江勝龍

（玉林市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，廣西玉林537000）

HPLC法測(cè)定發(fā)酵山楂紅酒13種單體酚的含量

江勝龍

（玉林市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，廣西玉林537000）

建立了山楂紅酒中13種單體酚測(cè)定的HPLC分析方法，并對(duì)不同時(shí)期山楂紅酒單體酚的含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，用該方法對(duì)山楂酒中的13種單體酚進(jìn)行分析，各成分具有較好的分離度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.94%～3.62%之間，線性范圍在14.2～500 ng之間，最低檢出限為1.78～14.2 ng，回歸方程的相關(guān)系數(shù)r介于0.9994～0.9999之間，實(shí)現(xiàn)了在33 min內(nèi)同時(shí)對(duì)山楂紅酒中13種單體酚進(jìn)行分析檢測(cè)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，單體酚呈下降趨勢(shì)。

山楂酒；多酚；HPLC

山楂（Crataegus pinnatifida）屬于薔薇科山楂屬植物，世界上共有該屬植物1000余種。山楂酸甜可口，具有消食健胃、行氣散淤、抗氧化、防衰老等功效［1］。多酚［2］、低聚原花青素［3］、黃酮［4］是果酒中主要活性物質(zhì)。適宜的多酚攝入量與人體血管健康密切相關(guān)［5］。山楂酒酒精度低，并含有糖類、氨基酸、多種有機(jī)酸及豐富的維生素和礦物質(zhì)，山楂酒里含有大量的多酚［6］，不僅能夠抑制脂肪在人體中的堆積，而且還有生津止渴、潤(rùn)肺和補(bǔ)肝安神的保健作用。

果酒中酚類物質(zhì)的來(lái)源是水果本身，原花青素是中國(guó)山楂中最主要的活性成分，是由結(jié)構(gòu)單元表兒茶素（EC）以C4→C8鍵或C4→C6鍵縮合而成的聚合體。此外山楂中還含有綠原酸（CA）、紅果酸（EA）以及少量的金絲桃苷（HP）、異櫟素（IQ）等。這些多酚類成分是山楂中最具代表性的活性成分［7］。然而到目前為止關(guān)于山楂酒中的這些主要多酚的組成、含量分析還未有任何報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用山楂鮮果為原料，參照葡萄酒發(fā)酵工藝，采用HPLC法測(cè)定山楂酒中13種單體酚的含量及變化。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

材料：山楂，河北承德產(chǎn)；葡萄酒果酒專用酵母，安琪酵母有限公司；食用級(jí)白砂糖，市售；亞硫酸，天津大工化學(xué)試劑有限公司；Epicatechin，Procyanidins B2（B2），Procyanidins B5（B5），Procyanidins C1（C1），Procyanidins C2（C2），Procyanidins C3（C3），Procyanidins D1（D1），Procyanidins D2（D2），Procyanidins D6（D6），Eucomic acid（EA），Hyperoside（HP），Isoquercitrin（IP），Chlorogenic acid（CA）實(shí)驗(yàn)室自制。

儀器：Agilent 1200型（安捷倫公司，美國(guó)加州帕羅阿托市），由在線脫氣機(jī)，四元輸液泵，Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm id，5μm），光電二極管陣列檢測(cè)器及Agilent Chemstation色譜工作站組成。配用CO-3010柱恒溫控制箱（天津美瑞泰克科技有限公司生產(chǎn)）；TB-215D分析天平，德國(guó)賽多利斯股份有限公司；WYT-4型手持折光儀，日本ATAGO有限公司；酒精計(jì)，河北省河間市黎民居玻璃儀器制品廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1山楂紅酒發(fā)酵的工藝流程

山楂前處理（挑選、去核、去柄）→破碎→添加40 mg/L SO2→攪拌→添加活性干酵母→攪拌→發(fā)酵→發(fā)酵結(jié)束→添加SO2→密封→澄清→山楂紅酒成品

1.2.2山楂紅酒13種單體酚含量測(cè)定

樣品處理：取3 mL山楂酒，加入9 mL無(wú)水甲醇，提取5 min，離心（4000 r/min，5 min），取上清液10 mL，用氮吹揮干，用1 mL 50%甲醇回溶，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，待用。

色譜條件：流動(dòng)相：A：500μL/L甲酸水溶液；B：甲醇∶乙腈=5∶4，含500μL/L的甲酸；梯度洗脫程序（min/ B%）：0/15.2，11/15.2，15/16.5，16/18，19/19.5，24/29，31/ 50，33/80，38/80，40/15.2，50/15.2；DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：0.8 mL/min；溫度：35℃；進(jìn)樣量：10μL；峰面積外標(biāo)法定量。

