莫臘梅，李永生，高秀峰

（1.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川成都610065；2.四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都610064）

流動注射分光光度法測定紅葡萄酒中甲醇

莫臘梅1，李永生1，高秀峰2

（1.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川成都610065；2.四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都610064）

提出了一種快速自動測定葡萄酒中甲醇的流動注射分析方法。本方法的原理是通過蒸餾從樣品中分離甲醇，然后經(jīng)高錳酸鉀氧化成甲醛，過量高錳酸鉀與S2O52-脫色，甲醛與品紅/亞硫酸反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物，在最大吸收波長590 nm處進(jìn)行測定。通過正交實(shí)驗(yàn)及單因素優(yōu)化后，得到了以下最優(yōu)條件：20 g/L KMnO4，0.3 mol/L H2SO4（15%H3PO4），80 g/L K2S2O5，3 g/L品紅-亞硫酸鈉，顯色反應(yīng)溫度40℃，樣品消耗量330 μL，分析速度為24個(gè)樣/h。對甲醇（500 mg/L）進(jìn)行11次重復(fù)測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%。在優(yōu)選條件下，用本方法與氣相色譜法對5種紅葡萄酒進(jìn)行測定，其測定結(jié)果一致。

流動注射；甲醇；顯色反應(yīng)；紅葡萄酒

甲醇是酒類的一項(xiàng)非常重要的安全指標(biāo)，國標(biāo)［1］中規(guī)定葡萄酒中的甲醇含量必須≤400 mg/L。葡萄酒中甲醇主要由原料中果膠物質(zhì)水解、氨基酸脫氨和發(fā)酵原料的霉變產(chǎn)生。甲醇是一種有害物質(zhì)，人體過量攝入可導(dǎo)致頭痛、惡心、視力模糊，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致失明或死亡［2］。因此，準(zhǔn)確、便捷測定酒中甲醇含量，對保證消費(fèi)者的健康具有重大意義。

目前已經(jīng)有測定甲醇的各種方法，主要為色譜法（GC、HPLC）及酶法等。色譜法［3-4］往往需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件。酶法［5-6］雖然選擇性和靈敏度高，但是酶試劑成本昂貴、不易保存。品紅/亞硫酸比色法是目前葡萄酒中甲醇含量測定的常用方法［7］，但該法顯色不穩(wěn)定、重現(xiàn)性差、耗時(shí)長。Zhang等［8-9］根據(jù)在磷酸介質(zhì)中甲醛對結(jié)晶紫與溴酸鉀間的氧化還原反應(yīng)具有催化作用，以及使用二氧化鉛固相反應(yīng)器將甲醇氧化成甲醛，開發(fā)了測定甲醇的催化分光光度法，該法靈敏度高，但甲醛催化受陰離子的干擾大，目前還沒有用于葡萄酒中甲醇含量測定的報(bào)道。因此，開發(fā)一個(gè)簡便、靈敏度高且準(zhǔn)確、快速測定紅葡萄酒中甲醇的方法仍然是一個(gè)需要迫切解決的技術(shù)問題。本研究以國標(biāo)法為依據(jù)，利用FIA技術(shù)建立了一種能快速測定紅葡萄酒中甲醇的自動分析方法。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

葡萄酒樣：國產(chǎn)某品牌不同葡萄品種（解百納、紅寶石）的干紅葡萄酒；農(nóng)家自釀（玫瑰香、赤霞珠）的半干紅葡萄酒；格魯吉亞原裝進(jìn)口（老朋友）的半干紅葡萄酒。

試劑：堿性品紅（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲醇，亞硫酸鈉，濃鹽酸，濃硫酸，濃磷酸，高錳酸鉀（成都市科龍化學(xué)試劑廠）；偏重亞硫酸鉀（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電導(dǎo)率0.065 μS/cm）。

