袁秀梅 李思甌 尹昌浩*

（1牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院神經(jīng)科，牡丹江157003；2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院內(nèi)分泌科，牡丹江157003）

人參皂甙Rbl對大鼠局灶性腦缺血細(xì)胞凋亡的抑制作用※

袁秀梅1李思甌2尹昌浩1*

（1牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院神經(jīng)科，牡丹江157003；2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院內(nèi)分泌科，牡丹江157003）

目的探究人參皂甙Rbl對大鼠局灶性腦缺血細(xì)胞凋亡的抑制作用。方法首先建立一個阻塞大鼠大腦局灶性暫時腦缺血的模型，將神經(jīng)功能出現(xiàn)缺失癥的大鼠按照隨機(jī)的原則分別分為GRb1組與缺血組，然后對灌注后的GRb1組大鼠進(jìn)行人參皂甙Rbl腹腔注射，以45 mg/kg為宜，對這些大鼠進(jìn)行不同時間階段的再灌注，按照時間點的不同，將GRb1組大鼠分為7個組別，然后用免疫組織化學(xué)法以及原位末端標(biāo)記法對大鼠的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行觀察分析。結(jié)果經(jīng)過參皂甙Rbl干預(yù)的GRb1組大鼠與缺血組相比，其各分組內(nèi)的大鼠凋亡細(xì)胞數(shù)量降低，且僅在灌注的12 h～3 d時間階段內(nèi)的降低數(shù)量差異比較明顯，NAIP陽性細(xì)胞數(shù)在進(jìn)行再灌注12 h～10 d與缺血組有著明顯的差別，Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)在灌注12 h～10 d期間出現(xiàn)了明顯的上升趨勢，且與缺血組大鼠相比，Bax陽性細(xì)胞數(shù)在相同的時間點出現(xiàn)下降。結(jié)論采用人參皂甙Rbl能夠通過對NAIP與Bcl-2的促進(jìn)起到對大鼠的局灶性腦缺血細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，可以在臨床醫(yī)學(xué)中得以廣泛地推廣、應(yīng)用。

人參皂甙Rbl；大鼠；局灶性腦缺血；細(xì)胞凋亡；抑制；動物實驗；中風(fēng)

隨著我國社會主義現(xiàn)代化建設(shè)的不斷發(fā)展，我國的醫(yī)療衛(wèi)生水平得到了空前的提升。目前，臨床醫(yī)學(xué)中對人參單體的作用進(jìn)行了深入研究，并取得了卓有成效的研究成果。人參皂甙Rbl能夠在一定程度上減少局灶性腦缺血的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)脊髓神經(jīng)元的恢復(fù)生長，進(jìn)而對局灶性腦缺血起到保護(hù)作用。為了探究人參皂甙Rbl對大鼠局灶性腦缺血細(xì)胞凋亡的抑制作用，特建立阻塞大鼠大腦局灶性暫時腦缺血的模型，并進(jìn)行深入研究，現(xiàn)對此做一個匯報：

1 資料與方法

1.1 一般資料首先隨機(jī)選取雌雄不均的成年Wistar大鼠，體質(zhì)量在240 g～300 g之間，實驗中所用到的人參皂甙Rbl經(jīng)醫(yī)學(xué)奠定純度在98%以上，單克隆小鼠抗Bax、Bcl-2，生物素化羊抗小鼠抗體及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素由北京生物試劑公司提供，單克隆小鼠抗神經(jīng)元凋亡抑制蛋白由Santa Cruz公司提供，對細(xì)胞凋亡檢測的試劑盒則是從武漢博士德公司購進(jìn)［1］。

