鄭林峰，孫文勇，郭振英，程國(guó)平，楊世峰

（浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江杭州310022）

·臨床研究·

膀胱尿路上皮癌CHK1和P53的臨床病理研究

鄭林峰，孫文勇，郭振英，程國(guó)平，楊世峰

（浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江杭州310022）

目的 探討細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1（cell cycle checkpointkinase 1，CHK1）及P53蛋白在膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BUC）中的表達(dá)及意義。 方法 采用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)104例BUC組織和40例癌旁正常膀胱黏膜組織中CHK1及P53蛋白的表達(dá)，并分析其與BUC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 BUC組織中CHK1及P53蛋白表達(dá)明顯高于癌旁正常膀胱黏膜組織（P＜0.05）。CHK1及P53蛋白表達(dá)與BUC的病理組織學(xué)分級(jí)、臨床病理分期及5年生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與性別、年齡、腫瘤長(zhǎng)徑、單發(fā)/多發(fā)以及在初發(fā)/復(fù)發(fā)患者中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。BUC組織中CHK1和P53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 （1）CHK1 和P53蛋白在BUC組織中呈高表達(dá)，兩者在BUC發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用；（2）BUC組織中CHK1和P53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者存在協(xié)同作用；（3）CHK1和P53蛋白陰性表達(dá)組預(yù)后好于陽(yáng)性表達(dá)組，兩者可作為BUC的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。

膀胱尿路上皮癌；細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1；P53；免疫組織化學(xué)

細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶 1（cell cycle checkpointkinase 1，CHK1）是細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在細(xì)胞周期G1、S和G2/M期的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其蛋白的穩(wěn)定表達(dá)有利于維護(hù)DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)，以保證細(xì)胞基因組的完整和穩(wěn)定［1］。研究發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞中CHK1的表達(dá)較低，但在某些惡性腫瘤中卻高表達(dá)［2］。P53作為最重要的抑癌基因之一，其主要功能是參與DNA的修復(fù)和復(fù)制過程，具有調(diào)節(jié)血管生成、促進(jìn)凋亡及調(diào)節(jié)DNA修復(fù)的作用，可抑制正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化［3］，P53突變后可誘導(dǎo)一些異常基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［4］。本文采用免疫組化EnVision法檢測(cè)CHK1和P53蛋白，探討兩種蛋白在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和預(yù)后的關(guān)系，為膀胱癌的治療提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2009年1月～2014年12月膀胱癌根治標(biāo)本104例及其正常膀胱組織標(biāo)本（距癌旁＞2cm）40例，膀胱癌組中男92例，女12例；年齡27～84歲，平均（62.66±1.16）歲，其中＜63歲者47例，≥63歲者57例；腫瘤長(zhǎng)徑＜2cm者16例，≥2cm者88例；初發(fā)膀胱癌76例，復(fù)發(fā)者28例；腫瘤單發(fā)43例，多發(fā)61例。根據(jù)2016版WHO《泌尿和男性生殖系統(tǒng)腫瘤》分類標(biāo)準(zhǔn)，其中非浸潤(rùn)性尿路上皮癌11例，浸潤(rùn)性尿路上皮癌93例；低級(jí)別40例，高級(jí)別64例；臨床分期Tis～T1期52例，T2～T4期52例。正常組男28例，女12例；年齡40～84歲，平均（57.53±1.02）歲。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，行HE及免疫組化染色。

1.2 免疫組化 CHK1單克隆抗體和鼠抗人P53購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。采用免疫組化EnVision兩步法對(duì)CHK1和P53進(jìn)行染色，具體步驟：4μm連續(xù)切片脫蠟至水，EDTA（pH 9.0）水浴法抗原修復(fù)，一抗均按1：200稀釋，室溫孵育1小時(shí)，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的聚合物二抗（EnVision Flex試劑盒，丹麥DAKO公司）孵育30分鐘，DAB顯色10分鐘，水洗后，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封固。以0.01mol/L PBS液（pH 7.4）替代一抗作為陰性對(duì)照，每例均有HE切片作對(duì)照觀察。