2　結(jié)果與分析

2.113種單體酚分析方法建立

采用1.2.2色譜條件對(duì)13種單體酚成分的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，圖1為標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。如圖1所示，13種單體酚成分在該色譜條件下給出了單一的色譜峰，各成分得到了較好的分離效果。

圖1　山楂紅酒中原花青素各成分HPLC色譜圖

2.2方法的精密度實(shí)驗(yàn)

將CA、EA、EC、B2、B5、C1、C2、C3、D1、D2、D6、HP、IQ對(duì)照品溶于甲醇中，配制成0.5 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液，取上述對(duì)照品貯備液，用甲醇稀釋13倍，按1.2.2中所述的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣分析（n=5），以評(píng)價(jià)方法的精密度。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。可以看出，13種對(duì)照品的精密度都很好。

2.3方法的回歸方程、線性范圍和最低檢出限

表1　精密度評(píng)價(jià)（n=5）

分別取貯備液，用甲醇稀釋，配制不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2所述色譜條件分析，以進(jìn)樣質(zhì)量為自變量（X，μg），峰面積為因變量（Y，mv·s），分別計(jì)算各成分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。最低檢出限以3倍信噪比（S/N）所對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣質(zhì)量求得，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，響應(yīng)值與進(jìn)樣質(zhì)量之間線性關(guān)系良好，最低檢出限在ng數(shù)量級(jí)，可以滿足常規(guī)樣品的定量分析。

表2　13種酚類成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及最低檢出限

2.4方法的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)以山楂紅酒中主要的原花青素B2、EC、CA為對(duì)照品，采用加標(biāo)回收率法對(duì)方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)估。分別準(zhǔn)確稱取已知質(zhì)量的對(duì)照品，分別按1.2 mg/g、0.5 mg/g、0.25 mg/g水平加入山楂紅酒樣品中，按1.2.2所述進(jìn)行樣品前處理，平行5份；并按1.2.2所述色譜條件分別測(cè)定未加標(biāo)樣品和已加標(biāo)樣品，統(tǒng)計(jì)計(jì)算各成分的加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，3種原花青素的回收率均較高，可以滿足實(shí)驗(yàn)需要。

表3　各成分回收率

2.5樣品分析

按1.2.2進(jìn)行山楂紅酒前處理，采用1.2.2 HPLC方法對(duì)不同時(shí)期山楂紅酒進(jìn)行多酚含量分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

在這些酚類成分中，酚酸和黃酮類成分的含量下降較為平緩，原花青素類成分的含量下降較為顯著，包括含量最高的B2、EC等小分子成分在內(nèi)，2年之后的山楂紅酒中含量下降到不足10%的水平。

表4　山楂紅酒不同時(shí)期多酚含量（μg/g）

3　結(jié)論

3.1本研究開(kāi)發(fā)了一種以甲醇-乙腈-水組成的三元流動(dòng)相梯度洗脫高效液相色譜方法，實(shí)現(xiàn)了在33 min內(nèi)對(duì)山楂紅酒中的13種酚類成分同時(shí)進(jìn)行分析檢測(cè)。方法的評(píng)價(jià)結(jié)果表明，本方法具有較好的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度，樣品前處理簡(jiǎn)單，適用于對(duì)山楂紅酒樣品中主要多酚成分進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。

3.2隨著發(fā)酵、陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，山楂紅酒中原花青素含量呈下降趨勢(shì)。

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Determination of the Content of 13 Kinds of Polyphenols in Hawthorn Wine by HPLC

JIANG Shenglong
（Yulin Product Quality Inspection Institute，Yulin，Guangxi 537000，China）

In this study，HPLC was applied to detect the content of 13 kinds of polyphenols in hawthorn wine in different periods.The results suggested that，each polyphenol was separated well，RSDs were between 0.94%to 3.62%，the linear range was within 14.2～500 ng，the minimum detection limit was between 1.78～14.2 ng，and the correlation coefficients（r）were between 0.9994～0.9999.These 13 kinds of polyphenols were determined within 33 min.The polyphenol content in hawthorn wine decreased as time passed by.

hawthorn wine；polyphenols；HPLC

TS262.7；TS261.4；TS261.7

A

1001-9286（2016）10-0115-03

10.13746/j.njkj.2016198

2016-06-13

江勝龍（1980-），男，碩士，工程師，從事食品生產(chǎn)監(jiān)督管理工作，E-mail：363252880@qq.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-08-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160803.1028.005.html。