于春濤，劉超，陳瑞玲，朱鳳林，劉振江

（1.滄州醫(yī)學高等?？茖W校，河北滄州061001；2.河北省寧晉縣泥坑酒業(yè)有限責任公司，河北石家莊054000）

濃香型白酒窖泥變質前后真菌群落差異分析

于春濤1，劉超1，陳瑞玲1，朱鳳林1，劉振江2

（1.滄州醫(yī)學高等?？茖W校，河北滄州061001；2.河北省寧晉縣泥坑酒業(yè)有限責任公司，河北石家莊054000）

窖泥變質是北方酒廠面臨的重大難題，通過直接提取窖泥真菌總DNA，利用高通量測序的方法擴增18S rDNA并構建基因文庫，分析窖泥變質前后真菌群落組成。結果表明，窖泥變質前基因序列數(shù)為9737條，歸為2個門，優(yōu)勢真菌主要為：小囊菌屬（74.21%）、青霉菌屬（10.03%）、假裸囊菌屬（9.99%）等；窖泥變質后基因序列數(shù)達到了78322條，歸為19個門，優(yōu)勢真菌主要為：青霉菌屬（76.56%）、假裸囊菌屬（6.73%）、纖孔菌屬（5.96%）、絲蓋傘屬（2.93%）等。窖泥變質前后真菌的種類和豐度均有顯著差異，為全面了解窖泥變質提供了理論依據(jù)。

窖泥；變質；真菌群落；差異分析；高通量測序

濃香型白酒的生產以窖池中的窖泥為基礎，窖池中龐大的微生物群落在發(fā)酵過程進行著復雜的物質代謝和能量代謝，從而促進了窖泥老熟和酒質的提高［1］。法國人A.Calmette較早開展酒類微生物的研究，建立了可以利用淀粉發(fā)酵生產酒精的“阿米露法”［2］。我國濃香型白酒廠分布廣、數(shù)量多，關于菌群結構及其變化規(guī)律的研究成果更為豐富。廖建民等［3］對多個國家名優(yōu)酒廠不同季節(jié)、不同貯存期的樣本進行了研究，獲得真菌94株，其中霉菌69株、酵母菌25株。窖泥中功能真菌具有產酒精、產酶及產香作用［4］。為了揭示“窖泥產香”的奧秘，我國學者對窖泥功能微生物進行了大量的分離、純化和鑒定工作，目前從窖泥中分離的微生物以細菌為主，對真菌研究很少。然而如果對窖泥管理不善，窖泥中微生態(tài)平衡被破壞，微生物代謝出現(xiàn)異常，致使窖泥出現(xiàn)板結變硬、腐敗氣味等變質現(xiàn)象［5-7］，導致酒質下降，沒有窖香，不具有濃香型白酒的風格，會給酒廠帶來很大的經濟損失。因此研究窖泥真菌群落的動態(tài)變化，檢測出窖泥變質前后主要優(yōu)勢真菌，對人工窖泥培養(yǎng)和提高濃香型白酒質量尤為重要。

由于自然界中只有0.1%～10%的微生物可以直接培養(yǎng)，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法難以全面準確地反映窖泥生態(tài)系統(tǒng)微生物的真實情況［8-9］。近年來隨著微生物生態(tài)學的發(fā)展，分子生物學技術越來越多的應用于窖泥微生物群落結構和動態(tài)變化規(guī)律的研究，不少學者研究分析窖泥的群落組成，如羅惠波［10］、黃治國［11］等通過PCR-SSCP結合聚類分析技術比較瀘州老窖不同的窖齡的窖泥中細菌和古菌的群落差異。鄧依等［12］通過細菌rDNA ITSAFLP結合聚類分析技術比較了多糧發(fā)酵新老窖池間的細菌群落差異。但是對窖泥變質前后具體的真菌群落結構的報道比較少。

