胡華 宋向鳳 孫敏 付丹丹 李敏 田中偉

453100河南，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科（胡華、孫敏、付丹丹、李敏、田中偉）；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（宋向鳳）

熊果酸對干擾素γ刺激HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素33的影響

胡華 宋向鳳 孫敏 付丹丹 李敏 田中偉

453100河南，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科（胡華、孫敏、付丹丹、李敏、田中偉）；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（宋向鳳）

目的探討熊果酸對干擾素γ（IFN?γ）刺激HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素33（IL?33）的影響及其機制。方法不同濃度熊果酸（0、0.1、1、5、10、20、40、80 μmol/L）分別刺激HaCaT細(xì)胞24、48、72 h，MTT法檢測其對細(xì)胞增殖的影響。將HaCaT細(xì)胞與200 μg/L IFN?γ共培養(yǎng)建成炎性細(xì)胞模型，再與10和15 μmol/L熊果酸共培養(yǎng)，以IFN?γ誘導(dǎo)的HaCaT炎性細(xì)胞模型為對照，探討熊果酸的抗炎作用，RT?PCR法檢測IL?6和IL?33 mRNA的表達(dá)，Western印跡法檢測IL?33、p?ERK1/2和ERK1/2蛋白的表達(dá)。結(jié)果MTT法檢測顯示，5～20 μmol/L熊果酸作用24 h對細(xì)胞活力影響不大，而40～80 μmol/L熊果酸在各個時間點均可明顯抑制HaCaT細(xì)胞增殖（P＜ 0.05），故后續(xù)實驗采用10和15 μmol/L濃度。HaCaT細(xì)胞經(jīng)IFN?γ刺激后，IL?33 mRNA（0.812± 0.036）、IL?6 mRNA（0.947±0.091）表達(dá)量和IL?33蛋白表達(dá)（1.317±0.119）均顯著高于空白對照組（分別為0.412±0.021、0.595±0.030和0.147±0.036，均P＜0.05）；而IFN?γ+10 μmol/L熊果酸組（分別為0.447±0.042、0.437±0.099和0.923±0.058）和IFN?γ+15 μmol/L熊果酸組（分別為0.438±0.028、0.350±0.075和0.564±0.113）又較IFN?γ組（分別為0.812±0.036、0.947±0.091和1.317±0.119）顯著降低（均P＜0.05），且這兩個熊果酸組IL?33 mRNA水平與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而IFN?γ+15 μmol/L熊果酸組IL?33蛋白水平顯著低于IFN?γ +10 μmol/L熊果酸組（P＜ 0.05）。HaCaT細(xì)胞分別經(jīng)IFN?γ刺激5、60 min后，p?ERK1/2蛋白表達(dá)均明顯高于空白對照組。IFN?γ+15 μmol/L熊果酸5 min組和60 min組p?ERK1/2蛋白的相對表達(dá)量（0.458±0.053、0.302±0.054）分別低于IFN?γ 5 min組（0.941±0.042）和60 min組（0.509±0.032），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而總ERK1/2蛋白表達(dá)量不變。結(jié)論熊果酸能夠降低IFN?γ刺激的HaCaT細(xì)胞IL?33的表達(dá)量，其機制可能與調(diào)節(jié)ERK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

熊果酸；干擾素γ；白細(xì)胞介素1；白細(xì)胞介素6；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)MAP激酶類；HaCaT細(xì)胞；白細(xì)胞介素33

抗白細(xì)胞介素（IL）?23、腫瘤壞死因子（TNF）和IL?17等細(xì)胞因子在銀屑病治療中的成功應(yīng)用，使免疫靶向治療成為治療銀屑病的新策略［1?3］。IL?33，一個新近發(fā)現(xiàn)的IL?1家族成員，在銀屑病中表達(dá)明顯增多，為闡明銀屑病的發(fā)病機制提供了新前景［4?5］。熊果酸，一個五環(huán)三萜類化合物，是許多植物如蘋果、小紅莓、薄荷、迷迭香、牛至和梅干中的成分［6］，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性［7?10］。文獻(xiàn)［8］報道，在淋巴細(xì)胞中熊果酸通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、NF?κB等信號通路的活化，減少IL?6、干擾素γ（IFN?γ）等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)來發(fā)揮抗炎活性。盡管熊果酸在多種免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮抗炎作用，然而，它在炎癥性皮膚疾病中發(fā)揮著怎樣的作用及其作用機制尚未闡明。本實驗選取人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞為對象，探討熊果酸對IFN?γ刺激HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生IL?33、IL?6的影響及其可能的抗炎機制。

