郭威，管健，陳茂彬，謝逾群，張玉，方尚玲

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

放線菌促己酸菌產(chǎn)己酸的促進(jìn)因子探究

郭威，管健，陳茂彬，謝逾群，張玉，方尚玲

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

白酒釀造過程中某些放線菌對己酸菌產(chǎn)己酸有促進(jìn)作用已經(jīng)得到證實，但其促進(jìn)機理還有待探究。本研究以Streptomyces avicenniae GW01為出發(fā)菌株，通過產(chǎn)酸發(fā)酵試驗，最終發(fā)現(xiàn)放線菌所產(chǎn)黑色素是其促進(jìn)己酸菌產(chǎn)己酸的促進(jìn)因子。該發(fā)現(xiàn)首次揭示了放線菌所產(chǎn)黑色素與己酸菌產(chǎn)己酸之間存在聯(lián)系，為白酒釀造微生物放線菌的研究，以及己酸菌高產(chǎn)己酸的研究，提供了新思路和新方向。

白酒；放線菌；己酸菌；促進(jìn)因子

在白酒釀造行業(yè)中，對于放線菌，人們普遍認(rèn)識不足。本實驗室篩選到的1株促進(jìn)己酸菌產(chǎn)己酸的優(yōu)良放線菌Streptomyces avicenniae GW01（專利號201610104274.4），充分證實了放線菌在釀酒行業(yè)的積極作用，豐富了菌株資源，對于釀酒微生物的研究具有重要意義。白酒釀造過程中某些放線菌對己酸菌產(chǎn)己酸有促進(jìn)作用已經(jīng)得到證實，但其促進(jìn)機理還有待探究。本研究以篩選到的Streptomyces avicenniae GW01為出發(fā)菌株，對其發(fā)酵液組分進(jìn)行分離篩選，以期找到放線菌促己酸菌產(chǎn)己酸的促進(jìn)因子。

1　材料與方法

1.1材料

放線菌Streptomyces avicenniae GW01（實驗室篩選）；己酸菌Clostridium butyricum GK15（實驗室篩選）。放線菌培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基［1］；己酸菌培養(yǎng)基，巴氏合成培養(yǎng)基［2］；發(fā)酵培養(yǎng)基，巴氏合成培養(yǎng)基［2］。

1.2實驗方法

1.2.1放線菌胞外物質(zhì)對己酸菌產(chǎn)酸的影響

將培養(yǎng)成熟的Streptomyces avicenniae GW01的發(fā)酵液在12000 r/min下離心15 min，棄去菌體沉淀，取上清液，然后用0.22 μm濾膜過濾，即得到胞外液。以胞外液代替放線菌液，加入到己酸菌發(fā)酵體系中進(jìn)行產(chǎn)己酸實驗。

發(fā)酵體系各組分見表1，其他發(fā)酵條件均不變。發(fā)酵結(jié)束后，對發(fā)酵液進(jìn)行硫酸銅顯色和己酸含量測定。

表1　發(fā)酵實驗設(shè)計

1.2.2放線菌胞外液的分離組分對己酸菌產(chǎn)酸的影響

胞外液的組分分離

將發(fā)酵液10000 r/min離心15 min，棄去菌體，上清液進(jìn)行酸化處理，即用6 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH2～3，靜置過夜，離心得到酸溶組分的上清液和黑色素的粗提物。

黑色素的純化［3］

粗提物用1 mol/L的氫氧化鈉溶液充分溶解，離心后，上清液再次用6 mol/L的HCl調(diào)pH2～3，靜置4 h。離心，將得到的絮狀沉淀物用蒸餾水洗滌至中性后干燥，再次用6 mol/L的HCl酸化4 h后，依次在有機溶劑三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇中進(jìn)行抽提，最后得到的固態(tài)物質(zhì)用蒸餾水清洗2～3次后，即為純化的黑色素。

黑色素和酸溶組分對己酸菌產(chǎn)酸的影響

由于黑色素具有堿溶性，將放線菌所產(chǎn)的黑色素用NaOH溶液溶解成為pH7.6的黑色素的稀釋液，代替放線菌發(fā)酵液，加入到己酸菌的發(fā)酵體系中，其他發(fā)酵條件不變。另外，再以分離的酸溶組分，其他條件不變，加入到己酸菌的發(fā)酵體系中。同時設(shè)置己酸菌單獨發(fā)酵的對照實驗和放線菌發(fā)酵液（離心后的上清液，后同）復(fù)配己酸菌發(fā)酵的對照實驗。酸溶組分、黑色素的稀釋液、放線菌發(fā)酵液均通過0.22 μm濾膜過濾后加入。發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵液進(jìn)行硫酸銅顯色和己酸含量測定。