Illumina Solexa合成測序是近幾年發(fā)展起來的一項全新的高通量DNA測序技術，具有高準確性、高通量、高靈敏度和低運行成本等突出優(yōu)勢，可以同時完成傳統(tǒng)基因組學研究（測序和注釋）以及功能基因組學（基因表達及調控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究，已廣泛應用于探索土壤、海洋和濕地，以及食品發(fā)酵和廢水處理反應器等微生物區(qū)系研究，并取得了豐碩的研究成果［13-14］。目前，利用高通量測序技術對窖泥中真菌群落結構的研究還未見文獻報道。本研究利用該方法對窖泥變質前后真菌群落結構進行了分析，為全面、系統(tǒng)地揭示窖泥變質前后微生物群落結構提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

樣品采集：窖泥樣品取自河北某知名酒廠釀酒車間優(yōu)質窖泥（FNK1）和變質窖泥（PNK1）。取樣方法是FNK1從優(yōu)質窖池的窖壁和窖底各取3點樣共100 g，PNK1從變質窖池的窖壁和窖底各取3點樣共100 g，分裝后密封冷凍保存。

主要試劑：E.Z.N.A.Soil DNA Kit（OMEGA）、Qubit2.0 DNA檢測試劑盒（Life）、Taq DNA Polymerase（Thermo）、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工）。

1.2實驗方法

1.2.1窖泥預處理及總DNA提?。?5］

稱取0.2 g樣品放入含有0.5 g磁珠的5 mL離心管中，加入1 mL SLX-mLus Buffer，漩渦2 min。經OMEGA土壤DNA提取試劑盒，反復凍融、離心，收集上清液。粗提的窖泥DNA通過PCR產物純化試劑盒純化，純化后的窖泥DNAPCR擴增效果良好。

1.2.2PCR擴增及對產物進行瓊脂糖凝膠電泳

利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應應加入的DNA量。PCR所用的已經融合了Miseq測序平臺的NS1-Fung通用引物：NS1引物：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）GTAGTCATATGCTTGTCTC，F(xiàn)ung引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAATTCCCCGTTACCCGTTG。PCR體系按照如下進行：10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mM each）0.5 μL，Genomic DNA 10 ng，Bar-PCR primer F（50 uM）0.5 μL，Primer R（50 uM）0.5 μL，Plantium Taq（5 U/μL）0.5 μL，H20 add to 50 μL。配制好的PCR體系按照如下反應條件進行擴增：94℃變性3 min，接下來進行5個循環(huán)，分別是94℃變性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s；再接著25個循環(huán)，分別是94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min，然后進行第2輪擴增，引入lllumina橋式PCR兼容引物。PCR結束后，產物進行瓊脂糖凝膠電泳，對DNA進行回收。

1.2.318S rDNA擴增片段的測序、質控和聚類［16-18］

采用lllumina Miseq測序平臺對擴增片段進行雙端測序，測得的基因序列經質量控制軟件Prinsep處理，去除barcode、兩端primer以及部分低質量基因序列。

對測得的基因序列采用uclust軟件進行OTU聚類，通常域值的序列相似性定位0.97，操作分類單元被認為可能屬于屬。

1.2.4對處理后序列進行物種分類，比較窖泥變質前后真菌結構差異

物種分類采用的軟件為RDP classifier，基于OTU聚類的結果，獲取每一個OTU聚類的代表序列，分別是長度最長序列（length）、豐度最大序列（abundance）和所有序列（ALL）形成3份結果，并對各類RDP分析。本文所有的展示，均使用OTU_ALL中的數(shù)據(jù)，genus水平進行展示，采用柱形圖及表格的形式對比窖泥變質前后群落結構差異。

1.2.5MEGAN分析

使用MEGAN軟件，通過交互式搜索NCBI中的分類數(shù)據(jù)庫信息，以樹狀圖形式表現(xiàn)物質豐度情況與菌落結構，反應窖泥變質前后真菌的組成情況。

