劉媛媛，馬愛民*（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

平菇疏水蛋白Po.hyd基因RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

劉媛媛，馬愛民*
（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

為研究平菇疏水蛋白基因Po.hyd的功能，首次構(gòu)建了Po.hyd的RNAi載體，并通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得了平菇轉(zhuǎn)化子。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增Po.hyd序列，利用Golden Gate克隆法構(gòu)建了干擾載體p1302-GG-ihyd，將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，并在乙酰丁香酮的誘導(dǎo)下完成根癌農(nóng)桿菌對平菇幼嫩菌絲的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR檢測、熒光顯微鏡觀察、實(shí)時定量熒光PCR技術(shù)（real-time PCR）以及Southern雜交等技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，本研究最終獲得1 株可穩(wěn)定遺傳的平菇轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子具有潮霉素抗性，且在熒光顯微鏡下可檢測到綠色熒光信號，Po.hyd基因的表達(dá)量為野生型的43%，干擾載體T-DNA片段以單拷貝的形式整合在轉(zhuǎn)化子基因組內(nèi)。

糙皮側(cè)耳；疏水蛋白；RNAi；根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)

疏水蛋白（hydrophobin）是表面活性最高的蛋白之一，具有可在臨界面形成兩性親和蛋白膜的特殊性質(zhì)，在食品生產(chǎn)及保藏領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。2009年Cox等[3]將里氏木霉（Trichoderma reesei）的Ⅱ型疏水蛋白HFBⅡ加入到巧克力奶昔中，改善了奶昔泡沫的穩(wěn)定性，該研究認(rèn)為是疏水蛋白在奶昔氣泡的表面形成了穩(wěn)固的兩親蛋白膜，從而防止了氣泡的歧化與合并。2010年Stübner等[4]將黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）的Ⅱ型疏水蛋白FcHyd5p基因?qū)氲疆叧嘟湍福≒ichia pastoris）中，結(jié)果顯示添加疏水蛋白FcHyd5p的碳酸溶液發(fā)生了液體迸出現(xiàn)象，而對照組并無此現(xiàn)象產(chǎn)生。2012年Niu Baolong等[5]克隆了T. reesei的疏水蛋白基因HFBI并將其導(dǎo)入至P. pastoris中進(jìn)行異核表達(dá)，啤酒曝氣實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，疏水蛋白是啤酒迸出現(xiàn)象的強(qiáng)誘導(dǎo)因子，也說明了疏水蛋白作為乳化劑和啤酒爆瓶預(yù)測因子的可行性。近年來疏水蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)，然而對于疏水蛋白基因功能的研究少有報(bào)道。

RNAi技術(shù)[6]，稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)（post transcriptional gene silencing，PTGS），已被廣泛應(yīng)用于香菇（Lentinula edodes）[7]、糙皮側(cè)耳[8-9]、灰蓋鬼傘（Coprinus cinereus）[10]、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）[11]、雙色蠟?zāi)ⅲ↙accaria bicolor）[12]等食用菌的基因功能研究中。RNAi技術(shù)的核心是RNAi載體的構(gòu)建，構(gòu)建方法主要有：酶切連接法[13]、重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（overlap extension- polymerase chain reaction，OE-PCR）[14]、自主連接克隆法（ligation-independent cloning，LIC）[15]、Gateway法[16]以及Golden Gate克隆法[17]。其中，Golden Gate克隆法通過酶切與連接同步進(jìn)行的方式來形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，具有高效、省時和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)[18]。

平菇（Pleurotus ostreatus）是我國最主要的人工栽培食用菌之一[19]。本實(shí)驗(yàn)室前期克隆了平菇疏水蛋白基因Po.hyd[20]，并構(gòu)建了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的平菇轉(zhuǎn)化體系[21]。本研究采用Golden Gate技術(shù)構(gòu)建Po.hyd干涉載體并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，為后續(xù)Po.hyd基因功能的研究提供基礎(chǔ)，并為RNAi技術(shù)在其他大型真菌中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

平菇739、根癌農(nóng)桿菌GV3101為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

質(zhì)粒pCAMBIA1302-GUS（具有潮霉素hph基因、綠色熒光蛋白GFP、以及GUS標(biāo)記）為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室改造并保存；質(zhì)粒pRNAi-GG為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所言普研究員贈送。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

