王亞楠,王曉斐,丁　菡,張海棠,范國(guó)英,王自良,*

(1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

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鉻離子單克隆抗體的制備及食品總鉻含量檢測(cè)膠體金免疫層析試紙條的研制

王亞楠1,王曉斐2,丁菡1,張海棠1,范國(guó)英1,王自良1,*

(1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

目的:制備三價(jià)鉻離子螯合物單克隆抗體(Cr3+-EDTA mAb),研制膠體金免疫層析試紙條(Cr-Strip)。方法:用異硫氰酯法合成Cr3+-iEDTA-BSA,UV和ICP-AES進(jìn)行鑒定;細(xì)胞融合技術(shù)篩選Cr3+-EDTA mAb細(xì)胞株,體內(nèi)誘生腹水法制備Cr3+-EDTA mAb,并對(duì)其特性進(jìn)行分析;應(yīng)用Cr3+-EDTA mAb研制Cr-Strip,并測(cè)定其性能。結(jié)果:篩選出3株雜交瘤,最好的是2A11G5,Ka為2.69×109L/mol,對(duì)Cr3+-EDTA的IC50為9.84 μg/L,與其他重金屬離子無(wú)交叉反應(yīng);Cr-Strip的檢測(cè)時(shí)間為10 min,檢測(cè)限為5 μg/L,其檢測(cè)結(jié)果與ICP-AES符合率為100%。結(jié)論:制備出了高質(zhì)量的Cr3+-EDTA mAb,研制出更為靈敏的Cr-Strip。

Cr3+,免疫原,單克隆抗體,膠體金免疫層析,總鉻含量

近年來(lái),由于我國(guó)對(duì)鉻資源利用不夠科學(xué)和缺乏相應(yīng)保護(hù)措施,鉻對(duì)環(huán)境與食品的污染日趨加重[1]。國(guó)家環(huán)境保護(hù)部和國(guó)土資源部2014年4月聯(lián)合發(fā)布的《全國(guó)土壤污染調(diào)查公報(bào)》顯示,在調(diào)查的81塊工業(yè)廢棄地的775個(gè)土壤樣品中,鉻作為主要污染物超標(biāo)34.9%[2]。2014年9月發(fā)生在浙江省的“毒膠囊”事件,鉻超標(biāo)65倍,再次引發(fā)政府和社會(huì)對(duì)鉻污染超標(biāo)的廣泛關(guān)注。

由于鉻對(duì)人體健康具有肝臟[3]、腎臟[3]、遺傳[4]、神經(jīng)[5]和致癌[6]等多種毒性作用,尤其是Cr6+是Cr3+毒性的100倍[7]。我國(guó)為了嚴(yán)格控制鉻對(duì)食品的污染,衛(wèi)生部發(fā)布了《GB 2762-2011食品中污染物限量標(biāo)準(zhǔn)》,鉻限量標(biāo)準(zhǔn)為水產(chǎn)動(dòng)物及其制品≤2.0 mg/kg;谷物及其制品≤1.5 mg/kg;蔬菜及其制品≤0.5 mg/kg;豆類及其制品≤1.0 mg/kg;肉及肉制品≤1.0 mg/kg。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)環(huán)境與食品樣品中總鉻含量的檢測(cè)主要采用理化分析方法,如石墨爐原子吸收光譜法(GFAAS)[8]、火焰原子吸收光譜法(FAAS)[9]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[10]和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)[11]等,這些方法雖然精密度高,但由于儀器、技術(shù)、場(chǎng)地、成本等方面的制約,不便推廣應(yīng)用。

圖1　免疫原Cr3+-iEDTA-BSA合成路線Fig.1　Synthesis scheme of immunogen Cr3+-iEDTA-BSA

膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)成熟先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù),在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。國(guó)外Sasaki等[12]研制出了鉻離子免疫檢測(cè)器,檢測(cè)限達(dá)到1.6 μg/L;國(guó)內(nèi)顏露等[13]研制了抗Cr3+單克隆抗體;劉茜等[14]研究報(bào)道了鉻離子GICA檢測(cè)方法,但由于檢測(cè)限較高(50 μg/L),不能很好滿足實(shí)際檢測(cè)工作需要。本研究旨在制備穩(wěn)定性好、親和力高、識(shí)別能力強(qiáng)的Cr3+與EDTA螯合物單克隆抗體(Cr3+-EDTA mAb),研制更加靈敏的食品總鉻GICA試紙條檢測(cè)方法(Cr-Strip)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

