常呂珍，楊云娟，2，張潤美，李萬軍，牟興玲，黃遵錫，2，唐湘華，2

（1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650500；2.云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，云南昆明650500）

黑曲霉F5產(chǎn)高溫α-糖化酶酶學(xué)性質(zhì)及產(chǎn)酒精能力研究

常呂珍1，楊云娟1，2，張潤美1，李萬軍1，牟興玲1，黃遵錫1，2，唐湘華1，2

（1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650500；2.云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，云南昆明650500）

通過對黑曲霉F5的代謝產(chǎn)物糖化酶進行了酶學(xué)性質(zhì)的研究，實驗結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為65℃，最適反應(yīng)pH值為5.0。在80℃條件下熱穩(wěn)定半衰期為2.67 min；酶促動力學(xué)中，Km值為0.836 mg/mL，Vmax為2.255 mmoL/L·min。通過對1%的底物進行糖化實驗，55 min后其DE值為67.5。產(chǎn)酒精能力測試中，料水比1∶3，添加30 IU/g原料的糖化酶，在65℃、pH5.0條件下酶解20 h，冷卻接種1%液體釀酒酵母，以28℃培養(yǎng)9 d，酒精度為19.6%vol/60 g干物質(zhì)，原料出酒率為32.2%（v/w）。

黑曲霉；糖化酶；酶學(xué)性質(zhì)；半衰期；糖化率；酒精度

糖化酶（Glucoamylase，EC 3.2.1.1）又名葡萄糖淀粉酶，是一種酸性糖苷水解酶，從淀粉或者淀粉類似物的非還原端按順序切開α-1，4糖苷鍵，也能水解α-1，6糖苷鍵、α-1，3糖苷鍵，產(chǎn)生葡萄糖。目前，糖化酶廣泛用于燃料乙醇、固態(tài)白酒、飼料行業(yè)、抗菌素、有機酸、氨基酸等發(fā)酵工業(yè)和輕工紡織業(yè)，是世界上產(chǎn)量最大和用途最廣的酶類［1-6］。

糖化酶的開發(fā)與創(chuàng)新是當前發(fā)展的一項重要任務(wù)，如何最大化提升糖化酶的功能和改造構(gòu)建酶蛋白的熱穩(wěn)定性都是當前開發(fā)的研究方向。我國大量的科研工作者如賀瑩［7］、粱新紅等［8］對黑曲霉產(chǎn)酶性質(zhì)進行了研究，發(fā)現(xiàn)黑曲霉產(chǎn)酶的最適溫度在40～60℃之間，最適pH值在3.5～7.0之間；陳冠軍等［9］對黑曲霉產(chǎn)酶熱穩(wěn)定性進行研究，發(fā)現(xiàn)糖化酶在60℃時易失活；劉洋［10］對黑曲霉糖化酶的熱穩(wěn)定性機制進行研究，發(fā)現(xiàn)向GAM-1和GAM-2中分別加入1 M山梨醇和海藻糖后，在75℃和80℃條件下，熱失活常數(shù)減小，半衰期延長。在對糖化酶的應(yīng)用研究中，王中林［11］、張嚴洪［12］、張守財［13］、郭本躍［14］等分別對不同的生產(chǎn)菌株進行產(chǎn)酒精能力測試，發(fā)現(xiàn)不同的生產(chǎn)菌在不同條件下獲得的酒精含量不同。糖化酶的添加縮短了酒精發(fā)酵周期，提高了酵母產(chǎn)酒精能力。

本實驗對高溫α-糖化酶進行了酶學(xué)性質(zhì)的分析及研究，并利用其糖化高粱原料進行產(chǎn)酒精能力測試，從云南小曲清香型酒的生產(chǎn)工藝考慮，旨在加強固態(tài)發(fā)酵的后續(xù)糖化能力和酒質(zhì)的控制，加強原料的利用率。

1　材料與方法

1.1材料及儀器

黑曲霉F5，由云南師范大學(xué)微生物實驗室選育保藏。

發(fā)酵培養(yǎng)基（%）：馬鈴薯浸出汁30、蛋白胨2、磷酸二氫氨0.4、MgSO40.05、FeSO40.001、KCl 0.05、pH4.5，定容至100 mL。

儀器設(shè)備：移液槍、磁力攪拌器、離心機、超凈臺、電熱恒溫水浴鍋、高壓滅菌鍋、搖床、渦旋振蕩器、紫外分光光度計、pH計。

1.2實驗方法

1.2.1葡萄糖標準曲線的制作［15］

1.2.2粗酶液的制備

配制發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，在121℃、0.1 MPa下滅菌30 min，冷卻，接種培養(yǎng)3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d，取發(fā)酵培養(yǎng)液離心，上清液作為待測酶液使用。