1.2 研究方法首先要建立一個局灶性腦缺血模型，可以按照線栓法對其進(jìn)行詳細(xì)制作，采用1%的戊巴比妥鈉腹腔對大鼠進(jìn)行注射麻醉，然后在無菌的環(huán)境下，對大鼠的頸部腹側(cè)行一切口，使這個切口充分暴露，對大鼠的右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)外動脈進(jìn)行分離，對直徑0.2 mm左右的尼龍線進(jìn)行尖端燒圓并沿著頸外動脈分叉處插入距離在1.8 cm左右，大致到大鼠的頸內(nèi)動脈出現(xiàn)大腦中動脈的地方，阻塞持續(xù)2 h左右，然后用乙醚將大鼠麻醉，再將尼龍線推出至頸內(nèi)動脈頸部，進(jìn)而實現(xiàn)再次灌注［2］。然后將具有神經(jīng)功能缺失癥的大鼠按照隨機(jī)的原則分為人參皂甙Rbl組與缺血組，在對Rbl組進(jìn)行再灌注時需向其注射40 mg/kg的人參皂甙，而對于假手術(shù)組的大鼠，由于尼龍線長度不夠，難以達(dá)到頸內(nèi)動脈的大腦動脈處，這4只大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)缺失癥狀，可將其作為正常對照組，對實驗組大鼠在進(jìn)行再灌注后3 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、10 d這些時間點，以每個時間點4只對其進(jìn)行麻醉處死，而對照組大鼠則在手術(shù)后的2 d進(jìn)行處死，大鼠的腦組織采用4%多聚甲醛以及生理鹽水進(jìn)行心臟灌注固定，用石蠟包埋，切片呈現(xiàn)5 um厚度的冠狀［3］。

1.3 免疫組織化學(xué)首先對切片進(jìn)行脫蠟處理，抗原經(jīng)復(fù)合消化液（Bax）、0.1%胰酶（NAIP）和0.01 mol/L檸檬酸緩沖液熱修復(fù)（Bcl-2）處理；將10%山羊血清在室環(huán)境下溫孵育20 min左右，單克隆抗體Bcl-2、bax和NAIP（1∶100），在37℃溫度下孵育60 min，生物素化羊抗小鼠二抗，37℃，30 min；HRP-Streptavidin，37℃室溫下孵育30 min。上述各項步驟結(jié)束后，采用0.01 mol/L的磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，以3～5次為宜，孵育在濕盒內(nèi)進(jìn)行。DAB顯色3～5 min，蘇木素輕度復(fù)染。陰性對照除不加一抗外，其余處理相同。

1.4 細(xì)胞凋亡分析對大鼠腦缺血細(xì)胞凋亡的檢測試劑盒來確定DNA鏈斷裂的的細(xì)胞數(shù)量。首先，采用蛋白酶K消化以及2%的過氧化氫溶液對脫蠟切片的內(nèi)源性過氧化物酶活性進(jìn)行抑制［4］，然后通過末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶以及生物素化抗地高新抗體對切片進(jìn)行處理，采用陰性對照則用水代替TdT，然后用蘇木素對細(xì)胞核進(jìn)行輕度復(fù)染。

1.4 圖片分析與統(tǒng)計學(xué)處理選取每只大鼠4張左右的前囪后1.9～2.9 mm冠狀切面切片進(jìn)行觀察分析，主要對大鼠的缺血側(cè)皮質(zhì)、紋狀體以及視前區(qū)進(jìn)行觀察，并準(zhǔn)確記錄大鼠免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)以及凋亡的細(xì)胞數(shù)量［5］，Rbl組與缺血組的同時間點采用t進(jìn)行檢驗，Rbl組內(nèi)部的不同時間點的比較用方差進(jìn)行分析，所采用的計量數(shù)據(jù)用X列卡方來進(jìn)行檢驗，當(dāng)P＜0.05時，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)過實驗分析，假手術(shù)組與正常組大鼠腦實質(zhì)內(nèi)可以看出0～3個的細(xì)胞凋亡（如圖1），對大鼠進(jìn)行腦缺血再灌注，3 h后凋亡的細(xì)胞數(shù)量開始出現(xiàn)上升，到了24 h后，達(dá)到了一個巔峰，然后逐漸出現(xiàn)下降趨勢，到了10 d時，其細(xì)胞凋亡指標(biāo)與對照組相比仍有明顯的差異（P＜0.05），大鼠的凋亡細(xì)胞主要集中分布在視前區(qū)、額頂皮質(zhì)以及紋狀體（如圖2），并且細(xì)胞凋亡大部分都出現(xiàn)在梗死灶邊緣位置。另外，細(xì)胞凋亡主要是以神經(jīng)元為主，除此之外還包含了血管內(nèi)皮細(xì)胞、脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞等。通過對GRb1組的分析，可以發(fā)現(xiàn)其與缺血組相比，在再灌注的12 h時，細(xì)胞凋亡開始出現(xiàn)了明顯的下降趨勢，該現(xiàn)象持續(xù)到3 d（P＜0.05）（如圖3），在再灌注5 d～10 d期間，GRb1組與缺血組沒有明顯的差異，無統(tǒng)計學(xué)意義（如圖4）。