SPF級(jí)4周齡雌性Balb/C小鼠5只,編號(hào)為M1～M5,新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可號(hào):SCXK(豫)2010-0002;鼠源骨髓瘤細(xì)胞NS0農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;重金屬氯化鉻、氯化鎘、氯化汞、氯化鋁、硫酸銅、硫酸鐵、硫酸錳、硝酸鉛、硝酸鋅標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自鄭州大學(xué)耐火材料研究所,均為AR級(jí);免疫原Cr3+-iEDTA-BSA、包被抗原Cr3+-iEDTA-OVA本課題組制備;弗氏佐劑CFA、IFASigma產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、HAT、HT和PEG-2000Gibco產(chǎn)品;氯金酸(HAuCl4·3H2O)、檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)Pierce產(chǎn)品;硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維棉、樣品墊Millipore公司;其它試劑AR級(jí);實(shí)驗(yàn)用水去離子水;待測(cè)樣品河水樣18份、大米樣30份、面粉樣30份、豬肉樣24份、蝦仁12份、大白菜16份共130份課題組分別從新鄉(xiāng)市、焦作市、鶴壁市、安陽(yáng)市采集。

UV-2450紫外掃描儀日本島津公司;Ultrospec 2000核酸蛋白分析儀美國(guó)Amersham Pharmacia公司;Optima 2100DV型ICP-AES美國(guó)PE公司;H-600透射電鏡日本HITACHI公司;X-only單向噴點(diǎn)儀、CM4000切槽儀美國(guó)Biodot公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1免疫原合成參照Kuang等[15]所述的異硫氰酯法加以改進(jìn)合成免疫抗原Cr3+-iEDTA-BSA,如圖1所示。

1.2.2免疫原鑒定紫外掃描鑒定:用Hepes溶液配置濃度為1 mg/mL BSA溶液,EDTA濃度為1 mg/mL Cr3+-iEDTA溶液,載體蛋白濃度為1 mg/mL的Cr3+-iEDTA-BSA溶液,在波長(zhǎng)220～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。

載體蛋白BSA與Cr3+質(zhì)量濃度測(cè)定:用Hepes溶液配制載體蛋白BSA濃度為20 mg/mL的Cr3+-iEDTA-BSA溶液,倍比稀釋,濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/mL,用Ultrospec 2000核酸蛋白分析儀在278 nm測(cè)定Cr3+-iEDTA-BSA中BSA的質(zhì)量濃度;用ICP-AES測(cè)定Cr3+的質(zhì)量濃度,參照張麗萍[16]所述的方法進(jìn)行,ICP-AES工作條件為射頻頻率40.68 Hz,正向功率1.0 kW,冷卻氣流量16.0 L/min,輔助氣流量1.0 L/min,載氣流量0.7 L/min,延遲時(shí)間30 s,積分時(shí)間5 s,分析線267.72 nm,線性回歸方程為y=985.2x-14.5,R2為1.0,檢測(cè)范圍為0.005～200.0 mg/L,檢測(cè)限為5 μg/L。

1.2.3Cr3+-EDTA mAb的制備選擇細(xì)胞融合小鼠:用Cr3+-iEDTA-BSA按正常程序免疫5周齡雌性Balb/C小鼠5只,免疫5次,時(shí)間間隔4周,最后1次免疫后第28 d斷尾采血分離血清,間接ELISA測(cè)定多抗血清效價(jià),以此判定免疫效果;用icELISA測(cè)定多抗血清對(duì)Cr3+-EDTA的抑制效價(jià),以50%抑制濃度(IC50)判定敏感性,選擇多抗血清效價(jià)<1:(1×104)且對(duì)Cr3+-EDTA半數(shù)抑制濃度(IC50)最小的小鼠用于細(xì)胞融合。

細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞株的篩選:按常規(guī)方法將免疫脾細(xì)胞與NS0瘤細(xì)胞以1∶10比例混合,在500 mL/L PEG-1500作用下進(jìn)行融合、篩選和克隆化[17],待確定雜交瘤細(xì)胞已單克隆化,用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選,建立細(xì)胞株,凍存于液氮備用。Cr3+-EDTA mAb制備:體內(nèi)誘生腹水法制備Cr3+-EDTA mAb[18]。