Taq酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、SacⅠ 日本TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶BsaⅠ New England Biolabs公司；T4 DNA Ligase、M-MLV Reverse Transcriptase美國Promega公司；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒 美國Axygen公司；Fast Start Universal SYBR Green Master 羅氏公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-Blunt載體、Fast-Pfu DNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司；Southern雜交試劑盒 美國GE公司。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g， ddH2O 1 000 mL；LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，ddH2O 1 000 mL，加瓊脂粉15 g即LB固體培養(yǎng)；基本培養(yǎng)基（minimal medium，MM）：20×磷酸鹽緩沖液10 mL、鹽溶液10 mL，HCl調(diào)pH值至7.0；誘導(dǎo)培養(yǎng)基（IM）：20×MM培養(yǎng)基5 mL、50%甘油1 mL、1 mol/L葡萄糖溶液l mL、1 mol/L MES緩沖液4 mL、20 mmol/L AS溶液1 mL，無菌ddH2O至100 mL。共培養(yǎng)培養(yǎng)基（Co-CM）：瓊脂粉1.5 g、與IM等量的各成分（葡萄糖減半）、ddH2O 80 mL。

1.3 儀器與設(shè)備

尼康80i熒光顯微鏡 日本尼康公司；ABI ViiA7 Real-time PCR儀 美國Applied Biosystem公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已發(fā)表的Po.hyd（GenBank登錄號AF331452）、載體pCAMBIA1302序列（GenBank登錄號AF234298）利用軟件Primer 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，熒光定量PCR反應(yīng)的內(nèi)參基因引物為βtub-S與βtub-AS[22]，引物序列見表1。

表1 所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.5 總RNA的提取

參照TaKaRa RNAisoTMplus說明書進(jìn)行操作。

1.6 cDNA第一鏈的合成與Po.hyd基因編碼區(qū)序列擴(kuò)增

參照M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cDNA的第一鏈。Po.hyd基因PCR擴(kuò)增體系如下：Fast-pfu DNA聚合酶（10 U/μL）0.2 μL、cDNA模板2 μL、Po.hyd上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、5×Fast-pfu Buffer 5 μL、ddH2O補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)為32 個，72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物連接pEASY-Blunt載體并測序，并用BLAST程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列分析與比對。

1.7 干擾載體pRNAi-GG-ihyd及p1302-GG-ihyd的構(gòu)建

干擾載體pRNAi-GG-ihyd的構(gòu)建參照pRNAi-GG載體說明書進(jìn)行。選用RNAi-AS與M13F、RNAi-AS與M13R兩對引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，延伸時間為別為40 s以及90 s，其他擴(kuò)增條件同1.5節(jié)。

p1302-GG-ihyd載體構(gòu)建步驟：HindⅢ與SacⅠ雙酶切載體pRNAi-GG-ihyd與pCAMBIA1302-GUS，分別回收片段和載體骨架，回收產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，經(jīng)Po.hyd基因菌落PCR，與HindⅢ與SacⅠ雙酶切進(jìn)一步確定陽性質(zhì)粒。p1302-GG-ihyd構(gòu)建策略如圖1所示。

圖1 p1302-GG-ihyd載體構(gòu)建策略Fig. 1 p1302-GG-ihyd vector construction strategy

1.8 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)菌絲轉(zhuǎn)化

參照華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的農(nóng)桿菌介導(dǎo)體系進(jìn)行操作[12]。

1.9 轉(zhuǎn)化子的PCR初步鑒定

十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取轉(zhuǎn)化子菌絲DNA并作為模板，分別擴(kuò)增hph和GFP基因片段，反應(yīng)體系如1.6節(jié)所述，57 ℃退火30 s，72 ℃分別延伸70 s與30 s，其他擴(kuò)增條件見1.6節(jié)。

1.10 轉(zhuǎn)化子的熒光顯微鏡鑒定

將1.9節(jié)步驟中認(rèn)定為陽性的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基中央，于培養(yǎng)基中插入若干無菌玻璃片，25 ℃避光倒置培養(yǎng)7 d，用于觀察菌絲綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

1.11 平菇轉(zhuǎn)化子real-time PCR檢測Po.hyd基因干擾效率

轉(zhuǎn)化子Po.hyd基因熒光定量PCR參照Fast Start Universal SYBR Green Master說明書進(jìn)行。Po.hyd基因的Ct值以及表達(dá)量參照公式ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