1.2.3黑色素的鑒定

已知上述黑色素的分離基于黑色素的溶解特性進(jìn)行，即黑色素不溶于水、酸溶液和普通有機溶劑，可溶于堿溶液。在一些情況下，黑色素與糖及蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致黑色素具水溶性。但對于上述放線菌所產(chǎn)的促己酸菌產(chǎn)酸的促進(jìn)因子，是否屬于黑色素，還需要進(jìn)一步的鑒定實驗。

（1）黑色素的溶解性

提純的黑色素分成9份，每100 mL搖瓶里面加入0.01 g黑色素，以50 mL的體積分別加入酸溶液（pH3.0）、無水乙醚、無水乙醇、氯仿、丙酮、堿溶液（pH8.0）、蒸餾水、二甲基亞砜（DMSO）、甲醇到100 mL搖瓶中。50℃，150 r/min條件下振蕩30 min后，再以5000 r/min離心20 min，未溶解的黑色素沉淀下來后，觀察溶液的顏色，設(shè)置不加黑色素的溶液作為空白對照，在OD400nm下測吸光度。通過溶液顏色和吸光度值，對不同溶劑的黑色素的溶解性進(jìn)行比較。

（2）紫外可見光吸收光譜

將純化后的黑色素配制成NaOH稀釋液。在室溫下，以蒸餾水作為基線校正，用紫外可見分光光度儀在200～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

（3）紅外吸收光譜

將純化后的黑色素用KBr壓片，用紅外光譜儀進(jìn)行特征紅外光譜分析，觀察有無黑色素的特征吸收峰。于400～4000-1處掃描。

1.2.4黑色素的己酸促進(jìn)水平

為了探究黑色素對己酸菌產(chǎn)己酸的最大促進(jìn)水平，選擇黑色素添加量、己酸菌接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度等4個重要因素，以己酸的生成量為指標(biāo)，設(shè)計3水平4因素的正交試驗，因素水平見表2。

表2　因素水平表

1.2.5己酸分析方法

硫酸銅顯色法，參見參考文獻(xiàn)［4］；氣相色譜法，參見參考文獻(xiàn)［5］。

2　結(jié)果與分析

2.1氣相色譜法己酸含量測定

對己酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行氣相色譜分析，以峰面積比對其相應(yīng)質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立標(biāo)準(zhǔn)己酸含量和峰面積的線性關(guān)系（圖1）。

圖1　GC-外標(biāo)法——己酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，對己酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸分析，己酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=23935x-7000000，相關(guān)系數(shù)達(dá)到了R2=0.99903，相關(guān)系數(shù)較好，可用于己酸定量檢測。

2.2放線菌胞外物質(zhì)對己酸菌產(chǎn)酸的影響（圖2、圖3）

由圖2和圖3可知，放線菌的胞外液參與己酸菌產(chǎn)酸發(fā)酵，硫酸銅顯色明顯，同時己酸定量檢測表明，加入胞外液的己酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸量有明顯提高，其與放線菌液直接參與的己酸菌發(fā)酵相比，促酸能力相近。從結(jié)果推測，放線菌促己酸菌產(chǎn)己酸的促進(jìn)因子可能在放線菌的胞外液中。因此，研究以放線菌胞外液為出發(fā)點，繼續(xù)對放線菌促己酸菌產(chǎn)己酸的促進(jìn)因子進(jìn)行探究。

圖2　放線菌胞外液作用下的硫酸銅顯色結(jié)果

圖3　放線菌胞外液對己酸菌產(chǎn)酸的影響

2.3放線菌胞外液的分離組分對己酸菌產(chǎn)酸的影響探究

（1）胞外液的組分分離（圖4、圖5）

圖4　放線菌胞外液組分分離

圖5　提純的黑色素

（2）黑色素和酸溶組分對己酸菌產(chǎn)酸的影響（圖6、圖7）

圖6　硫酸銅顯色效果

圖7　己酸含量測定

由圖6和圖7可以看出，加入黑色素的己酸菌產(chǎn)酸明顯增多，表現(xiàn)為顏色較其他3組都深，檢測出的己酸含量也最高；酸溶組分的添加沒有明顯效果，表現(xiàn)為顏色和單獨己酸菌發(fā)酵時顏色相近，檢測到的己酸含量和單獨己酸菌的產(chǎn)酸量也基本持平；同時還可以看出，添加了黑色素的己酸菌產(chǎn)酸試驗表明，硫酸銅顯色程度和添加放線菌發(fā)酵液的效果相近，但從檢測到的己酸含量上看，比添加放線菌發(fā)酵液的效果略好。