圖1 假手術(shù)組與正常組大鼠細(xì)胞凋亡情況

圖2 大鼠凋亡細(xì)胞分布圖

圖3 再灌注12h細(xì)胞凋亡情況

圖4 再灌注5～10 d細(xì)胞凋亡情況

3 討論

目前，臨床醫(yī)學(xué)中對缺血性神經(jīng)元損傷進(jìn)行深入的研究，并取得了一定的研究成果。細(xì)胞的凋亡與壞死是并存的，通過本次研究，可以發(fā)現(xiàn)局灶性腦缺血會引起大量細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，研究結(jié)果與以往相比，有著一致性，該實驗結(jié)果顯示，GRb1組通過大腦中動脈阻塞后施以GRb1能夠有效抑制由于腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡，盡管對GRb1抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍是模糊的，但可以得知缺血性神經(jīng)元損傷主要包括的病理有谷氨酸興奮性毒性、自由基以及基因表達(dá)的改變［6］。而GRb1具有清除自由基的功效，并能夠有效抑制鈣物質(zhì)的過量流入，對神經(jīng)元起到一定的保護(hù)作用。對大鼠進(jìn)行GRb1注射，然后實行再灌注，在12 h后就能夠使bcl-2的陽性細(xì)胞數(shù)明顯升高，而bax陽性細(xì)胞卻開始出現(xiàn)下降，這在一定程度上是抗凋亡機(jī)制的表現(xiàn)。該研究結(jié)果與國內(nèi)學(xué)者報道缺血預(yù)處理促進(jìn)bcl-2表達(dá)和抑制bax表達(dá)的研究結(jié)果相似，說明Bcl-2蛋白表達(dá)能夠增加而Bax蛋白則呈現(xiàn)下降，是抗凋亡的一種機(jī)制。此外，聶榮慶等學(xué)者在研究報道中將原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中加入Rb1，可以發(fā)現(xiàn)其能夠降低由于低氧所致的神經(jīng)元的凋亡率，增加bcl-2蛋白、降低bax蛋白的表達(dá)。因此，在體和離體實驗均證實Rb1通過上調(diào)bcl-2蛋白和下調(diào)bax蛋白表達(dá)，提高bcl-2與bax的比率抑制細(xì)胞凋亡，從而在大鼠的實驗性卒中中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。目前有研究表明人參皂苷Rb1能促進(jìn)周圍神經(jīng)軸突生長，但其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中軸突的作用尚未有研究。本實驗在MCAO/R 3 d后，模型組胼胝體APP蛋白表達(dá)增多并出現(xiàn)聚集，在內(nèi)囊也有聚集。而經(jīng)GSRb1干預(yù)的大鼠APP蛋白表達(dá)降低，表明人參皂苷Rb1可能促進(jìn)中樞神經(jīng)軸突重塑。本次研究中建立了大鼠腦缺血模型，在灌注3 h后，NAIP陽性細(xì)胞呈現(xiàn)出上升趨勢，2 d后達(dá)到頂峰，后逐漸下降，其作為一種內(nèi)源性凋亡抑制物，能夠使caspase-3以及caspase-7失活，同時對細(xì)胞凋亡起到阻礙作用，進(jìn)而使GRb1出現(xiàn)上調(diào)，阻止神經(jīng)元凋亡。通過本次研究，可以發(fā)現(xiàn)GRb1對神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用，能夠抑制大鼠腦缺血凋亡細(xì)胞的降低，可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后康復(fù)中起促進(jìn)作用。具有一定的應(yīng)用價值，符合膠質(zhì)細(xì)胞比神經(jīng)元更能經(jīng)受缺血性損傷的理論，其作用機(jī)制與上調(diào)NAIP和Bcl-2蛋白和降低Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。臨床醫(yī)學(xué)可以對此進(jìn)行深入研究，在醫(yī)學(xué)事業(yè)中得以應(yīng)用發(fā)展。