儀器設(shè)備：FIA3110型流動注射儀；UV-1800PC型紫外/可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)）；721-P可見分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；ASB-200空氣恒溫?。ㄈ毡痉止夤I(yè)株式會社）；艾柯KL-UP-IV-10型純水儀（成都康寧實(shí)驗(yàn)室專用純水設(shè)備廠）；XWT-S型有紙記錄儀（上海自動化儀表三廠）；SC-3000B-011ST型氣相色譜儀（附FID檢測器，重慶川儀分析儀器有限公司）；CH-1型高純氫氣發(fā)生器（武漢科林普豐儀器有限公司）。

1.2主要試劑配制

甲醇儲備液（1.0 g/L）：取630 μL甲醇于500 mL容量瓶中定容，然后移入帶蓋的棕色瓶中備用。

KMnO4/H3PO4/H2SO4試劑：稱取5.0 g KMnO4，溶解于15%（v/v）H3PO4并定容至250 mL，然后與配制的0.6 M H2SO4按1+1比例混合。

品紅/亞硫酸鈉試劑：稱取0.250 g堿性品紅，用150 mL、80℃左右的水溶解，冷卻后過濾，向?yàn)V液中加入25 mL Na2SO3（100 g/L），加入2.5 mL HCl，用水定容至250 mL，置冰箱中4℃低溫保存。

1.3樣品處理

準(zhǔn)確量取50 mL葡萄酒樣品于100 mL蒸餾瓶中，加入數(shù)粒玻璃珠，加熱蒸餾，并將裝置連接至真空泵。用50 mL容量瓶收集餾出液至刻度，于20℃水中保溫30 min，以超純水定容至刻度，混勻，備用。

1.4實(shí)驗(yàn)裝置

圖1　測定紅葡萄酒中甲醇的流動注射分析系統(tǒng)

設(shè)計(jì)的FIA系統(tǒng)如圖1所示。測定過程：當(dāng)采樣閥處于采樣位置時(shí)，系統(tǒng)進(jìn)行定量采樣，多余的排除，同時(shí)載流（C）和反應(yīng)試劑（R1、R2、R3）在蠕動泵（P1）作用下進(jìn)入檢測器形成穩(wěn)定基線；當(dāng)采樣閥處于注入位置時(shí)，試樣在載流的推動下與R1匯合后進(jìn)入RC1發(fā)生氧化反應(yīng)；隨后與R2匯合后進(jìn)入RC2發(fā)生反應(yīng)，褪去過量的KMnO4的顏色。褪色反應(yīng)完成后，反應(yīng)物與R3匯合并在RC3發(fā)生顯色反應(yīng)，生成藍(lán)紫色絡(luò)合物。通過測量顯色產(chǎn)物在最大吸收波長處（590 nm）的吸光度定量甲醇。

2　結(jié)果與討論

2.1還原劑種類的影響

品紅/亞硫酸法測定甲醇時(shí)，過量的氧化劑KMnO4在580 nm處有最大吸收峰，這將影響顯色產(chǎn)物（590 nm）的測定，因此需加入還原劑褪去多余高錳酸鉀。由于國標(biāo)法中KMnO4/H3PO4與H2C2O4/H2SO4反應(yīng)產(chǎn)生大量CO2，影響FIA系統(tǒng)的重現(xiàn)性，因此，重新篩選了適宜的還原劑?；谖墨I(xiàn)［7，10-12］，考察了草酸、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鉀以及抗壞血酸4種還原劑對甲醇測定的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：還原劑為偏重亞硫酸鉀時(shí)，產(chǎn)物響應(yīng)值僅略低于還原劑為草酸時(shí)，且反應(yīng)不產(chǎn)生氣體，因此選定偏重亞硫酸鉀作為本體系的還原劑。

2.2正交實(shí)驗(yàn)

在室溫（22℃）下，用1.0 g/L甲醇標(biāo)液作為測試樣品，按4因素5水平的正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素（水平）分別為：KMnO4（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、30 g/L）、RC1（60 cm、100 cm、150 cm、200 cm、250 cm）、RC3（200 cm、300 cm、400 cm、500 cm、600 cm）、品紅濃度（0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L）。由正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果知，當(dāng)KMnO4濃度為20 g/L、品紅濃度為3 g/L、RC1長度為60 cm、RC3長度為600 cm時(shí)，顯色產(chǎn)物響應(yīng)值最大。