式中：Ct1為待測樣本中Po.hyd基因的Ct值；Ct2為待測樣本中內(nèi)標(biāo)基因的Ct值；Ct1’為對照樣本中Po.hyd基因的Ct值；Ct2’為對照樣本中內(nèi)標(biāo)基因的Ct值。

1.12 Southern雜交鑒定T-DNA插入拷貝數(shù)

擴(kuò)大培養(yǎng)1.10節(jié)中能夠觀測到綠色熒光信號的轉(zhuǎn)化子，提取其基因組DNA經(jīng)HindⅢ酶切過夜，以潮霉素基因Hyg作為探針進(jìn)行雜交，具體實(shí)驗(yàn)操作按GE公司雜交試劑盒進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 Po.hyd基因DNA序列克隆與分析

圖2 平菇菌絲總RNNAA與Poo..hhyydd基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of total RNA and PCR amplifi ed products of the Po.hyd gene from P. ostreatus

平菇RNA的電泳檢測結(jié)果如圖2A所示，28S rRNA條帶與18S rRNA條帶亮度比例約為2∶1，表明提取的總RNA較完整，質(zhì)量符合要求。Po.hyd基因編碼區(qū)cDNA序列擴(kuò)增結(jié)果，如圖2B所示，擴(kuò)增得大小為330 bp左右的單一條帶，與預(yù)期大小一致，結(jié)合測序結(jié)果，表明所獲得基因片段與GenBank中Po.hyd的序列相同。

2.2 重組質(zhì)粒pRNAi-GG-ihyd、p1302-GG-ihyd的構(gòu)建

圖3 質(zhì)粒pRNAi-GG-ihyd引物與酶切位點(diǎn)及菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3 Restriction enzyme cleavage sites of pRNAi-GG-ihyd vector and colony PCR products of pRNAi-GG-ihyd

重組質(zhì)粒pRNAi-GG-ihyd引物結(jié)合位點(diǎn)與酶切位點(diǎn)圖如3A所示，菌落PCR結(jié)果如圖3B所示，其中引物RNAi-AS與M13R（泳道1）所擴(kuò)基因1 400 bp、RNAi-AS與M13F（泳道2）所擴(kuò)基因600 bp均與預(yù)期結(jié)果一致，結(jié)合測序結(jié)果，進(jìn)一步證明載體pRNAi-GG-ihyd構(gòu)建成功。

圖4 p1302-GG-ihyd載體PCCRR及HHiinnddⅢ與SSaaccⅠ雙酶切結(jié)果Fig. 4 PCR products and double enzyme digestion of p1302-GG-ihyd vector with Po.hyd gene using HindⅢ and SacⅠ

p1302-GG-ihyd載體的菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖4A所示，擴(kuò)增結(jié)果為單一條帶，大小330 bp與預(yù)期一致，而HindⅢ與SacⅠ雙酶切驗(yàn)證結(jié)果（圖4B），目的條帶約3 200 bp符合預(yù)期，證明干擾載體p1302-GG-ihyd構(gòu)建成功，可用于平菇菌絲轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

2.3 轉(zhuǎn)化子潮霉素選擇性培養(yǎng)

圖5A為平菇菌絲與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)60 h菌絲的生長情況，菌絲在農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的情況下菌絲生長良好，菌落于濾紙片四周分布均勻，菌絲長度與密度相對均衡。圖5B為潮霉素選擇性培養(yǎng)的菌落生長情況，可見在潮霉素抗性選擇壓力下，濾紙片四周的菌落分布不均勻，菌絲長度及密度差異較大，其中未轉(zhuǎn)化成功的菌絲不具備潮霉素抗性，呈現(xiàn)出不生長或者死亡狀態(tài)，而轉(zhuǎn)化成功的菌絲獲得了潮霉素抗性，菌絲在抗性篩選的情況下菌絲萌發(fā)伸長，呈現(xiàn)出生長趨勢。用接種針將具有潮霉素抗性的菌落轉(zhuǎn)接至新的潮霉素培養(yǎng)平板中，菌絲生長狀況如圖5C所示，可見菌絲雖較為稀疏但仍可正常生長，同時將野生型菌株置于潮霉素平板中培養(yǎng)作為對照，結(jié)果如圖5D所示，可見野生型菌株在潮霉素平板中不生長。初步認(rèn)定在潮霉素抗性培養(yǎng)基中可以正常生長的菌株為擬轉(zhuǎn)化子，經(jīng)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的篩選確定為轉(zhuǎn)化子。