［1］胡光強(qiáng)，張慧，蕭洪文，等.人參皂苷Rbl對大鼠局灶性腦缺血白質(zhì)重塑的影響［J］.中國臨床解剖學(xué)雜志，2015（4）：451-454.

［2］李亮，何軍鋒，蔡雄，等.人參皂苷Rg1對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的實驗研究［C］//第十二次全國中西醫(yī)結(jié)合實驗醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會暨第七次湖南省中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)科專業(yè)委員會學(xué)術(shù)年會論文集. 2015.

［3］王巧云，劉鳳，吳峰階，等.人參皂苷Rg1對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬p-ERK1/2與p-JNK表達(dá)的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，33（2）：229-234.

［4］游詠梅，薛偕華.電針足三里穴、曲池穴對腦缺血再灌注大鼠Bad及其磷酸化的影響［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（4）：21-23.

［5］江欣，陳立典.電針曲池、足三里對腦缺血大鼠NICD表達(dá)影響觀察［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（4）：25-26.

［6］Young L Y，Jin-Sun P，Eun-Jung L，et al.Anti-inflammatory Mechanism of GinsengSaponin Metabolite Rh3 in Lipopolysaccharide-Stimulated Microglia：Critical Role of 5'-Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase SignalingPathway.［J］.Journal ofAgricultural&Food Chemistry，2015，63（13）.

Inhibition of Ginsenosides Rbl on Focal Cerebral Ischemia and Apoptosis

YUAN Xiumei1，Li Siou2，YIN Changhao1*
（1.Department of Neurology，Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University，Helongjiang Province，Mudanjiang 157003，China；2.Department of Endocrinology，Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University，Helongjiang Province，Mudanjiang 157003，China）

Objective To explore the inhibition of ginsenosides Rbl on focal cerebral ischemia and apoptosis.Methods Firstly，a cerebral occlusion model of focal cerebral ischemia in temporarily was established.The neurological deficit disorder occurs in rats in accordance with the principle of random were divided into GRb1 group and ischemia group.After perfusion，the GRb1 group with large ginsenosides Rbl mice was injected intraperitoneally with 45mg/kg.These rats were given reperfusion in different period of time，according to different points in time，and the rats were divided into seven groups GRb1 groups.The immunohistochemistry TUNEL method was used to observe and analyze cell apoptosis of rats.Results After the intervention of ginsenoside Rbl GRb1 rats with ischemia group compared to the number of apoptotic cells in rats which each packet was lowered，and only reduce the number of differences in perfusion 12h～3d period of time within the more obvious，NAIP positive cells during reperfusion 12h～10d and ischemic group has a significant difference，Bcl-2 positive cells in perfusion has a clear upward trend during the 12h～10d，and compared with ischemic rats，Bax positive cells decline at the same point in time.Conclusion Ginsenoside Rbl through NAIP and promoting Bcl-2 plays a protective effect on focal cerebral ischemia in rat's apoptosis，and can be widely promotion and application in clinical medicine.

ginsenoside Rbl；rats；focal cerebral ischemia；apoptosis；inhibition；animal experiment；stroke

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.20.063

1672-2779（2016）-20-0138-03

楊杰 本文校對：尹昌浩

2016-06-21）

牡丹江醫(yī)學(xué)院科研項目資助（No：2010-06）

*通訊作者：yinchanghao7916@sina.com