材料與方法

一、材料

人正常表皮永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心；用二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）溶解熊果酸（美國Sigma公司，純度＞90%）至20 mmol/L，分裝后于-20℃保存?zhèn)溆?，使用前用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋為工作液濃度，DMSO終濃度 ＜0.01%；MEM/EBSS液體培養(yǎng)基（美國HyClone公司）；胎牛血清（以色列Biological Industries公司）；重組人IFN?γ（北京義翹神州生物技術(shù)有限公司）；噻唑藍(lán)（MTT，美國Sigma公司）；Trizol核酸提取液（美國Invitrogen公司）；抗IL?33鼠抗（美國Abcam公司）；抗ERK1/2、p?ERK1/2兔抗（美國CST公司），二抗（HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM/EBSS培養(yǎng)基常規(guī)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

2.MTT法檢測不同濃度熊果酸作用不同時間對HaCaT細(xì)胞增殖的影響：將HaCaT細(xì)胞以5×104個/ml接種于96孔板，每孔200 μl，每組設(shè)3個復(fù)孔。每孔加入熊果酸工作液，使其終濃度分別為0.1、1、5、10、20、40和80 μmol/L，空白對照組加等量DMSO。分別于培養(yǎng)24、48、72 h加MTT，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄掉培養(yǎng)液，加入200 μl DMSO充分振蕩，于490 nm波長處用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度A值，實驗重復(fù)3次。

3.RT?PCR法檢測IL?33和IL?6 mRNA表達(dá)：將HaCaT細(xì)胞以1.5×105個/ml接種于6孔板，每孔3 ml，用不同濃度IFN?γ（12.5、25、50、100、200 μg/L）刺激HaCaT細(xì)胞12 h，以正常培養(yǎng)的細(xì)胞為對照組。選取一個對IL?33 mRNA促進(jìn)作用最明顯的IFN?γ濃度作為后續(xù)誘導(dǎo)HaCaT炎性細(xì)胞模型的濃度。然后，實驗分為：空白對照組（HaCaT細(xì)胞不作任何處理）、熊果酸對照組（10 μmol/L熊果酸組和15 μmol/L熊果酸組）、模型組（IFN?γ誘導(dǎo)的HaCaT炎性細(xì)胞模型，即IFN?γ組）和干預(yù)組（IFN?γ+10 μmol/L熊果酸組和IFN?γ +15 μmol/L熊果酸組）。所有實驗組均作用12 h，其中，干預(yù)組先用IFN?γ預(yù)處理1 h，然后再加入熊果酸作用12 h。Trizol法提取總RNA后參照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行PCR。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，IL?33引物序列上游5′?GTGACGGTGCTGAT GGTAAGATG?3′，下游5′?CCTGGTCTGGCAGTGGTT TT?3′（130 bp）；IL?6 引物序列上游 5′?CACACAGAC AGCCACTCACC?3′，下游 5′?TTTTCTGCCAGTGCCT CTTT?3′（139 bp）；內(nèi)參GAPDH 引物序列上游5′?TCAACAGCGACACCCACTCC?3′，下游5′?TGAGGTC CACCACCCTGTTG?3′（126 bp）。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s、退火30 s、72℃延伸30 s，循環(huán)32次；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后成像，分別以目的基因擴增產(chǎn)物電泳條帶總灰度與GAPDH電泳條帶總灰度之比表示各自mRNA的相對強度，實驗重復(fù)3次。RT?PCR圖片采用Image J圖像處理軟件進(jìn)行處理。由于IL?33豐度低，不易檢測，而IL?6是經(jīng)典的炎性因子，豐度高容易檢測，故用IL?6做陽性對照，以排除藥物無效因素。