1.3 結(jié)果判定 CHK1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，部分同時(shí)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。P53主要表達(dá)于細(xì)胞核。綜合考慮切片中陽(yáng)性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞數(shù)的百分比和陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項(xiàng)指標(biāo)，半定量判斷結(jié)果:（1）根據(jù)切片中陽(yáng)性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分為4級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞＜10%計(jì)為0分，10%～24%計(jì)為1分，25%～49%計(jì)為2分，50%～74%計(jì)為3分，≥75%計(jì)為4分。（2）根據(jù)著色程度分為4級(jí):無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。綜合判定取陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分值與著色強(qiáng)度相乘之積:0～1分計(jì)為（-），≥2分計(jì)為（+）。

1.4 觀察指標(biāo) 隨訪患者的生存結(jié)局，以患者死亡、2015年12月31日或失訪作為隨訪結(jié)果點(diǎn)，隨訪時(shí)間為12～84個(gè)月，失訪12例，失訪率11.5%。記錄膀胱癌臨床病理資料，包括性別、年齡、病理分級(jí)、臨床分期、腫瘤長(zhǎng)徑、單發(fā)/多發(fā)以及初發(fā)/復(fù)發(fā)情況，分析CHK1和P53蛋白表達(dá)與膀胱尿路上皮癌臨床病理特征的關(guān)系以及預(yù)后的影響因素。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，組間比較及臨床病理指標(biāo)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)和Fisher’s確切概率法，采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)對(duì)CHK1和P53在膀胱癌中的相互關(guān)系進(jìn)行分析，Kaplan-Meier法分析生存情況，生存曲線比較采用Log-rank檢驗(yàn)，采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析多種因素對(duì)預(yù)后的影響。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌及正常膀胱組織中CHK1和P53蛋白的表達(dá) 膀胱癌及正常膀胱組織中CHK1陽(yáng)性率分別為68.26%（71/104）、7.5%（3/40），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；P53陽(yáng)性率分別為42.31% （44/104）、2.5%（1/40），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1～4。

表1 兩組CHK1和P53蛋白的表達(dá)（n，%）

圖1 CHK1在正常膀胱黏膜中呈陰性（EnVision兩步法×100）

圖2 P53在正常膀胱黏膜中呈陰性（EnVision兩步法×100）

圖3 CHK1在膀胱浸潤(rùn)性尿路上皮癌中呈強(qiáng)陽(yáng)性（EnVision兩步法×100）

圖4 P53在膀胱浸潤(rùn)性尿路上皮癌中呈強(qiáng)陽(yáng)性（EnVision兩步法×100）

2.2 CHK1和P53蛋白表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系 CHK1與P53蛋白在低級(jí)別BUC中的陽(yáng)性率明顯低于高級(jí)別BUC，在臨床分期T2～T4 期BUC中的陽(yáng)性率明顯高于Tis～T1期 （均P＜ 0.05）；兩者在性別、年齡、腫瘤長(zhǎng)徑、單發(fā)/多發(fā)以及初發(fā)/復(fù)發(fā)中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。膀胱癌組織中CHK1和P53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.207，P＜0.05）。詳見表3。

表2 CHK1和P53蛋白表達(dá)與膀胱尿路上皮癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 CHK1和P53蛋白表達(dá)相關(guān)性

2.3 CHK1和P53蛋白表達(dá)與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系本組104例BUC患者生存時(shí)間7～82個(gè)月，平均（36.54±2.00）個(gè)月，中位生存時(shí)間31.5個(gè)月。Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，患者5年總體生存率為60.57%（63/104），CHK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)的 5年生存率分別為 54.92%和72.72%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=6.910，P= 0.009）。P53蛋白陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)的5年生存率分別為47.72%和70.00%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.411，P=0.006）。詳見圖5～6。

圖5 CHK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組和陰性表達(dá)組的生存曲線

圖6 P53蛋白陽(yáng)性表達(dá)組和陰性表達(dá)組的生存曲線

2.4 膀胱癌預(yù)后單因素與多因素COX模型分析結(jié)果 單因素Cox模型分析：將CHK1蛋白、P53蛋白以及膀胱癌臨床病理特征逐個(gè)引入Cox模型，結(jié)果顯示，與BUC預(yù)后相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素有6個(gè)，分別為保護(hù)因素：腫瘤單發(fā)；危險(xiǎn)因素：年齡、病理級(jí)別、臨床分期、CHK1蛋白、P53蛋白。經(jīng)Cox模型多因素綜合評(píng)價(jià)上述影響因素，確定年齡、單發(fā)/多發(fā)及CHK1蛋白是影響B(tài)UC患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P＜0.05）；而病理級(jí)別、臨床分期、P53蛋白并非影響B(tài)UC患者預(yù)后的獨(dú)立因素 （P＞0.05）。詳見表4～5。