結(jié)合上述結(jié)果，分析可知：放線菌所產(chǎn)胞外黑色素，就是研究要找的促己酸菌產(chǎn)己酸的促進(jìn)因子。

2.4黑色素的鑒定

（1）溶解特性鑒定（表3）

表3　不同溶劑的黑色素溶液顏色及吸光度

由表3可知，本試驗所提取的黑色素，難溶于常見的有機溶劑（如無水乙醇、無水乙醚、氯仿、丙酮等），在水和甲醇中微溶，可溶于堿溶液和二甲基亞砜，易在酸性溶液中沉淀下來，這與國內(nèi)外相關(guān)的文獻(xiàn)報道［6-7］是一致的。

（2）紫外可見吸收光譜（圖8）

圖8　紫外可見吸收光譜

由圖8可知，在紫外與可見光波長范圍內(nèi)，隨著波長的逐漸增加，光密度呈下降趨勢，沒有特征吸收峰。該結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)［7］的報道基本一致。

（3）紅外吸收光譜（圖9）

圖9　紅外吸收光譜圖

紅外光譜能夠表征黑色素結(jié)構(gòu)的主要功能性基團(tuán)。從圖9可看出，黑色素在3307.21 cm-1出現(xiàn)吸收峰是因為O-H和吲哚的N-H的伸展振動引起的；同時由于C= O、-COO-、C=C的伸展振動導(dǎo)致了在1658.49 cm-1出現(xiàn)吸收峰，結(jié)合3307.21 cm-1出現(xiàn)的吸收峰，指示有-COOH結(jié)構(gòu)的存在，研究學(xué)者［7］對不同來源的黑色素都做過紅外光譜的研究，在上述特征峰所處位置都很接近，這說明黑色素的相關(guān)功能基團(tuán)是相同的，而由于不同來源的黑色素在某些功能基團(tuán)上有些差異，或是提取的黑色素純度不同，從而導(dǎo)致了不同來源黑色素的波形有些差異。

綜合以上各項實驗結(jié)果，可以鑒定該促進(jìn)因子的確是黑色素。

2.5黑色素的己酸促進(jìn)水平

設(shè)計3水平4因素的正交試驗，結(jié)果見表4。為了探究黑色素的己酸促進(jìn)水平，選擇黑色素添加量、己酸接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度等4個重要因素，以己酸的生成量為指標(biāo)。

表4　正交試驗結(jié)果

由表4分析可知，黑色素添加量對己酸生成量的影響最大，其次是己酸菌接種量，再次分別是培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間，其排序是黑色素添加量＞己酸菌接種量＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時間。黑色素添加量是2水平最佳，己酸菌接種量是3水平最佳，培養(yǎng)溫度是2水平最佳，培養(yǎng)時間是3水平最佳，因此最優(yōu)組合是A2B3C2D3，即黑色素添加量0.2 mg/100 mL，己酸菌接種量12%，33℃培養(yǎng)10 d，在此優(yōu)化組合條件下，測得己酸生成量為5.83 g/L，比優(yōu)化前提高了7.56%（表5）。

表5　黑色素的己酸促進(jìn)水平

由表5可知，添加黑色素對己酸生成量影響較大。添加黑色素后己酸生成量提高了29.04%；在最佳優(yōu)化條件即黑色素添加量0.2 mg/100 mL，己酸菌接種量12%，33℃培養(yǎng)10 d，促進(jìn)水平更高，達(dá)到38.81%。

黑色素成為放線菌促己酸菌產(chǎn)己酸的促進(jìn)因子，究其原因，可能與黑色素的功能特性有關(guān)，比如黑色素能清除自由基，免受自由基傷害，抗氧化，防止DNA的損傷；黑色素與蛋白質(zhì)等結(jié)合后結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，機械強度大大提高，蛋白質(zhì)等難以被降解，從而起到了保護(hù)作用等。

3　小結(jié)與展望

為了探究放線菌促己酸菌產(chǎn)己酸的原因，本研究以Streptomyces avicenniae GW01為出發(fā)菌株，對其發(fā)酵液組分進(jìn)行分離篩選，把分離組分加入到己酸菌發(fā)酵體系中，通過硫酸銅顯色和測定己酸含量發(fā)現(xiàn)，加入放線菌所產(chǎn)黑色素的己酸菌產(chǎn)酸量較單獨己酸菌產(chǎn)酸量，提高了29.04%。由此可見，放線菌所產(chǎn)黑色素正是促己酸菌產(chǎn)己酸的促進(jìn)因子。通過實驗也鑒定該促進(jìn)因子的確是黑色素。