1.2.4Cr3+-EDTA mAb特性分析穩(wěn)定性分析:將凍存的3株雜交瘤細(xì)胞2A3C11、2A3D9、2A11G5和鼠源骨髓瘤細(xì)胞NS0,每間隔10 d復(fù)蘇并傳代1次,共傳代9次,每次傳代用間接ELISA檢測(cè)不同代次細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體效價(jià)情況,以測(cè)定雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性。

親和性分析:按照Kim等[19]所述Batty飽和法測(cè)定親和常數(shù)(Ka),按式(1)進(jìn)行計(jì)算。

式(1)

式中:Ka為親和常數(shù);n為每組中包被抗原Cr3+-iEDTA-OVA兩個(gè)包被濃度的稀釋倍數(shù);[Ab]t為抗原濃度為[Ag]t時(shí)50% Amax對(duì)應(yīng)的抗體濃度;[Ab′]t表示抗原濃度為[Ag′]t時(shí)50% Amax對(duì)應(yīng)的抗體濃度。

靈敏性分析:間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定Cr3+-EDTA mAb對(duì)Cr3+-EDTA的半數(shù)抑制濃度(IC50),確定其靈敏性。

特異性分析:間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定Cr3+-EDTA mAb對(duì)Cd2+、Hg2+、Al3+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Pb2+、Zn2+等金屬離子與EDTA的螯合物及EDTA的交叉反應(yīng)率,按式(2)進(jìn)行計(jì)算。

式(2)

式中:CR為交叉反應(yīng)率;P為Cr3+-EDTA mAb對(duì)Cr3+-EDTA的IC50;P1為金屬離子與EDTA的螯合物及EDTA的IC50。

1.2.5Cr-Strip研制

1.2.5.1膠體金的制備參照Song等[20]所述的檬酸鈉還原法制備膠體金,用紫外掃描及透射電鏡掃描,觀察膠體金分散均勻度及粒徑大小。

1.2.5.2金標(biāo)抗體的制備采用Mey氏系列穩(wěn)定法[21]制備金標(biāo)抗體,用紫外掃描,觀察金標(biāo)抗體吸收峰位置的變化并與膠體金吸收峰位置進(jìn)行比較。

1.2.5.3金標(biāo)抗體玻璃纖維棉的制備用PBS配制含1%的BSA和0.05%吐溫-20的溶液浸泡玻璃纖維棉,晾干,將金標(biāo)抗體用X-only單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上。

1.2.5.4NC膜的制備X-only單向噴點(diǎn)儀將濃度為1 mg/mL的免疫原Cr3+-iEDTA-BSA和濃度為1 mg/mL的RaMIgG點(diǎn)射于NC膜中央,形成間距0.5 cm的檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線),自然干燥,密封。

1.2.5.5試紙的組裝在支持板上首先粘貼上NC膜和吸水紙,此后依次粘貼上金標(biāo)墊和樣品墊,之后用切條機(jī)裁割,37 ℃真空干燥箱干燥12 h,與干燥劑一起密封,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.6Cr3+-EDTA標(biāo)準(zhǔn)品制備與待測(cè)樣品預(yù)處理由于所制備的Cr3+-EDTA mAb是針對(duì)Cr3+-EDTA的,取等體積的Cr3+標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1000 μg/L)與EDTA(1 mol/L)混合,靜置10 min,使Cr3+充分螯合,之后用PBS稀釋成5 μg/L;液體樣品如水樣、尿樣、血液樣、牛奶樣等,首先在液體樣品中加入10 mL濃度為1 mol/L、pH9.5的Na2SO3溶液,將Cr6+全部還原為Cr3+,之后加入10%體積摩爾濃度為0.1 moL/L的EDTA鰲合劑,混合反應(yīng)30 min,使Cr3+與EDTA充分鰲合,5000 r/min離心10 min,取上清液進(jìn)行檢測(cè);固體樣品如土壤樣、大米樣、面粉樣、組織樣等,稱取1.0 g樣品于100 mL錐形瓶?jī)?nèi),加入1 mL雙蒸水浸潤(rùn)后加入混酸溶液6 mL(3 mL濃H3PO4和3 mL濃H2SO4),蓋上表面皿,置于電爐上加熱至冒白煙,冷卻后加入0.5 mL濃HNO3,繼續(xù)加熱至土樣變白色、消解液呈黃綠色,用雙蒸水沖洗,全部轉(zhuǎn)移入50 mL離心管內(nèi),5000 r/min離心10 min,將上清夜移入100 mL容量瓶中,加入10 mL濃度為1 mol/L、pH9.5的Na2SO3溶液,攪拌反應(yīng)1 h,將Cr6+全部還原為Cr3+,之后加入10 mL濃度為0.1 mol/L的EDTA鰲合劑溶液,攪拌反應(yīng)8 h,定容至100 mL,得到樣品檢測(cè)溶液。