1.2.3酶活力測定

取3支試管，分別編號為空白管、樣品管A、樣品管B，向3支管中分別加入pH5.0的1%可溶性淀粉底物1.8 mL，65℃保溫5 min；向樣品管A、B中加入一定稀釋梯度的待測酶液0.2 mL，65℃精確保溫15 min后加入3 mL DNS試劑終止反應(yīng)，混合均勻；另向空白管中補加待測酶液0.2 mL；將3支管放入沸水浴中煮沸5 min，流水冷卻，加入10 mL蒸餾水，渦旋振蕩器上混勻，540 nm下測定吸光度。

酶活定義：在pH5.0、65℃條件下，1 mL酶液1 min水解1%的淀粉底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需要的酶量為1個酶活單位，用U表示。

1.3α-糖化酶最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值的分析

最適反應(yīng)溫度的測定：取制備好的粗酶液分別在溫度為20℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃條件下反應(yīng)15 min，測定酶活，分析最適反應(yīng)溫度。

最適反應(yīng)pH值的測定：取制備好的粗酶液分別在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的1%淀粉底物中，65℃反應(yīng)15 min，測定酶活，分析最適反應(yīng)pH值。

1.4α-糖化酶耐熱穩(wěn)定性分析

將制備好的粗酶液放在80℃電熱恒溫水浴鍋中分別保溫0、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min后取該保溫不同時間的粗酶液進行酶活力測定，并分析其耐熱穩(wěn)定性。

1.5α-糖化酶反應(yīng)動力學(xué)

分別配制pH5.0，濃度為0、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL的可溶性淀粉底物各1.8 mL，放置于65℃條件下預(yù)熱5 min，加入0.4 U的糖化酶反應(yīng)5 min，測定還原糖含量，通過雙倒數(shù)法計算Km和Vmax。

1.6α-糖化酶對淀粉底物的降解能力分析

取pH5.0，1%可溶性淀粉底物35 mL放置于65℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min，然后加入5 mL酶液混合均勻，每隔5 min，取出1 mL測定還原糖含量，總反應(yīng)時間為60 min。

1.7淀粉酶活力測定［16］

1.8α-糖化酶添加量對酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精能力的影響

稱取5份60 g的高粱經(jīng)沖洗后將其分別放入5個300 mL的錐形瓶中，然后按3∶1的水料比加入熱水浸泡24 h；以121℃、0.1 MPa滅菌30 min，將滅菌冷卻后的高粱按每克原料添加5 U、10 U、15 U、20 U、25 U、30 U、35 U、40 U的糖化酶的比例添加，攪拌均勻放在65℃的恒溫箱中反應(yīng)1 d，然后每瓶加入3%經(jīng)過活化的酵母10 mL攪拌均勻后放在28℃的恒溫箱中發(fā)酵9 d，對發(fā)酵液蒸餾測定酒精含量。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標準曲線的制作（圖1）

圖1　葡萄糖標準曲線圖

由圖1可知，葡萄糖標準曲線為y=1.02907x+ 0.00731，R2=0.99941＞0.95，線性關(guān)系顯著，可用于后續(xù)的研究工作。

2.2α-糖化酶最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值的分析

由圖2、圖3可知，黑曲霉F5菌株最適反應(yīng)溫度為65℃，低于50℃，酶活性不足，高于80℃則酶蛋白變性、失活；最適pH值為5.0，4～6之間，酶活力能保持80%以上，比較適合與淀粉酶配合使用進行糖化過程。

圖2　最適反應(yīng)溫度

圖3　最適反應(yīng)pH值

2.3α-糖化酶耐熱穩(wěn)定性分析（圖4）

圖4　耐熱穩(wěn)定性分析

2.4α-糖化酶反應(yīng)動力學(xué)

該由圖5進行雙倒數(shù)曲線的繪制得到圖6，由圖6得到公式：糖化酶的Km值為0.836 mg/mL，最大反應(yīng)速度Vmax為2.255 mmoL（葡萄糖）/L·min。由圖5和圖6可知，該酶的動力學(xué)常數(shù)Km=0.836 mg/mL，Vmax=2.255 mmoL/L·min。 Km值越低，表明酶與底物的結(jié)合力大，有助于酶對底物的降解。

圖5　酶反應(yīng)動力學(xué)圖

圖6　酶反應(yīng)動力學(xué)雙倒數(shù)曲線圖

2.5α-糖化酶對底物的降解能力分析（圖7）

圖7　酶對底物的降解實驗圖

由圖7可看出，該酶添加量為1 U/mL，隨著反應(yīng)時間的延長，該酶得到的還原糖含量越來越高。當反應(yīng)時間達到55 min時，形成的還原糖含量最大為5.90 mg/mL，淀粉轉(zhuǎn)化率為67.51%。隨著后期時間越來越長，還原糖含量維持平衡，糖化酶的催化能力受到一定的抑制效應(yīng)。