2　結果與分析

2.1窖泥變質前后真菌18SrDNANS1-Fung電泳圖譜（圖1）

圖1　真菌18S rDNANS1-Fung電泳圖譜

由圖1所示，3條泳道對比得知，泳道1和泳道2有較清晰的條帶，DNA提取時一般都通過試劑盒過柱提取，這種柱子有固定孔徑，從而決定了基因組片段的大小。泳道1比泳道2亮，說明窖泥變質后真菌數(shù)量和豐度均有所提高?；蛐蛄虚L度大部分分布在400～600 bp之間，基本滿足分析需要。

2.2窖泥變質前后18S rDNA多樣性分析

2.2.118S rDNA處理后序列數(shù)

擴增后的PCR產物去除嵌合體和靶區(qū)域序列，得到的基因序列數(shù)見表1。

表1　處理后基因序列統(tǒng)計表

綜合表1處理后的基因序列數(shù)表明，窖泥變質后的序列數(shù)顯著高于變質前，說明窖泥變質后真菌的種類和豐度有明顯的增多。

2.2.2OTU聚類分析

將多條序列按其序列間的距離對它們進行聚類后，根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元（OTU），通過OTU數(shù)目變化與uclust參數(shù)similarity值之間的數(shù)據(jù)對比，從中選擇最佳的similarity值為0.97，操作分類單元被認為屬于屬。采用OTU VENN軟件分析樣本中PNK1有861個OTUs，F(xiàn)NK1有229個OTUs，兩者同時有228個OTUs（圖2）。PNK1增加了633個OTUs，表明它們可能是在釀酒過程中，由于操作不當而新進的菌種。這些真菌群落可能與窖泥變質有關。

圖2　FNK1和PNK1 OTUS對比

2.3真菌群落結構分析

對處理后序列進行物種分類，采用RDP classifier軟件對每條序列在genus水平上計算其分配到此rank中的概率值，一般概率值大于0.8，即RDP分類域值［19-21］。根據(jù)分類學分析結果，可以得知樣品在屬分類水平的數(shù)據(jù)（表2、表3）。

結合表2、表3所示，窖泥變質前后真菌群落結構、豐度差異較大，選擇優(yōu)勢菌群進行比較。窖泥變質前絕對優(yōu)勢菌屬為小囊菌屬（Microascus），窖泥變質后青霉菌屬（Penicillium）成為絕對優(yōu)勢菌屬。Thomton［22］在前人研究的基礎上，得出結論：在未經擾動的土地上，小部分優(yōu)勢菌種是特定有利環(huán)境的結果，這個結論被普遍接受。每個研究的小生境內環(huán)境是相似的，其中窖泥真菌區(qū)系也相似，大量事實證實了窖泥真菌組成與生境類型有明顯的對應性。影響生境選擇的可能因子很復雜，Widden［23］通過多變量分析的方法（多元回歸，典型相關分析，因子分析，分類排序等），證實了真菌種類的出現(xiàn)與生物及非生物環(huán)境之間有復雜的多重關系。非生物因子如Ca2+、溫度、濕度、K+、窖泥的形成過程等，可能是少數(shù)或幾個主要真菌種出現(xiàn)的首要調節(jié)者。但有更多的證據(jù)證實生物因子有可能是主要的調節(jié)者。Gochenaur［24］研究后得出結論：種間競爭在調節(jié)種的豐富性方面是最主要的因子。窖泥中的真菌群落在經歷一個長期馴化、變化過程中，由于窖泥化學特性和窖泥生物的改變，再加上外來生物因素的影響，窖泥中的真菌群落種類組成發(fā)生改變，新的真菌群落更能適應新的環(huán)境。窖泥變質后青霉菌屬為主要調節(jié)者，通過種間相互競爭得到了如表3所示的真菌群落結構。