1.2.6Cr-Strip性能測(cè)定

1.2.6.1敏感性用PBS配制1000 μg/L的Cr3+溶液與1 mol/L的EDTA等體積混合,得出濃度為500 μg/L的Cr3+-EDTA的溶液,用PBS稀釋,配制終濃度分別為160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0 μg/L的Cr3+-EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液,用Cr-Strip測(cè)定,根據(jù)測(cè)定結(jié)果判斷其敏感性。實(shí)際檢測(cè)時(shí),將樣品加到Cr-Strip樣本墊上,室溫反應(yīng)10 min,觀察顯色結(jié)果。結(jié)果判定方法:T線、C線均顯示紅色,樣品呈陰性;T線不顯示紅色、C線顯示紅色,則呈陽(yáng)性;T線、C線均不顯示紅色,則檢測(cè)失敗。

1.2.6.2重復(fù)性取不同批次的6批Cr-Strip,分別在6 d對(duì)Cr3+-EDTA濃度為1.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的水樣、面粉樣、豬肉樣進(jìn)行檢測(cè),檢驗(yàn)其穩(wěn)定性。

1.2.6.3穩(wěn)定性將Cr-Strip置4 ℃冰箱中密封保存12個(gè)月,每隔1個(gè)月檢查一次活性,用PBS(陰性)和Cr3+-EDTA質(zhì)量濃度5 μg/L樣品檢測(cè),測(cè)定其穩(wěn)定性。

1.2.6.4實(shí)際應(yīng)用與復(fù)核實(shí)驗(yàn)待測(cè)樣品130份分別用Cr-Strip和ICP-AES進(jìn)行檢測(cè),測(cè)定其符合率,ICP-AES檢測(cè)參照張麗萍[18]所述的方法進(jìn)行,檢測(cè)限為5 μg/L。

2　結(jié)果與討論

2.1免疫原鑒定

2.1.1紫外掃描鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。BSA在278 nm出現(xiàn)特征峰,Cr3+-iEDTA在264、332 nm出現(xiàn)特征峰,Cr3+-iEDTA-BSA在272、332 nm出現(xiàn)特征峰,紫外掃描鑒定結(jié)果表明,Cr3+-iEDTA-BSA兼有BSA和Cr3+-iEDTA的特征峰,說(shuō)明Cr3+-iEDTA-BSA中同時(shí)含有BSA和Cr3+,由此可推斷免疫原合成成功。

圖2　BSA、Cr3+-iEDTA和Cr3+-iEDTA-BSA的紫外掃描圖Fig.2　The UV spectra of BSA,Cr3+-iEDTA and Cr3+-iEDTA-BSA

2.1.2BSA與Cr3+含量測(cè)定紫外掃描儀278 nm測(cè)定Cr3+-iEDTA-BSA中BSA的含量為5.81 g/L,ICP-AES測(cè)定Cr3+的含量為140.8 mg/L。測(cè)定結(jié)果表明,Cr3+-iEDTA-BSA中同時(shí)含有BSA和Cr3+,說(shuō)明免疫原合成成功。

2.2Cr3+-EDTA mAb制備

2.2.1細(xì)胞融合小鼠選擇結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。用間接ELISA測(cè)定5只免疫小鼠多抗血清效價(jià),均達(dá)到了1:(1×104),說(shuō)明用Cr3+-iEDTA-BSA免疫Balb/C小鼠,獲得了理想的免疫效果,其中M1免疫效果最好,多抗血清效價(jià)最高達(dá)到了1:(5.12×104)。用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定多抗血清對(duì)Cr3+-EDTA的抑制效價(jià),5只免疫小鼠多抗血清對(duì)Cr3+-EDTA均能抑制,其中M1抑制效果最好,IC50最低為24.8 μg/L,說(shuō)明M1多抗血清對(duì)Cr3+-EDTA的敏感性也最好。由于M1多抗血清效價(jià)最高且敏感性好,故選擇M1進(jìn)行細(xì)胞融合。