2.3試劑濃度的優(yōu)化

本研究選取了采樣環(huán)體積為330 μL，并在正交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對各試劑（KMnO4、K2S2O5、顯色劑中品紅）濃度進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：測定靈敏度隨氧化劑中高錳酸鉀濃度增加至20 g/L而上升，超過20 g/L時(shí)靈敏度略有下降，選擇KMnO4濃度為20 g/L；產(chǎn)物吸光度值隨K2S2O5濃度增加呈先增大后迅速降低，最終選擇K2S2O5濃度為80 g/L；顯色劑（品紅/亞硫酸鈉）中品紅濃度增加，產(chǎn)物吸光度增大，綜合考慮顯色劑的溶解度和穩(wěn)定性，選擇顯色劑中品紅濃度為3 g/L。

2.4FIA系統(tǒng)參數(shù)的優(yōu)化

在FIA系統(tǒng)中，各管線的流量大小直接影響系統(tǒng)的靈敏度、分析速度及試劑的消耗量。而在蠕動泵管及其他管線內(nèi)徑一定的前提下，系統(tǒng)的流量可通過調(diào)節(jié)泵的轉(zhuǎn)速來改變。以0.5 g/L、1.0 g/L甲醇標(biāo)液作為樣品，在10～30 r/min內(nèi)改變P1的轉(zhuǎn)速，考察甲醇顯色對產(chǎn)物峰高的影響。當(dāng)P1轉(zhuǎn)速高于或低于20 r/min時(shí)，產(chǎn)物峰高低、靈敏度低，因此，選擇P1轉(zhuǎn)速為20 r/min。

測定甲醇的靈敏度顯然取決于氧化反應(yīng)及顯色反應(yīng)的時(shí)間。當(dāng)流速一定時(shí)，可通過RC1、RC3長度改變反應(yīng)時(shí)間。RC1過短導(dǎo)致氧化程度不足，過長則可導(dǎo)致氧化過度；RC2是多余氧化劑褪色的反應(yīng)器，過短則過量的KMnO4不能完全被還原，過長則造成系統(tǒng)壓力及體系分散程度增加；RC3越長顯色產(chǎn)物生成量越多，靈敏度越高，低流速和較長的反應(yīng)盤管長度可以延長停留時(shí)間，但反應(yīng)盤管太長會減緩分析速度、增加產(chǎn)物擴(kuò)散度。綜合考慮靈敏度和分析速率，最佳參數(shù)選擇如下：RC1、RC2、RC3長度分別為40 cm、100 cm、800 cm；總流速3.2 mL/min（C、R1、R2、R3：0.8 mL/min）。

2.5反應(yīng)體系影響因素考察

2.5.1系統(tǒng)反應(yīng)溫度的優(yōu)化

溫度影響顯色反應(yīng)與氧化反應(yīng)的速率及程度。因此，在上述優(yōu)化條件下，用甲醇作為測試樣品，分別考察了氧化反應(yīng)及顯色反應(yīng)溫度對產(chǎn)物吸光度的影響。圖2結(jié)果表明，氧化反應(yīng)的溫度越高，靈敏度越低；顯色反應(yīng)的溫度越高，靈敏度越高。因此，本系統(tǒng)將顯色反應(yīng)盤管溫度控制在40℃，氧化反應(yīng)盤管的溫度控制在室溫。

圖2　溫度對甲醇顯色靈敏度的影響

2.5.2系統(tǒng)酸度的考察

葡萄酒中的其他醛類及與高錳酸鉀形成的其他醛類與品紅/亞硫酸作用也顯色，但在一定濃度的硫酸溶液中，除甲醛可形成長時(shí)間不褪色的藍(lán)紫色外，其他醛類的顯色會消褪，甚至不顯色［13］。因此，我們在氧化劑中添加硫酸，一方面可以提高高錳酸鉀的氧化性，一方面可以去除其他醛類的干擾。圖3結(jié)果表明，氧化劑中硫酸濃度增加時(shí)，峰高明顯增加，方法靈敏度增大；但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硫酸濃度超過0.5 mol/L時(shí)系統(tǒng)基線發(fā)生漂移。因此，氧化劑為20 g/L高錳酸鉀和0.3 mol/L硫酸、15%磷酸的混合物。