4.蛋白印跡法檢測IL?33、ERK1/2及p?ERK1/2蛋白的表達(dá)：將HaCaT細(xì)胞以1.5×105個/ml接種于6孔板，每孔3 ml，實驗分組同上，檢測IL?33蛋白表達(dá)。ERK1/2及p?ERK1/2蛋白表達(dá)的檢測實驗分組如下：空白對照組（HaCaT細(xì)胞不加任何處理）、15 μmol/L熊果酸組、IFN?γ 5 min組、IFN?γ 60 min組、IFN?γ +15 μmol/L熊果酸5 min組和IFN?γ +15 μmol/L熊果酸60 min組。聯(lián)合組先用IFN?γ預(yù)處理，然后再加入熊果酸。提取各組細(xì)胞蛋白，制膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，加入一抗IL?33（1∶1 000）、p?ERKl/2（1∶2 000）、ERKl/2（1∶1 000）和 β 肌動蛋白（1∶1 000），4℃孵育過夜，洗膜后分別加入二抗（1∶3 000）室溫?fù)u床孵育1 h，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光液顯色，X線曝光，顯影，激光掃描儀掃描，分別以目的蛋白總吸光度與β肌動蛋白總吸光度之比表示各蛋白的相對強度，實驗重復(fù)3次。Western印跡條帶采用Image J圖像處理軟件進(jìn)行處理。

5.統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用重復(fù)測量的方差分析、單因素方差分析及LSD?t檢驗、析因設(shè)計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、熊果酸對HaCaT細(xì)胞增殖的影響

重復(fù)測量資料的方差分析顯示，不同濃度熊果酸（0.1、1、5、10、20、40、80 μmol/L）對HaCaT細(xì)胞增殖的影響不同（F=153.5，P＜0.001），24～72 h不同時間點間細(xì)胞存活率也有差異（F=191.2，P＜0.001），且熊果酸濃度與作用時間有交互作用（F=18.01，P＜ 0.01），表明不同濃度熊果酸對HaCaT細(xì)胞增殖活性的作用隨時間的變化趨勢不完全一致。進(jìn)一步分析顯示，40～80 μmol/L熊果酸在各個時間點均可明顯抑制HaCaT細(xì)胞增殖（P＜0.05），而5 ～ 20 μmol/L熊果酸作用24 h對細(xì)胞活力影響不大，滿足實驗需要。所以后續(xù)實驗只使用10和15 μmol/L濃度。見圖1。

二、熊果酸對IFN?γ刺激的HaCaT細(xì)胞IL?33和IL?6 mRNA的影響

不同濃度IFN?γ（12.5、25、50、100、200 μg/L）刺激HaCaT細(xì)胞，IL?33 mRNA相對表達(dá)量分別為0.743± 0.114、0.881± 0.073、0.886± 0.064、0.891±0.105、1.058±0.034，對照組為0.742±0.023。經(jīng)單因素方差分析，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.016，P＜ 0.05），再行LSD?t檢驗發(fā)現(xiàn)，200 μg/L IFN?γ組IL?33 mRNA相對表達(dá)量顯著高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜ 0.05），說明200 μg/L IFN?γ對IL?33 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用最為明顯，因此后續(xù)IFN?γ誘導(dǎo)HaCaT炎性細(xì)胞模型均用此濃度。

圖1 不同濃度熊果酸作用不同時間對HaCaT細(xì)胞活力的影響1：空白對照組；2 ～ 8：分別為0.1、1、5、10、20、40、80 μmol/L熊果酸組。5～20 μmol/L熊果酸作用24 h對細(xì)胞活力影響不大。a：與同一時間空白對照組比較，P＜0.05