圖3　抗Cr3+-EDTA多抗血清效價(jià)測(cè)定曲線Fig.3　Titer curves of Cr3+-EDTApAb determined by indirect ELISA

圖4　Cr3+ pAb對(duì)Cr3+的抑制曲線Fig.4　Inhibitory curves of Cr3+ pAb againstCr3+ dermined by blocking ELISA

2.2.2雜交瘤細(xì)胞株建立融合細(xì)胞經(jīng)3次克隆化后陽(yáng)性率達(dá)100%,間接ELISA分別測(cè)定其IC50,篩選出3株高效價(jià)、敏感、特異的雜交瘤,分別命名為2A3C11、2A3D9、2A11G5。

2.3Cr3+-EDTA mAb特性分析

2.3.1雜交瘤穩(wěn)定性分析結(jié)果見(jiàn)圖5。雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性是由其遺傳物質(zhì)染色體核型所決定的,圖5可知,3株雜交瘤凍存前細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)測(cè)定吸收值與9次凍存、復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)后上清效價(jià)基本一致,說(shuō)明3株雜交瘤分泌抗體穩(wěn)定性好。

圖5　細(xì)胞傳代培養(yǎng)上清中抗體效價(jià)變化Fig.5　The indirect ELISA titer of mAb secretedby hybridomas continually in the supernatants

2.3.2親和性分析結(jié)果見(jiàn)圖6。2A3C11、2A3D9、2A11G5的Ka分別為7.85×108、1.03×109、2.69×109L/mol,其中2A11G5的Ka最大。親和性是由抗體與對(duì)于抗原反應(yīng)結(jié)合強(qiáng)度即親和力大小所決定的,根據(jù)Velankia等[22]Ka為107～1012L/mol為高親和力抗體、Ka為105～107L/mol為低親和力抗體的研究結(jié)論,本實(shí)驗(yàn)所制備的Cr3+-EDTA mAb均為高親和力抗體,其中2A11G5的親和性最好。

圖6　Cr3+-EDTA mAb的Ka測(cè)定曲線Fig.6　The association constant cueve of Cr3+-EDTA mAb

2.3.3靈敏性分析結(jié)果見(jiàn)圖7。抑制曲線的回歸方程為y=-31.766x+81.522,由此可計(jì)算出親和力最高的2A11G5株所產(chǎn)生的Cr3+-EDTA mAb對(duì)Cr3+-EDTA的IC50值為9.84 μg/L,為高靈敏性抗體。

圖7　靈敏性測(cè)定Fig.7　The sensitivity measurement of anti-Cr3+-EDTA mAb

2.3.4特異性分析結(jié)果見(jiàn)表1。Cr3+-EDTA mAb對(duì)Cr3+-EDTA的IC50為9.84 μg/L,對(duì)EDTA及其它金屬離子的IC50均大于103,說(shuō)明Cr3+-EDTA mAb具有較高的特異性。特異性是由抗體分子超變區(qū)空間結(jié)構(gòu)與抗原決定簇之間的互補(bǔ)性決定的,Alzari等[23]研究證實(shí),抗體識(shí)別抗原構(gòu)象型表位的范圍是160～900 ?,Cr3+的晶體構(gòu)象小于3 ?而不被抗體識(shí)別[24],Cr3+-EDTA則屬于半抗原,可與抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),抗體識(shí)別半抗原的部位是抗體輕鏈超變區(qū)的組氨酸殘基[25],本實(shí)驗(yàn)所研制的Cr3+-EDTA mAb可專一識(shí)別Cr3+-EDTA螯合物,與其他化合物無(wú)交叉反應(yīng)性。

表2　Cr3+-EDTA mAb與膠體金最佳標(biāo)記濃度的選擇

表1　Cr3+-EDTA mAb與EDTA及其他金屬離子的交叉反應(yīng)