為了探究黑色素的己酸促進(jìn)能力，進(jìn)行了正交優(yōu)化試驗。在最佳優(yōu)化條件即黑色素添加量0.2 mg/100 mL，己酸菌接種量12%，33℃培養(yǎng)10 d，促進(jìn)水平更高，達(dá)到38.81%。

（1）放線菌所產(chǎn)黑色素是促己酸菌產(chǎn)己酸的促進(jìn)因子。這一發(fā)現(xiàn)由于實驗條件限制、時間不足等原因，具有一定的局限性。這種局限性體現(xiàn)在：對于本試驗己酸菌之外的其他己酸菌，是否同樣有促進(jìn)作用以及其他來源黑色素是否同樣具有促己酸菌產(chǎn)己酸的能力有待后續(xù)研究。雖然實驗有一定的局限性，但該發(fā)現(xiàn)的最大意義在于首次證實了放線菌所產(chǎn)黑色素與己酸菌產(chǎn)己酸之間存在聯(lián)系，為白酒釀造相關(guān)放線菌的研究，以及己酸菌高產(chǎn)己酸的研究，提供了新的思路。

（2）關(guān)于黑色素促己酸菌產(chǎn)己酸的機理也可以進(jìn)一步探究。黑色素是一類抗氧化、能清除自由基的物質(zhì)。關(guān)于黑色素能促己酸菌產(chǎn)己酸，這一結(jié)果并非偶然。例如2014年，馬榮山等［8］發(fā)現(xiàn)在濃香型大曲酒發(fā)酵中添加維生素C，可以增加己酸含量，提高白酒品質(zhì)。而維生素C和黑色素一樣，也是一類抗氧化物質(zhì)，均具有保護(hù)微生物生長代謝的作用，是其促己酸菌產(chǎn)己酸的重要原因。

（3）同維生素C相比，黑色素更加具有應(yīng)用前景。這是因為維生素C本身不屬于白酒釀造微生物代謝產(chǎn)物，而黑色素是由白酒釀造中放線菌代謝生成，這種優(yōu)勢是維生素C不具備的。因此后續(xù)研究可以嘗試在白酒釀造環(huán)境中篩選產(chǎn)黑色素的優(yōu)良放線菌，然后應(yīng)用于白酒釀造中，有助于提高白酒香氣成分和白酒品質(zhì)。

［1］鄭莉.環(huán)境微生物學(xué)實驗［M］.廣州：華南理工大學(xué)出版社，2012：57.

［2］肖冬光.白酒生產(chǎn)技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：115.

［3］鄭晨娜，方柏山，羅菊香，等.鏈霉菌G-HD-4產(chǎn)黑色素的提取及理化性質(zhì)［J］.華僑大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2009，30（3）：292-296.

［4］張家慶.濃香型白酒窖泥養(yǎng)護(hù)與制曲關(guān)鍵技術(shù)研究［D］.武漢：湖北工業(yè)大學(xué)，2015.

［5］馮俊旗.河南六種白酒香氣成分的分析與構(gòu)成規(guī)律研究［D］.新鄉(xiāng)：河南科技學(xué)院，2013.

［6］BellAA，Wheeler M H.Biosynthesis and functions of fungal melanins［J］.Annual Review of Phytopathology，1986，24（1）：411-451.

［7］顧敏舟.一株高產(chǎn)黑色素菌的篩選培養(yǎng)及黑色素的初步研究［D］.成都：四川師范大學(xué)，2006.

［8］馬榮山，曹貞.Vc在濃香型大曲發(fā)酵酒中的應(yīng)用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014（5）：98-100.

Mechanism of Actinomycetes Promoting Caproic Acid Bacteria to Produce Caproic Acid

GUO Wei，GUAN Jian，CHEN Maobin，XIE Yuqun，ZHANG Yu and FANG Shangling
（Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation，School of Biological Engineering，Hubei University of Technology，Wuhan，Hubei 430068，China）

It has been demonstrated that certain actinomycetes from liquor-making environment may promote caproic acid bacteria to produce caproic acid.However，the promotion mechanism is still unclear.In this study，Streptomyces avicenniae GW01 was used as the starting strain for acid-producing fermentation test.The results showed that melanin produced by actinomycetes was the promoting factor for the production of caproic acid.The findings revealed the correlations between melanin and caproic acid production for the first time，which provided new thoughts and new directions for the research of actinomycetes and the yield of caproic acid.

Baijiu；actinomycetes；caproic acid bacteria；promoting factor

TS262.3；TS261.1；Q93-3

A

1001-9286（2016）10-0048-05

10.13746/j.njkj.2016187

2016-05-31

郭威（1990-），男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程。

方尚玲，教授。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-08-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160803.1034.007.html。