圖5 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化各階段菌絲的生長狀態(tài)Fig. 5 Growth status of the mycelia of transformants via Agrobacterium tumefaciens mediation

2.4 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

以擬轉(zhuǎn)化子DNA作為模板，利用hph及GFP引物進(jìn)行PCR鑒定，檢測hph基因PCR結(jié)果如圖6A所示，潮霉素?cái)U(kuò)增結(jié)果為單一的且大小為1 000 bp左右的條帶，結(jié)合測序結(jié)果，證明潮霉素基因已經(jīng)成功插入至轉(zhuǎn)化子DNA中，如圖6B為GFP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增結(jié)果為500 bp單一條帶，結(jié)合測序結(jié)果證明7 株擬轉(zhuǎn)化子有5 株能同時擴(kuò)出潮霉素hph及GFP基因，初步認(rèn)證獲得5 株轉(zhuǎn)化子。

圖6 擬轉(zhuǎn)化子hhpphh基因與GGFFPP基因PCRR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 6 PCR products of the hph gene and the GFP gene from putative transformants

圖7 轉(zhuǎn)化子的熒光檢測、real-time PCR及Southern雜交分析Fig. 7 Fluorescence detection and real-time PCR and Southern blot analysis of P. ostreatus transformants

2.5 轉(zhuǎn)化子的熒光檢測熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化子的綠色熒光蛋白表達(dá)情況，圖7A為5號轉(zhuǎn)化子的自然光與熒光顯微成像。圖7B為5號菌絲的熒光顯微成像圖，可見在藍(lán)光激發(fā)下可發(fā)出清晰的綠色熒光，證明綠色熒光蛋白GFP在轉(zhuǎn)化子中獲得表達(dá)，說明轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)獲得成功。

2.6 平菇轉(zhuǎn)化子real-time PCR檢測Po.hyd基因干擾效率選取3 株能檢測出綠色熒光信號的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行real-time PCR分析。由圖8可知，5號和14號菌株P(guān)o.hyd基因的表達(dá)明顯被抑制，9號菌株的Po.hyd基因表達(dá)量變化不大。轉(zhuǎn)化子中Po.hyd基因被抑制的效果存在較大差異，是由于干擾載體的T-DNA區(qū)隨機(jī)整合在基因組中的位置不同造成，插入位點(diǎn)附近的基因復(fù)雜性導(dǎo)致了啟動子的啟動效率差異，進(jìn)而導(dǎo)致基因的干擾效率表現(xiàn)不一致。

圖8 野生型及轉(zhuǎn)化子的熒光檢測、real-time PCR及Southern雜交分析Fig. 8 Fluorescence detection and real-time PCR and Southern blot analysis of P. ostreatus transformants and the wild-type strain

2.7 轉(zhuǎn)化子Southern雜交結(jié)果分析

圖9 轉(zhuǎn)化子的熒光檢測、real-time PCR及Southern雜交分析Fig. 9 Fluorescence detection and real-time PCR and Southern blot analysis of P. ostreatus transformants

對3 個陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果如圖9所示，只有5號菌株獲得了單條雜交信號，9號與14號轉(zhuǎn)化子與野生型菌未獲得雜交信號。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因尚不明確，這種轉(zhuǎn)化子遺傳性狀不穩(wěn)定的現(xiàn)象在Peng等[23]研究聚乙二醇介導(dǎo)平菇雙核菌絲原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中也曾出現(xiàn)過，該研究也獲得了具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，但轉(zhuǎn)化子的抗性于3～6 周后消失。轉(zhuǎn)化子表型不穩(wěn)定可能與啟動子的選擇或外源片段隨機(jī)插入宿主基因組中的位置有關(guān)，也可能是高等真核生物基因自主修復(fù)的結(jié)果，但造成轉(zhuǎn)化子抗性丟失這種現(xiàn)象的分子機(jī)制尚未得到具體解釋。