表2　FNK1真菌種類及豐度值

表3　PNK1真菌種類及豐度值

2.4窖泥變質前后真菌分類樹

使用MEGAN軟件，通過交互式搜集NCBI中的分類數(shù)據(jù)庫信息，以樹狀圖形式在門水平表現(xiàn)窖泥變質前后真菌群落結構（圖3、圖4）。

圖3　FNK1門水平MEGANF豐度圖

如圖3所示，窖泥變質前真菌群落結構只有子囊菌門（99.99%）和擔子菌門（0.01%），來源于原始窖泥和人工馴化。窖泥中的真菌除了能起到釀酒產香的作用外，在微生態(tài)系統(tǒng)中也發(fā)揮著多種多樣的功能，如降解纖維素、半纖維素、木質素、膠質、還原氮、溶解磷、螯合金屬離子、產生青霉素等。然而在Dobranic和Zak［25］1999年提出FungiLog理論框架和方法學之前，土壤真菌的功能多樣性研究僅僅停留在個別真菌種類和類群功能的研究方面，缺乏系統(tǒng)性和理論性。由于存在分離和檢測技術的限制，迄今為止僅有少數(shù)窖泥真菌被報道，窖泥真菌群落之間的理化特性也就不得而知。根據(jù)Gochenaur［24］所提出的理論，土壤中優(yōu)勢菌屬是微生態(tài)的主要調節(jié)者，因此在窖泥變質前建立了以子囊菌門中的小囊菌屬為主要調節(jié)者的真菌群落結構。如果小囊菌屬發(fā)生變化，則整個真菌群落結構將發(fā)生變化。

圖4　PNK1門水平MEGANF豐度圖

由圖4所示，窖泥變質后微生態(tài)發(fā)生了很大變化。共鑒定出10個真菌門、3個藻類門和其他后鞭毛生物界的6個門。其中子囊菌門（89.36%）和擔子菌門（9.62%）為主要優(yōu)勢真菌。窖泥真菌群落組成與生長環(huán)境有明顯的對應性，隨著釀造周期的增加，窖泥中真菌的生長環(huán)境（如溫度、濕度、營養(yǎng)等）發(fā)生變化，從而對應的真菌群落也將發(fā)生變化。20世紀60年代以前，少有關于土壤真菌與環(huán)境演替關系的報道，較早的如Mallik［26］研究了俄克拉荷馬代表森林植被不同演替階段區(qū)域的土壤真菌。隨著演替的進行，窖泥濕度、有機碳、Ca2+、K+等因子都逐漸升高，真菌的種類也增多。

3　討論

隨著真菌研究的不斷深入，傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術和顯微鏡觀察方法已經不能適應研究的需要，Hawksworth［27］研究表明，自然界中約有150萬真菌種類，但僅有0.7%能被分離和培養(yǎng)。隨著分子生態(tài)學方法的建立和不斷改進，采用Lllumina Miseq測序平臺的高通量DNA測序技術，對窖泥變質前后真菌群落組成、結構、動態(tài)方面有了更深入的了解，為研究窖泥功能真菌及窖泥變質的真菌影響提供有利支持。此種方法還能夠分析真菌群落和環(huán)境因子之間的關系，為將來通過檢測真菌群落結構推測環(huán)境因子打下基礎。

通過18S rDNA序列分析表明，窖泥變質前后18S rDNA擴增序列為9137條和78332條，聚類結果為229個OTUs和861個OTUs，說明真菌的種類和豐度在窖泥變質后均有較大的提高。窖泥的物理環(huán)境條件如土壤質地、pH值、C/N值、光照、水分、溫度等因素對真菌群落產生一定的影響，它們或是單個因子或是多個因子共同起作用影響著窖泥真菌的群落組成。有研究報道，土壤真菌數(shù)量隨水分的增加而增加［28］，巨天珍等［29］研究認為，影響土壤真菌數(shù)量和多樣性的最主要因素是pH值，其次是土壤中的有機質和水分含量。Paul等［30］主張對土壤真菌群落變化有關的是總C/N值，次要的因素是土壤pH值。Sabine［31］認為，土壤真菌群落組成更多的是依賴于所在生境的有效性，因為有效的生境有利于分散的孢子和繁殖體在土地利用方式改變后容易定植。吳敏娜等［32］研究表明，細菌的群落結構也會影響真菌的生長，隨著土壤細菌群落結構越來越偏離自然清潔土壤，其抑制真菌作用逐漸降低，表明細菌群落結構與土壤抑制真菌作用之間的相關性更為密切。