表4 膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后單因素COX模型分析

表5 膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后多因素COX模型分析

3 討論

CHK1是一個(gè)重要的周期檢測(cè)點(diǎn)中調(diào)節(jié)蛋白，在細(xì)胞周期G1、S和G2/M期的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其蛋白的穩(wěn)定表達(dá)有利于維護(hù)DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)，以保證細(xì)胞基因組的完整和穩(wěn)定［1］。從其功能上看，CHK1可視為一個(gè)腫瘤抑制因子，當(dāng)CHK1基因失活后，CHK1表現(xiàn)就會(huì)呈現(xiàn)出單倍體劑量不足，本應(yīng)停止增殖或生理性凋亡的細(xì)胞不停地進(jìn)入細(xì)胞周期，使得DNA損傷在復(fù)制中逐漸積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖［5］。正常細(xì)胞中CHK1的表達(dá)較低，但在某些惡性腫瘤中卻存在著高表達(dá)［2］。

Bo等［6］發(fā)現(xiàn)，CHK1過表達(dá)能加強(qiáng)二烯丙基硫醚（DADS）誘導(dǎo)的G2/M周期停滯，從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞不斷增殖。Fang等［7］發(fā)現(xiàn)，CHK1過表達(dá)能誘導(dǎo)CCNB1mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及腫瘤生長(zhǎng)。本組實(shí)驗(yàn)顯示，104例BUC組織和40例正常膀胱黏膜組織中CHK1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為68.26%（71/104）、7.5%（3/40），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），CHK1的表達(dá)與病理分級(jí)及臨床分期有關(guān)（P＜0.05），并且出現(xiàn)隨病理分級(jí)及臨床分期提升而陽(yáng)性表達(dá)率升高的趨勢(shì)，提示CHK1在BUC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。Grabauskiene等［8］發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中CHK1過表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。同樣，本組生存分析結(jié)果示：CHK1是影響B(tài)UC患者預(yù)后的獨(dú)立因素，CHK1陰性表達(dá)組5年生存率優(yōu)于陽(yáng)性表達(dá)組。通過解除CHK1對(duì)細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的阻滯作用進(jìn)而促使腫瘤細(xì)胞凋亡，已成為腫瘤治療的重要潛在靶點(diǎn)之一［9］。W-T等［10］應(yīng)用人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶永生化的人泌尿道正常上皮細(xì)胞 （HTERT-NHU）與腫瘤細(xì)胞系來(lái)研究DNA損傷應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞系予以ATM （共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變基因）抑制劑及復(fù)制抑制劑共處理后，CHK1表達(dá)降低，癌細(xì)胞進(jìn)入S周期進(jìn)程顯著減緩，凋亡顯著增加。同樣，Li等［11］發(fā)現(xiàn)在膀胱癌治療中，應(yīng)用ATRCHK1通路的強(qiáng)效抑制劑WYC0209或siATR治療后可提高順鉑-DNA加合產(chǎn)物的表達(dá)，并伴有p-糖蛋白的低表達(dá)。同時(shí)，順鉑與WYC0209聯(lián)合治療表現(xiàn)出抗癌的協(xié)同效應(yīng)。因此，抑制CHK1蛋白表達(dá)可以提高BUC的化療效果。

P53基因位于人染色體17p13.1上，P53基因轉(zhuǎn)錄成2.5kb的mRNA，編碼393個(gè)氨基酸的蛋白，分子量為53000，是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，人類約50%的腫瘤與其有關(guān)［12］，其分為野生型和突變型。野生型P53基因抗腫瘤作用主要是使DNA損傷細(xì)胞進(jìn)入G1/G0期阻滯和DNA修復(fù)程序，而不能進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞的惡性增生，P53突變后可誘導(dǎo)一些異常基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［4］。因P53蛋白野生型半衰期極短，而突變型半衰期很長(zhǎng)，所以一般通過免疫組化檢測(cè)到的是突變型P53基因。本組結(jié)果表明，P53在BUC中陽(yáng)性率明顯高于正常膀胱黏膜組織，且與病理分級(jí)、臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)（P＜0.05），因此，推測(cè)P53蛋白異常高表達(dá)參與了BUC的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過程。