2.4膠體金與金標(biāo)抗體質(zhì)量鑒定

2.4.1膠體金紫外掃描鑒定結(jié)果見(jiàn)圖8。膠體金的吸收峰(λmax)位于523.8 nm,最大吸光值(Amax)為0.941,只有一個(gè)吸收峰,峰寬較小,根據(jù)Zhou等[26]的研究結(jié)果說(shuō)明,膠體金顆粒大小及分布均勻,粒徑為25 nm。

圖8　膠體金紫外掃描圖Fig.8　Determination of colloidal gold by spectrophotometry

2.4.2膠體金透射電鏡掃描鑒定結(jié)果見(jiàn)圖9。所制備的膠體金在透射電鏡下分布均勻,形狀規(guī)則,隨機(jī)測(cè)量100個(gè)顆粒,粒徑在(25±1.0) nm,與紫外掃描結(jié)果基本一致。

圖9　膠體金電鏡掃描結(jié)果Fig.9　Determination of colloidal gold by electron microscope

2.4.3金標(biāo)抗體單抗最佳用量的確定結(jié)果見(jiàn)表2。Cr3+-EDTA mAb與膠體金標(biāo)記的適宜濃度為6.25 μg/mL,在此基礎(chǔ)上增加10%,Cr3+-EDTA mAb最佳標(biāo)記濃度為7.0 μg/mL膠體金。

2.4.4金標(biāo)抗體紫外鑒定結(jié)果見(jiàn)圖10。膠體金與金標(biāo)抗體均只有一個(gè)吸收峰,膠體金的吸收峰(λmax)位于523.8 nm,金標(biāo)抗體的吸收峰位于530 nm,吸收峰發(fā)生了偏移,可以判定抗體標(biāo)記成功。

圖10　金標(biāo)抗體紫外掃描圖Fig.10　Determination of Cr3+-EDTA mAb labeledwith colloidal gold by spectrophotometry

2.5Cr-Strip性能測(cè)定

2.5.1敏感性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖11。當(dāng)樣品中Cr3+-EDTA質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 μg/L時(shí),T線相對(duì)陰性對(duì)照顏色明顯變淺,當(dāng)樣品中Cr3+-EDTA質(zhì)量濃度達(dá)到5 μg/L時(shí),T線顏色基本消失,呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性,因此,Cr-Strip的檢測(cè)限為5 μg/L。

表3　Cr-Strip重復(fù)性測(cè)定(n=6)

注:“-”代表陰性;“+”代表陽(yáng)性。

表4　Cr-Strip與ICP-AES實(shí)際檢測(cè)結(jié)果比較

圖11　Cr-Strip敏感度測(cè)定(n=6)Fig.11　Sensitivity of Cr-Strip(n=6)注:1～9表示Cr3+-EDTA質(zhì)量濃度,分別為0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μg/L。

2.5.2重復(fù)性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。不同批次的6批Cr-Strip對(duì)水樣、面粉樣、豬肉樣進(jìn)行重復(fù)性測(cè)定,檢測(cè)結(jié)果完全一致,說(shuō)明Cr-Strip的重復(fù)性好。

2.5.3穩(wěn)定性測(cè)定制備的Cr-Strip在4 ℃、12個(gè)月的保存期內(nèi),其外觀和準(zhǔn)確性等均末發(fā)生變化,C線和T線條帶顯色清晰,與新制備的Cr-Strip檢測(cè)結(jié)果完全一致,說(shuō)明Cr-Strip可在4 ℃條件下密封保存12個(gè)月。

2.5.4符合性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。在130份樣品中共檢出15份陽(yáng)性樣品,Cr-Strip與ICP-AES的檢測(cè)結(jié)果一致,均為15份樣品,符合率為100%;15份陽(yáng)性樣品用Cr-Strip半定量測(cè)定,用ICP-AES定量測(cè)定,Cr-Strip的陽(yáng)性值≥5 μg/L,ICP-AES測(cè)定的陽(yáng)性范圍值為5.9～98.7 μg/L,說(shuō)明Cr-Strip的敏感性與ICP-AES相當(dāng);豬肉樣品陽(yáng)性率高達(dá)25%,占陽(yáng)性樣品總數(shù)的50%,這可能與飼料中添加鉻制劑有關(guān)。