熊果酸和IFN?γ作用于HaCaT細(xì)胞，析因設(shè)計的方差分析顯示，熊果酸與IFN?γ存在交互作用（P＜0.01）。單獨效應(yīng)分析顯示，HaCaT細(xì)胞經(jīng)200 μg/L IFN?γ刺激后，IL?33和IL?6 mRNA表達(dá)量均顯著高于空白對照組（P＜0.05），而IFN?γ +10 μmol/L熊果酸組和IFN?γ +15 μmol/L熊果酸組IL?33、IL?6 mRNA表達(dá)量又較IFN?γ組顯著降低（P＜0.05），且這兩個熊果酸組IL?33 mRNA水平恢復(fù)到空白對照組水平，與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

三、熊果酸對IFN?γ刺激的

HaCaT細(xì)胞中IL?33和p?ERK1/2、總ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

蛋白印跡結(jié)果顯示，熊果酸與IFN?γ對HaCaT細(xì)胞IL?33蛋白的表達(dá)有交互作用（P＜0.01）。單獨效應(yīng)分析顯示，HaCaT細(xì)胞經(jīng)IFN?γ刺激后，IL?33蛋白表達(dá)顯著高于空白對照組（P＜0.05），而IFN?γ+10 μmol/L熊果酸組和IFN?γ +15 μmol/L熊果酸組均較IFN?γ組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），且IFN?γ +15 μmol/L熊果酸組低于IFN?γ +10 μmol/L熊果酸組（P＜0.05）。見表1，圖2。

熊果酸對IFN?γ刺激的HaCaT細(xì)胞p?ERK1/2蛋白表達(dá)的影響，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=72.075，P＜0.05）。HaCaT細(xì)胞分別經(jīng)IFN?γ刺激5 min、60 min后，p?ERK1/2蛋白表達(dá)均明顯高于空白對照組。IFN?γ +15 μmol/L熊果酸5 min組和IFN?γ +15 μmol/L熊果酸60 min組p?ERK1/2蛋白的相對表達(dá)量（分別為0.458±0.053、0.302±0.054）分別低于IFN?γ 5 min組和IFN?γ 60 min組（0.941±0.042、0.509±0.032），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而總ERK1/2蛋白表達(dá)量不變，見圖3、4。

討 論

淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)和細(xì)胞因子表達(dá)異常是銀屑病主要發(fā)病機制之一，因此用藥物調(diào)節(jié)機體的免疫紊亂、恢復(fù)正常免疫狀態(tài)一直是銀屑病治療的一個方向［11?12］。IL?33被認(rèn)為是一種雙效型細(xì)胞因子，類似于高遷移率族蛋白1（HMGB1），既可作為核蛋白而發(fā)揮生理調(diào)節(jié)作用，也可在細(xì)胞受到損傷時被釋放至胞外，作為一個內(nèi)源性的危險信號而發(fā)揮致炎作用。IL?33高表達(dá)于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞［13］，其受體ST2L主要表達(dá)于Th2細(xì)胞、肥大細(xì)胞等，故一般認(rèn)為IL?33可誘導(dǎo)Th2細(xì)胞應(yīng)答［5，14］。研究顯示，IL?33與多種炎癥性皮膚?。òㄣy屑病）密切相關(guān)［12］。Hueber等［5］通過活組織檢測發(fā)現(xiàn)，與銀屑病患者非病灶區(qū)皮膚組織相比，病灶區(qū)和病灶周圍皮膚組織標(biāo)本IL?33和ST2的表達(dá)均顯著增加。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者病灶區(qū)皮膚組織IL?33及其受體ST2的表達(dá)均較健康對照組顯著增多。提示IL?33/ST2在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

表1 熊果酸和干擾素γ（IFN?γ）對HaCaT細(xì)胞白細(xì)胞介素（IL）?6 mRNA、IL?33 mRNA和IL?33蛋白表達(dá)的影響（x± s）

圖2 不同濃度熊果酸對IFN?γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞IL?33蛋白表達(dá)的影響 1：空白對照組；2：10 μmol/L熊果酸組；3：15 μmol/L熊果酸組；4：IFN?γ組；5：IFN?γ +10 μmol/L熊果酸組；6：IFN?γ +15 μmol/L熊果酸組。HaCaT細(xì)胞在IFN?γ作用下，IL?33蛋白表達(dá)量增高；加入10和15 μmol/L熊果酸后，IL?33蛋白表達(dá)量均降低