2.6淀粉酶活力測定

按照國標GB/T 24401—2009對糖化酶中是否含有淀粉酶進行測定分析，得到淀粉酶活力為0.008 U，對粗酶液進行糖化酶的測定，得到糖化酶活力為91.3 U，表明該酶受到淀粉酶的協(xié)調(diào)效應(yīng)很弱，該黑曲霉F5形成的產(chǎn)物基本上為糖化酶，對應(yīng)用于只需糖化酶的其他產(chǎn)品開發(fā)帶來了一定的運用價值。

2.7α-糖化酶添加量對產(chǎn)酒精能力的測試（圖8）

圖8　不同酶添加量對產(chǎn)酒精能力的影響

由圖8可知，出酒率和酒精含量都呈上升趨勢，出酒率為32.2%時，料水比為1∶3，酒精度達到19.6%vol/60 g干物質(zhì)，該糖化酶在酒精發(fā)酵的應(yīng)用中有助于提高原料利用率，能獲得較高的酒精度。

3　結(jié)論

通過對黑曲霉F5的代謝產(chǎn)物糖化酶進行了酶學(xué)性質(zhì)的研究，結(jié)果表明，該酶最適溫度為65℃，最適pH5.0。該酶的耐熱溫度比國內(nèi)報告的高，可以用于制糖行業(yè)、食品行業(yè)和飼料行業(yè)的應(yīng)用。在80℃條件下進行耐熱穩(wěn)定性分析，得到半衰期為2.67 min，對在溫度較高的飼料顆粒制造業(yè)中有一定的應(yīng)用價值，只要在80℃條件下不超過2.67 min，就能保證50%以上的酶活。酶反應(yīng)動力學(xué)中，Km為0.836 mg/mL，最大反應(yīng)速度Vmax為2.255 mmoL/L·min，表明該酶對淀粉底物的結(jié)合程度較強，Km比方善康等［17］報道的以玉米淀粉為底物對糖化酶組分分析的要大，Vmax較小。但由于酶反應(yīng)溫度條件不一樣，可比性較小。通過對1%的淀粉底物進行糖化轉(zhuǎn)化實驗，55 min后其DE值為67.5%。對淀粉酶活力進行測定只有0.08 U，粗酶液樣品糖化酶活力為91.3 U/g，表明該酶受到淀粉酶的協(xié)調(diào)效應(yīng)很弱。通過產(chǎn)酒實驗發(fā)現(xiàn)，出酒率為32.2%時，酒精度為19.6%vol/60 g干物質(zhì)，這比根霉糖化酶用于產(chǎn)酒精能力要強。從云南小曲清香型酒的生產(chǎn)工藝考慮，旨在加強固態(tài)發(fā)酵的后續(xù)糖化能力和酒質(zhì)的控制，加強原料的利用率。

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Enzymatic Properties and Alcohol-Producing Capacity of High-Temperature α-glucoamylase from Aspergillus Niger F5

CHANG Lvzhen1，YANG Yunjuan1，2，ZHANG Runmei1，LI Wanjun1，MOU Xingling1，HUANG Zunxi1，2and TANG Xianghua1，2
（1.School of Life Science，Yun'nan Normal University，Kunming，Yun'nan 650500；2.Yun'nan Key Lab for Biomass Energy and Environmental Biotechnology，Kunming，Yun'nan 650500，China）

α-glucoamylase，the metabolite of Aspergillus niger F5，its enzymatic properties were investigated in this study.The experimental results showed that，its optimum reaction temperature was 65℃，its best reaction pH was 5.0，the half-life of enzymatic thermal stability was 2.67 min at 80℃；in enzymatic kinetics，Kmvalue was 0.836 mg/mL，and Vmaxvalue was 2.255 mmoL/L·min.Saccharification experiments showed that saccharification rate was 67.5%for 1%starch concentration in optimum reaction conditions after 55 min.In alcohol-producing capacity test，the ratio of sorghum material to water was 1∶3，30 IU/g glucoamylase was added at 65℃and pH 5.0.After 20 h hydrolysis and cooling，1%liquid S.cerevisiae was inoculated，and then cultivated for 9 d at 28℃.Finally，the alcohol concentration was 19.6%vol/60 g（dry substance），and liquor yield of sorghum materials reached up to 32.2%（v/w）.

Aspergillus niger；glucoamylase；enzymatic properties；half-life；saccharification rate；alcohol

TQ920；Q55；TS262.3

A

1001-9286（2016）10-0030-04

10.13746/j.njkj.2016154

2014年云南師范大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練基金項目；生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程中心開發(fā)基金（JK2015021）。

2016-05-03

常呂珍（1990-），女，云南鎮(zhèn)雄人，在讀本科生，生物技術(shù)專業(yè)，E-mail：changlvzhen2011@126.com。

唐湘華（1973-），男，講師，從事應(yīng)用微生物發(fā)酵工程研究，E-mail：txhdom@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-07-11；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160711.1050.002.html。