3　結(jié)論

本研究采用分子交聯(lián)技術(shù)成功合成免疫原Cr3+-iEDTA-BSA,應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)制備出穩(wěn)定性好、親和力高、特異性強(qiáng)的Cr3+-EDTA mAb,其Ka為2.69×109L/mol,對(duì)Cr3+-EDTA的IC50為9.84 μg/L,與其他化合物無(wú)交叉反應(yīng)性。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金,顆粒大小均一,分布均勻,粒徑為25 nm,膠體金標(biāo)記抗體最佳標(biāo)記濃度為7.0 μg/mL。采用GICA技術(shù)模式,成功研制出Cr-Strip,檢測(cè)時(shí)間為10 min,檢測(cè)限為5 μg/L,可滿足國(guó)際規(guī)定的50 μg/L的安全限值。通過(guò)實(shí)際樣品檢測(cè)和初步應(yīng)用,并用ICP-AES對(duì)Cr-Strip進(jìn)行驗(yàn)證,Cr-Strip的敏感性與ICP-AES相當(dāng),兩種方法得到的檢測(cè)結(jié)果一致,符合率為100%。本實(shí)驗(yàn)所研制的Cr-Strip特異性、穩(wěn)定性和敏感性較好,操作快速簡(jiǎn)便,適用于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的快速篩檢,為食品質(zhì)量監(jiān)管提供了重要的工具。

[1]王曉波,李建國(guó),劉冬英,等. 廣州市市售大米中鉻污染水平及健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2015,27(1):75-78.

[2]李莎莎,孫玉煥. 工業(yè)廢棄地鉻污染土壤修復(fù)技術(shù)研究進(jìn)展探析[J]. 環(huán)境科學(xué)與管理,2015,40(2):65-69.

[3]Velma V,Tchounwou P B. Hexavalent Chromium-Induced Multiple Biomarker Responses in Liver and Kidney of Goldfish,Carassius auratus[J]. Environmental Toxicology,2011,26(6):649-656.

[4]Nickens K P,Patierno S R,Ceryak S. Chromium genotoxicity:A double-edged sword[J]. Chemico-Biological Interactions,2010,188(2):276-288.

[5]Schneider B C,Constant S L,Patierno S R,et al. Exposure to Particulate Hexavalent Chromium Exacerbates Allergic Asthma Pathology[J]. Toxicology and Applied Pharmacology,2012,259(1):38-44.

[6]Zhitkovich A. Chromium in Drinking Water:Sources,Metabolism,and Cancer Risks[J]. Chemical Research in Toxicology,2011,24(10):1617-1629.

[7]Jaishankar M,Tseten T,Anbalagan N,et al. Toxicity,mechanism and health effects of some heavy metals[J]. Interdisciplinary Toxicology,2014,7(2):60-72.

[8]侯廣順,李英杰,劉瑞恒,等. 微波消解-石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定火山灰中的痕量鉛鉻銅[J]. 巖礦測(cè)試,2015,34(5):539-543.

[9]Wang T,He Y,He J,et al. Determination of Chromium and Zinc in Soil by Microwave Digestion and Flame Atomic Absorption Spectrometry[J]. Agricultural Science & Technology,2015,16(9):1962-1964.

[10]趙子劍,張偉建. 電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測(cè)定化妝品中鈹、鉻、砷、鎘、碲、釹、鉈、鉛[J]. 中國(guó)無(wú)機(jī)分析化學(xué),2015,5(2):9-11.

[11]仝曉紅,劉攀,聶富強(qiáng). 堿熔-電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測(cè)定高碳鉻鐵中鉻[J]. 冶金分析,2015,35(9):36-41.

[12]Sasaki K,Oguma S,Namiki Y,et al. Monoclonal Antibody to Trivalent Chromium Chelate Complex and Its Application to Measurement of the Total Chromium Concentration[J]. Analytical Chemistry,2009,81(10):4005-4009.

[13]顏露,唐勇,向軍儉,等. 抗重金屬Cr3+單克隆抗體的制備及其應(yīng)用[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2011,27(4):422-424.

[14]Liu X,Xiang J,Tang Y,et al. Colloidal gold nanoparticle probe-based immunochromatographic assay for the rapid detection of chromium ions in water and serum samples[J]. Analytica Chimica Acta,2012,745(1):99-105.

[15]Kuang H,Xing C,Hao C,et al. Rapid and Highly Sensitive Detection of Lead Ions in Drinking Water Based on a Strip Immunosensor[J]. Sensors,2013,13(4):4214-4224.