2.6干擾物質(zhì)對甲醇含量測定的影響

圖3　系統(tǒng)酸度對峰高的影響

為了考察葡萄酒中干擾物質(zhì)對甲醇測定的影響，用1000 mg/L的甲醇標(biāo)液與不同濃度的干擾物質(zhì)按1+1比例混合作為試樣，用本FIA系統(tǒng)進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，控制相對誤差在±5%之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：檸檬酸、乙酸、乙醛、正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯、K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Br-、PO43-、SO42-、Cl-均不干擾測定；當(dāng)丙三醇含量超過12 g/L時(shí)，將導(dǎo)致甲醇測定結(jié)果偏高。從結(jié)果看，本方法的選擇性較好。

2.7實(shí)樣中甲醇含量的測定

在優(yōu)化后的條件下進(jìn)行操作，考察方法的線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限。在0～1000 mg范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9997，線性關(guān)系良好，檢出限為8 mg/L。用本方法測定了5種紅葡萄酒樣品的甲醇含量，并進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1?？梢钥闯?，本方法的回收率介于95%～103%，表明本方法準(zhǔn)確可靠。

表1　5種酒樣的測定及回收率結(jié)果

2.8對比實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步考察方法的可靠性，對5種商品化的紅葡萄酒用本方法與氣相色譜法同時(shí)進(jìn)行測試。色譜條件：石英毛細(xì)管柱KB1701（30 m×0.32 mm×0.50 μm）；載氣為氮?dú)?；載氣、氫氣、空氣流速分別為15 mL/min、30 mL/min、200 mL/min；檢測器、氣化室溫度為220℃；柱箱溫度為50℃；進(jìn)樣體積：1 μL；甲醇含量測定結(jié)果見表1?？梢钥闯觯瑲庀嗌V法得到的結(jié)果與本方法一致。

3　結(jié)論

本方法自動化程度高、分析速度快、成本低、重現(xiàn)性好、操作簡單，可替代甲醇色譜分析法，實(shí)現(xiàn)葡萄酒中甲醇的快速連續(xù)測定，可用于葡萄酒生產(chǎn)過程的中間及最終質(zhì)量控制。改變甲醇標(biāo)液中乙醇的濃度，本方法亦可用于酒精含量不同的其他樣品中甲醇含量的測定。

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Determination of Methanol in Red Wine by Flow Injection Spectrophotometry

MO Lamei1，LI Yongsheng1and GAO Xiufeng2
（1.School of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610065；2.West China School of Preclinical and Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610064，China）

A rapid and automated determination method of methanol in red wine by flow injection spectrophotometry had been developed.The principles of such method were as follows:methanol separated from wine samples by distillation，then methanol oxidized by permanganate into formaldehyde and excessive permanganate decolorized with withS2O52-，then formaldehyde reacted with magenta-sodium sulfite and a violet reaction product produced，and the determination operated at the maximum absorption wavelength of 590 nm.Through orthogonal experiments and single factor tests，the optimum technical conditions were obtained as follows:20 g/L KMnO4，0.3 mol/L H2SO4（15%H3PO4），80 g/L K2S2O5，3 g/L magenta/sodium sulfite，coloring reaction temperature was at 40℃，sampling volume was 330 μL，and the analytic speed was 24 samples/h.The relative standard deviations for 11 repeated determination of methanol（500 mg/L）was 0.6%.Under the optimum conditions，five commercial wine samples were determined by FIAand GC respectively，and their determination results were the same.

flow-injection；methanol；coloring reaction；red wine

TS262.6；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286（2016）10-0108-04

10.13746/j.njkj.2016110

2016-04-01

莫臘梅（1993-），女，四川廣安人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭I(yè)、食品安全技術(shù)。

李永生（1958-），男，教授，留日博士，主要從事化學(xué)分析自動化、生物傳感器等方面的研究，E-mail：lysgxf2005@qq.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-05-26；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160526.1123.009.html。