿病腎病是終末期腎功能衰竭的主要原因之一[5]，其主要的病理改變?yōu)槟I小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞是糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機(jī)制之一，其最主要的組織學(xué)特征是腎小管的萎縮和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，轉(zhuǎn)分化的肌成纖維細(xì)胞分泌的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分[6]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí),葡萄糖中濃度組及高濃度組的腎小管上皮細(xì)胞的確在形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)了肌成纖維細(xì)胞的特點(diǎn)，且其α-SMA表達(dá)明顯高于葡萄糖低濃度組，均說(shuō)明高糖促使腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。

TGF-β/Smad信號(hào)通路是腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及腎間質(zhì)纖維化的經(jīng)典通路。而該信號(hào)通路中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad7屬于負(fù)調(diào)控因子，可與TGF-β受體識(shí)別、牢固結(jié)合，介導(dǎo)TGF-β受體泛素化降解，抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路活性，其表達(dá)的上調(diào)，有助于防止腎小管向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[7-8]。近年來(lái)許多研究證實(shí)，高糖可通過(guò)調(diào)節(jié)泛素蛋白酶體途徑(Ubiquitin proteasome pathway，UPP)的活性，激活TGF-β/Smad信號(hào)通路，并且抑制Smad7的表達(dá)，這可能與TGF-β1介導(dǎo) E3 泛素連接酶 Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2(Smad ubiquitin adjustment factor 2，Smurf2)，特異性泛素化降解 Smad7 有關(guān)[2]。

UPP途徑的活性與泛素池內(nèi)游離泛素?cái)?shù)目有關(guān)。UBA52是一種泛素的前體，主要在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)，由1個(gè)泛素及52 個(gè)氨基酸殘基(核糖體蛋白L40)組成，經(jīng)過(guò)去泛素化酶水解后可釋放游離泛素。以往研究表明，糖尿病腎病動(dòng)物模型及患者血及尿中UBA52表達(dá)增加[9-11]，可能參與糖尿病腎病形成的機(jī)制，但其如何參與了糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚不明確?；蜓芯堪l(fā)現(xiàn)，其基因上游啟動(dòng)子區(qū)域存在E-box序列，高糖可與之結(jié)合后，啟動(dòng)UBA52大量表達(dá)[11]。本研究的結(jié)果表明,中、高葡萄糖濃度組腎小管上皮細(xì)胞中UBA52基因的表達(dá)較正常葡萄糖濃度組明顯增加，且呈葡萄糖濃度依賴性,也支持上述結(jié)論。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明高糖可抑制Smad7基因表達(dá)，上調(diào)TGF-β1、α-SMA基因表達(dá)，而上述基因表達(dá)的變化似乎與UBA52的表達(dá)呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。進(jìn)一步的相關(guān)性分析顯示UBA52 mRNA表達(dá)與Smad7 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與TGF-β1mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，提示UBA52可能參與了TGF-β/Smad信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，對(duì)TGF-β1及Smad7基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，而其發(fā)揮作用的機(jī)制可能是通過(guò)為UPP途徑提供泛素，最終導(dǎo)致Smad7被泛素化降解。因此，推測(cè)糖尿病腎病情況下，高糖通過(guò)刺激腎小管上皮細(xì)胞大量表達(dá)UBA52，持續(xù)活化TGF-β/Smad信號(hào)通路，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生，參與糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。但這一結(jié)論還需通過(guò)觀察UBA52的沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的作用進(jìn)一步證實(shí)。

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(本文編輯楊晨晨)

Effect of high glucose on expression of UBA52 mRNA and TGF-β/Smad Signaling pathway in Renal Tubular Cell

REN Rong,ZHANG Yan,ZHI Min,ZHANG Lei

(Department of Renal Disease,the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China)

ObjectiveTo explore the effect of high glucose on expression of UBA52 and TGF-β/Smad Signaling pathway in renal tubular cell.MethodsThe rat renal tubular epithelial cells (NRK52E) were cultured in vitro and divided into 4 groups based on its glucose concentration,which were group A (5.6 mmol/L glucose),group B (5.6 mmol/L glucose+24.6 mmol/L mannitol),group C (20.0 mmol/L glucose) and group D (30.0 mmol/L glucose),then cells of each group were cultured in different media for another 48 hours.Cells morphology of each group were observed.Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect UBA52,Smad7,TGF-β1,and α-SMA mRNA expression.ResultsHigh glucose can lead renal tubular epithelial cells to transdifferentiate into fibroblast.the mRNA expression of UBA52,TGF-β1,and α-SMA increased depending on glucose concentration,while the expression of Smad7 mRNA decreased.UBA52 mRNA was positively correlated with TGF-β1 (P<0.05) and negatively with Smad7 expression (P<0.05).ConclusionsUBA52 may be participated into the pathogenesis of diabetic nephropathy by activating on TGF-β/Smad pathway.

Diabetic nephropathy; UBA52; Smad7; Tubular epithelial trans-differentiation

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211C127)

任榮(1978-),女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腎臟病臨床與基礎(chǔ)。

芝敏，女，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腎臟病臨床與基礎(chǔ)，E-mail：627659081@qq.com。

S941.42+7

A

1009-5551(2016)11-1424-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.11.019

2016-06-05]