采用RDP classifier軟件對18S rDNA序列分析得知，窖泥變質前優(yōu)勢菌屬為小囊菌屬（74.21%），窖泥變質后優(yōu)勢菌屬為青霉屬（76.56%）。青霉屬［33］成員廣泛存在于自然界，有多種多樣的代謝產物，能產生有機酸、青霉素等，青霉菌也可以使食品、水果、飼料、種子、煙草、藥材發(fā)生酶腐變質，腐蝕工業(yè)器材、儀器設備和原料是工業(yè)和實驗室污染源之一。自然界中已發(fā)現(xiàn)的青霉絕大多數(shù)以無性繁殖的方式繁衍后代，分生孢子萌發(fā)菌絲體，氣生菌絲產生分生孢子梗，然后生出許多分生孢子，分生孢子在適宜環(huán)境中又萌發(fā)為菌絲體，以此循環(huán)反復，導致變質后窖泥中青霉屬成為絕對優(yōu)勢菌屬，青霉屬是否在窖泥變質過程中起到直接或間接作用，有待于認識窖泥微生物全貌再作綜合分析。

真菌作為窖泥重要的生物類群，對白酒釀造及窖泥微生態(tài)都起著重要作用。由于真菌個體小、數(shù)量多，其多變的類型和強大的適應環(huán)境能力為我們了解窖泥真菌全貌帶來障礙。通過高通量DNA測序技術可以快速直觀地得到窖泥真菌的多樣性并且獲得大量未知種類，顯示出分子生物技術的優(yōu)勢，然而作為一種實驗手段，此種技術并不是萬能的，因為影響PCR的因素限制了其應用，因此應保留傳統(tǒng)培養(yǎng)方式。研究窖泥真菌群落結構及其生理生化特性、形態(tài)結構，必須將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和現(xiàn)代分子生物學方法結合起來。

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Differences of Fungal Communities in Nongxiang Baijiu Pit Mud before and after the Deterioration

YU Chuntao1，LIU Chao1，CHEN Ruiling1，ZHU Fenglin1and LIU Zhenjiang2
（1.Cangzhou Medical College，Cangzhou，Hebei 061001；2.Nikeng Distillery Co.Ltd.，Shijiazhuang，Hebei 054000，China）

Pit mud deterioration is a major problem for distilleries in North China.In this study，total DNA of fungi in pit mud was extracted directly and high throughput sequencing method was used to amplify 18S rDNA and to construct gene library to analyze the composition of fungal communities in pit mud before and after the deterioration.The results suggested that，there were 9737 sequences belonging to 2 phylums before the deterioration，and the dominant fungi included Microascus（74.21%），Penicillium（10.03%），Pseudogymnoascus（9.99%），etc.There were 78322 sequences belonging to 19 phylums after the deterioration，and the dominant fungi included Penicillium（76.56%），Pseudogymnoascus（6.73%），Inonotus（5.96%），Inocybe（2.93%），etc.There were significant differences in fungi varieties and abundance before and after the deterioration.This study provided a theoretical base for the comprehensive understanding of pit mud deterioration.

pit mud；deterioration；fungal community；analysis of the difference；high throughput sequencing

TS262.3；TS261.4；TS261.1

A

1001-9286（2016）10-0040-05

10.13746/j.njkj.2016159

2016-05-09；

2016-06-16

于春濤（1979-），男，河北省滄州市人，碩士研究生，主要從事微生物發(fā)酵研究。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-07-11；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160711.1103.005.html。