3 結(jié) 論

本研究獲得1 株可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子，其基因組DNA可以檢測到外源hph基因與GFP基因，在熒光顯微鏡下可檢測出綠色熒光，Southern雜交為單一條帶，轉(zhuǎn)化子表達(dá)量結(jié)果顯示，Po.hyd基因表達(dá)量為野生型的43%，說明RNAi載體構(gòu)建與農(nóng)桿菌介導(dǎo)平菇的遺傳轉(zhuǎn)化獲得成功，外源基因以單拷貝形式插入轉(zhuǎn)化子基因組中，與Ding Yi等[21]構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)平菇菌絲轉(zhuǎn)化體系相符。

對于real-time PCR檢測結(jié)果出現(xiàn)的Po.hyd基因表達(dá)量變化差異較大的現(xiàn)象，這一方面與以及T-DNA的插入位點(diǎn)有關(guān)。外源片段隨機(jī)插入到轉(zhuǎn)化子的染色體中有關(guān)，不同插入位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化子基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜性有所不同，致使外源插入基因與宿主基因之間的互作方式各不相同，故而表現(xiàn)出不同的基因干擾效率。Southern雜交結(jié)果顯示，部分轉(zhuǎn)化子多次傳代后出現(xiàn)了抗性基因丟失的現(xiàn)象，這與啟動子的選擇有關(guān)，啟動子是負(fù)責(zé)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的相關(guān)上游元件，對基因的表達(dá)水平具有決定性的影響，有研究指明內(nèi)源強(qiáng)啟動子可以減少基因的甲基化現(xiàn)象，有助于維持轉(zhuǎn)化子遺傳性狀的穩(wěn)定以及外源基因的高效表達(dá)[24-25]。而本實(shí)驗(yàn)選用的35S啟動子，雖然是真核生物的組成型啟動子，但在平菇內(nèi)的啟動效率可能不如內(nèi)源啟動子穩(wěn)定，不能夠高效并穩(wěn)定的表達(dá)潮霉素基因。另外，值得說明的是轉(zhuǎn)化子遺傳性狀相對穩(wěn)定，還與農(nóng)桿菌種類、載體的結(jié)構(gòu)、抗性基因的選擇以及轉(zhuǎn)化方法等因素有關(guān)[21,25]。

后續(xù)的研究將對Po.hyd RNAi轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因功能方面的驗(yàn)證，同時結(jié)合Po.hyd的超表達(dá)載體與反義RNA載體來共同研究該基因的功能。

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Construction of RNAi Vector and Transformation of Hydrophobin Gene Po.hyd in Pleurotus ostreatus

LIU Yuanyuan, MA Aimin*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

RNAi vector for Pleurotus ostreatus hydrophobin gene, Po.hyd, was constructed and transformants were obtained by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. Po.hyd was cloned by PCR method using the Golden Gate technology to build the interference vector p1302-GG-ihyd, which had a neck ring structure. Finally, this vector was transferred into A. tumefaciens GV3101 under the induction of acetosyringone (AS), the young mycelia were mediated by A. tumefaciens, and the transformants were detected and identifi ed by PCR amplifi cation, fl uorescence microscopy, real-time PCR and Southern blot technique. One genetically stable P. ostreatus transformant was obtained, which was hygromycin resistant. The green fl uorescence signal could be detected under a fl uorescence microscope, and the expression of Po.hyd was 43% compared with the wild type strain. The exogenous DNA was integrated into the genome in a single copy. This result will lay the preliminary foundation for further studies on the function of Po.hyd.

Pleurotus ostreatus; hydrophobin; RNAi; Agrobacterium tumefaciens mediated transformation

10.7506/spkx1002-6630-201611015

Q78

A

1002-6630（2016）11-0084-06

劉媛媛, 馬愛民. 平菇疏水蛋白Po.hyd基因RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 84-89. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611015. http://www.spkx.net.cn

LIU Yuanyuan, MA Aimin. Construction of RNAi vector and transformation of hydrophobin gene Po.hyd in Pleurotus ostreatus[J]. Food Science, 2016, 37(11): 84-89. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611015. http://www.spkx.net.cn

2015-08-23

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31172011；30771502）

劉媛媛（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：lyy0425@foxmail.com

*通信作者：馬愛民（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：aiminma@mail.hzau.edu.cn