最近Yang等［13］發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)侵襲性膀胱癌基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)約14%為CDKN1A（p21）突變，其中有一半為CDKN1A-TP53共突變。應(yīng)用吉西他濱和CHK1抑制劑聯(lián)合治療后發(fā)現(xiàn)CDKN1A-TP53共突變的細(xì)胞系（647V和RT-112）在G2/M周期檢驗(yàn)點(diǎn)中顯著依賴CHK1活性，與其他細(xì)胞系 （TP53或P21單突變）對(duì)比，該兩種細(xì)胞對(duì)治療的敏感性顯著增加。本文研究結(jié)果顯示：膀胱癌組織中CHK1和P53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.207，P＜0.05），提示兩者存在協(xié)同作用。因此，認(rèn)為在膀胱癌中聯(lián)合檢測(cè)CHK1和P53蛋白為臨床治療提供新的思路。

綜上所述，本研究證明了CHK1和P53蛋白高表達(dá)與BUC的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，聯(lián)合檢測(cè)可為膀胱癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)，尤其是抑制或降低CHK1蛋白表達(dá)水平可能在膀胱癌治療中具有良好的應(yīng)用前景，但兩者間的相互作用機(jī)制等尚需進(jìn)一步深入研究。

［1］ Zaehos G，Rainey MD，Gillespie DA.Chkl-dependent S-M checkpoint delay invertebrate cells is linked to maintenance of viable replieation structure.Mol Cell Biol，2005，25（2）:563

［2］Zhang Y，Hunter T.Roles of Chk1 in cell biology and cancer therapy.Int J Cancer，2014，134（5）:1013

［3］Vazquez A，Bond EE，Levine AJ，et al.The genetics of the P53 pathway，apoptosis and cancer therapy.Nat Rev Drug Discov，2008，7（12）:979

［4］汪勤，解正新，張衛(wèi)琴.P16、P53和ki67蛋白在子宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)及意義.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2013，29 （5）:551

［5］Schwartz GK，Shalt MA.Targeting the cell cycle:a new approach to cancer therapy.J Clin Onol，2005，23（36）:9408

［6］Bo S，Hui H，Li W，et al.Chk1，but not Chk2，is responsible forG2/M phase arrestinduced by diallyl disulfide in human gastric cancer BGC823 cells.Food Chem Toxicol，2014，68（6）:61

［7］ Fang Y，Yu H，Liang X，et al.Chk1-induced CCNB1 overexpression promotes cell prolifer-ation and tumor growth inhumancolorectalcancer.CancerBiolTher，2014，15（9）:1268

［8］ Grabauskiene S，Bergeron EJ，Chen G，et al.Checkpoint kinase 1 protein expression indicates sensitization to therapy by checkpointkinase 1 inhibition in non-small cell lung cancer.J Surg Res，2014，187（1）:6

［9］Russell MR，Levin K，Rader J，et al.Combination therapytargeting the Chk1 and Weel kinases shows therapeutic efficacy inneuroblastoma.Cancer Res，2013，73（2）:776

［10］W-T Wang，J WF Catto，M Meuth.Differential response of normal and malignant urothelial cells to CHK1 and ATM inhibitors.Oncogene，2015，34（22）:2887

［11］Li CC，Yang JC，Lu MC，et al.ATR-Chk1 signaling inhibition as a therapeutic strategy to enhance cisplatin chemosensitivity in urothelial bladder cancer.Oncotarget，2015，7（2）:1947

［12］Soussi T，Beroud C.Assessing TP53 status in human tumours to evaluate clinical outcome.Nat Rev Cancer，2001，1（3）:233

［13］Yang L，David J，Kwiatkowski.Combined CDKN1A/TP53 Mutation in Bladder Cancer Is a Therapeutic Target.Molecular Cancer Therapeutics，2015，14（1）:174