圖3 15 μmol/L熊果酸對IFN?γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞p?ERK1/2和總ERE1/2的影響 1：空白對照組；2：熊果酸組；3：IFN?γ 5 min組；4：IFN?γ 60 min組；5：IFN?γ + 熊果酸5 min組；6：IFN?γ + 熊果酸60 min組；IFN?γ作用于HaCaT細(xì)胞5 min、60 min，均可使ERK的磷酸化水平升高；加入熊果酸又可降低ERK的磷酸化水平

圖4 15 μmol/L熊果酸對IFN?γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞p?ERK1/2和總ERK1/2的影響 a：與空白對照組比較，P＜ 0.05；b：與IFN?γ 5 min組比較，P＜ 0.05；c：與IFN?γ 60 min組比較，P＜ 0.05

熊果酸的抗炎作用及其相關(guān)機制研究報道甚少。本研究預(yù)實驗探究熊果酸對HaCaT作用的最適濃度，結(jié)果顯示，5～20 μmol/L熊果酸對細(xì)胞活力影響不大，因此選用10和15 μmol/L兩個濃度進(jìn)行后續(xù)研究。由于INF?γ可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞中IL?33和IL?6表達(dá)增高［15］，本研究采用INF?γ刺激HaCaT細(xì)胞以制備細(xì)胞炎癥模型，在此基礎(chǔ)上加入熊果酸后，IL?33和IL?6表達(dá)量降低，說明熊果酸有抑制炎癥的作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，熊果酸單獨作用于HaCaT細(xì)胞能夠促進(jìn)IL?33的表達(dá)，這可能與熊果酸具有的雙向免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)［16］，也可能是其作為一種外來刺激物對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生影響的結(jié)果。有研究報道了熊果酸這種雙向免疫調(diào)節(jié)作用。You等［17］發(fā)現(xiàn)，在未活化的的巨噬細(xì)胞中，熊果酸可以通過反式激活NF?κB誘導(dǎo)NO和TNF?α mRNA表達(dá)增強，而在活化的巨噬細(xì)胞中，熊果酸則表現(xiàn)出抗炎作用。

為進(jìn)一步探討熊果酸抑制炎癥性細(xì)胞因子表達(dá)的信號途徑，我們選取了ERK信號途徑，因為有報道熊果酸的抗炎作用主要是通過抑制AP?1、NF?κB 和 NF?AT 三大信號通路來實現(xiàn)的［8，18?19］。ERK、p38和JNK是活化AP?1的主要上游信號，而IFN?γ通過ERK、p38、EGFR等信號途徑調(diào)節(jié)IL?33的表達(dá)［15，20］。因此，ERK信號途徑可能是熊果酸降低炎癥因子IL?33表達(dá)并發(fā)揮抗炎活性的主要通路之一。我們的研究結(jié)果也表明，熊果酸可抑制ERK的磷酸化水平，提示熊果酸可通過抑制ERK的活化來發(fā)揮抗炎活性。

綜上，本實驗首次研究了熊果酸對IFN?γ刺激的HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響，并且探討了熊果酸抑制IL?33表達(dá)的機制——抑制ERK信號通路活化。但熊果酸在p38、EGFR和JAK?STAT1信號通路中對IL?33表達(dá)是否有影響還未知，這將成為下一步研究重點。期望通過一系列研究探明熊果酸在炎癥性皮膚病中的作用機制，為熊果酸在臨床中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

志謝 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究中心幫助完成實驗

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Effects of ursolic acid on interleukin?33 expression in HaCaT cells induced by interferon?γ

Hu Hua,Song Xiangfeng,Sun Min,Fu Dandan,Li Min,Tian Zhongwei
Deparment of Dermatology,First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Xinxiang 453100,Henan,China（Hu H,Sun M,Fu DD,Li M,Tian ZW）;School of Basic Medical Sciences,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453100,Henan,China（Song XF）