[16]張麗萍,王利,翟旭杰. 微波消解-電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測(cè)定藥用膠囊和明膠中鉻[J]. 理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè),2014,50(9):1166-1167.

[17]Wang Y,Yang H,Pschenitza M,et al. Highly sensitive and specific determination of mercury(II)ion in water,food and cosmetic samples with an ELISA based on a novel monoclonal antibody[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2012,403(9):2519-2528.

[18]Dilillo D J,Tan G S,Palese P,et al. Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virusinvivo[J]. Journal of Natural Medicines,2014,20(2):143-151.

[19]Kim N G,Kim M A,Park Y I,et al. Magnetic nanoparticle based purification and enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibody against enrofloxacin[J]. Journal of Veterinary Science,2015,16(4):431-437.

[20]Song D,Ha G,Serhan W,et al. Development and Validation of a Rapid Immunochromatographic Assay for Detection of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus Antigen in Dromedary Camels[J]. Journal of Clinical Microbiology,2015,53(4):1178-1182.

[21]Venkataramana M,Navya K,Chandranayaka S,et al. Development and validation of an immunochromatographic assay for rapid detection of fumonisin B1from cereal samples[J]. Journal of Food Science and Technology,2014,51(9):1920-1928.

[22]Velankia S,Kelly S,Thundat T,et al. Detection of Cd(II)using antibody-modified microcantilever sensors[J]. Ultramicroscopy,2007,107(12):1123-1128.

[23]Alzari P M,Lascombe M B,Poljak R J. Three-dimensional structure of antibodies[J]. Annual Review of Immunology,1988,(6):555-580.

[24]Lu L,Liu A,Chen F,et al. X-ray absorption fine structure of artificial antigens for cadmium[J]. Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2011,82(1):345-350.

[25]Love R A,Villafranca J E,Aust R M,et al. How the anti-(metal chelate)antibody CHA255 is specific for the metal ion of its antigen:X-ray structures for two Fab’/hapten complexes with different metals in the chelate[J]. Biochemistry,1993,32(41):10950-10959.

[26]Zhou C,Zhang X,Huang X,et al. Rapid Detection of Chloramphenicol Residues in Aquatic Products Using Colloidal Gold Immunochromatographic Assay[J]. Sensors,2014,14(11):21872-21888.

Preparation of monoclonal antibody against trivalent chromic ion and development of colloidal gold immunochromatographic assay for detecting total chromium content in food

WANG Ya-nan1,WANG Xiao-fei2,DING Han1,ZHANG Hai-tang1,FAN Guo-ying1,WANG Zi-liang1,*

(1.School of Animal Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China;2.School of Xinke,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

Object:To prepare monoclonal antibody against Cr3+chelate EDTA complex(Cr3+-EDTA mAb)and develop colloidal gold immunochromatographic assay for detecting total chromium content in food(Cr-Strip). Method:The isothiocyanate method was employed to synthesize Cr3+-iEDTA-BSA,which was identified by UV and ICP-AES. The hybridoma lines that secrete Cr3+-EDTA mAb were established by cell fusion and Cr3+-EDTA mAb were induced frominvivomethod and their immunological properties were analyzed. Based on Cr3+-EDTA mAb,Cr-Strip was developed and its traits were verified. Results:Three hybridoma lines were screened out and the best one was 2A11G5. The Kaof Cr3+-EDTA mAb was 2.69×109L/mol and its IC50against Cr3+-EDTA was 9.84 μg/L and it had little or no cross-reactivity with other metal ion. The Cr-Strip could be accomplished qualitative detection of Cr3+-EDTA in 10 minutes,and its detection limit was 5 μg/L,its coincidence rate was 100% compared with ICP-AES. Conclusion:The high quality Cr3+-EDTA mAb had been generated and the Cr-Strip which was more sensitive had been developed successfully.

Cr3+;immunogen;monoclonal antibody;colloidal gold immunochromatographic assay;total chromium

2016-04-11

王亞楠(1989-),女,碩士研究生,研究方向：食品安全免疫檢測(cè),E-mail:792176339@qq.com。

王自良(1966-),男,博士,教授,研究方向：免疫學(xué)與抗體工程,E-mail:wangziliang66@126.com。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAK10B01);“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAD13B05)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)18-0063-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.004