ObjectiveTo evaluate effects of ursolic acid（UA）on interleukin?33（IL?33）expression in HaCaT cells induced by interferon?γ（IFN?γ）,and to explore their mechanism.MethodsSome HaCaT cells were treated with UA at different concentrations（0,0.1,1,5,10,20,40 and 80 μmol/L）for 24,48 and 72 hours separately.Then,methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was conducted to evaluate cell proliferative activity.A cell model of inflammation was established by culture of HaCaT cells with the presence of 200 μg/L IFN?γ.Some HaCaT cells were classified into several groups to be treated with IFN?γ（200 μg/L）and UA（10 and 15 μmol/L）alone or in combination（firstly treated with IFN?γ followed by UA treatment）,and those receiving no treatment served as the blank control group.Reverse transcription PCR（RT?PCR）was performed to detect mRNA expressions of IL?6 and IL?33,and Western?blot analysis to measure IL?33 protein expression after 12?hour culture.The expressions of extracelluar signal?regulated kinase 1/2（ERK1/2）and phosphorylated ERK1/2（p?ERK1/2）were also measured by Western?blot analysis after 5?and 60?minute treatments with IFN?γ and UA alone or in combination.ResultsMTT assay showed that the treatments with 5-20 μmol/L UA for 24 hours had no effects on cell proliferative activity,while 40-80 μmol/L UA could significantly inhibit it at 24,48 and 72 hours（allP＜ 0.05）.Thus,10 and 15 μmol/L were chosen as the concentrations of UA for further study.After the treatment with 200 μg/L IFN?γ,there was a significant increase in the expressions of IL?33 mRNA（0.812 ± 0.036vs.0.412 ± 0.021）,IL?6 mRNA（0.947 ± 0.091vs.0.595 ± 0.030）and IL?33 protein（1.317 ± 0.119vs.0.147 ± 0.036）in HaCaT cells compared with the blank control group（allP＜ 0.05）.Compared with the IFN?γ group,the IFN?γ +10?μmol/L UA group and IFN?γ +15?μmol/L UA group both showed significantly decreased expressions of IL?33 mRNA（0.447 ± 0.042 and 0.438 ± 0.028 respectively,bothP＜ 0.05）,IL?6 mRNA（0.437±0.099 and 0.350±0.075 respectively,bothP＜0.05）and IL?33 protein（0.923±0.058 and 0.564±0.113 respectively,bothP＜ 0.05）.There were no significant differences in IL?33 mRNA expression between the IFN?γ +10?or 15?μmol/L UA group and blank control group（P＞ 0.05）,while IL?33 protein expression was significantly lower in the IFN?γ +15?μmol/L UA group than in the IFN?γ +10?μmol/L UA group（P＜ 0.05）.The p?ERK1/2 protein expression significantly increased in HaCaT cells treated with IFN?γ for 5 and 60 minutes compared with the blank control group,but significantly decreased in the IFN?γ +15?μmol/L UA group compared with the IFN?γ group（0.458 ±0.053vs.0.941±0.042 at 5 minutes,0.302±0.054vs.0.509±0.032 at 60 minutes,bothP＜0.05）.However,no significant differences were observed in the total ERK1/2 protein expression between the IFN?γ +15?μmol/L UA group and IFN?γ group at 5 or 60 minutes.ConclusionUA can suppress IL?33 expression in HaCaT cells induced by IFN?γ,likely by regulating expressions of the ERK signaling pathway?related proteins.

Ursolic acid;Interferon?gamma;Interleukin?1;Interleukin?6;Extracellular signal?regulated MAP kinases;HaCaT cells;Interleukin?33

Tian Zhongwei,Email:zhonwt@xxmu.edu.cn

田中偉，Email：zhonwt@xxmu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.07.013

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目（13A320852）；河南省中青年衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程專項基金（201004159）；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃重點項目（201502016）

Fund programs:Key Program for Science and Technology Research of Henan Educational Committee（13A320852）;Special Funding of the Henan Health Science and Technology Innovation Talent Project（201004159）;Medical Science and Technology Foundation of Henan Province（201502016）

2015?08?10）

（本文編輯：周良佳 顏艷）