張俊杰，楊旭，郭晨，李明陽，張文葉，劉崇懷

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南鄭州450009）

不同株系梅鹿輒葡萄果皮酵母菌的分離鑒定與差異分析

張俊杰1，楊旭1，郭晨1，李明陽1，張文葉1，劉崇懷2

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南鄭州450009）

研究比較和分析不同梅鹿輒葡萄株系果實(shí)表皮所蘊(yùn)含的酵母菌種群的組成差異。實(shí)驗(yàn)選取鄭州果樹研究所4個梅鹿輒不同株系的葡萄作為研究對象，通過果實(shí)表皮酵母菌群的富集培養(yǎng)、YEPD培養(yǎng)基的分離與純化，一共分離得到56個菌株；經(jīng)過WL鑒別培養(yǎng)基的培養(yǎng)與菌落和顯微形態(tài)觀察對獲得的菌株進(jìn)行初步分類，得到9個具有顯著差異的酵母形態(tài)群；然后對各形態(tài)群的代表菌株進(jìn)行DNA提取及26S rDNAD1/D2區(qū)段的PCR擴(kuò)增和測序分析，將供試菌株歸入6個酵母菌種群；最后，對葡萄株系與相關(guān)酵母菌種群進(jìn)行組成差異的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個梅鹿輒株系果皮上都含有的酵母菌種群為Filobasidium floriforme，而Sporidiobolus ruineniae和Hanseniaspora vineae僅為1個株系所獨(dú)有，而Rhodotorula graminis（Rhodosporidium babjevae）則為2個株系所共有。由結(jié)果可以推斷，由于4個株系都來自同一個品種且種植的客觀環(huán)境一致，它們果皮都含有酵母菌種群Filobasidium floriforme，但是由于株系本身的不同，又分別含有不同于其他株系的特殊的酵母菌種群。研究表明，在今后的葡萄相關(guān)酵母菌研究中，要重視葡萄種群內(nèi)株系間的差異，而不能只關(guān)注種群水平的組成差異。

梅鹿輒；果皮；酵母菌；分離；鑒定

葡萄是中國的重要作物之一，現(xiàn)今已遍布中國諸多省區(qū)［1］。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，2011年中國葡萄栽培總面積59.7萬hm2，居世界第4位；總產(chǎn)量906.7萬t，居世界首位［2］。

葡萄酒發(fā)酵過程中的大多數(shù)酵母來自果皮，僅有少數(shù)來自空氣。葡萄表面的野生酵母菌是最豐富的。成熟葡萄裂果流汁，促使酵母繁殖，因此成熟葡萄果粒表面附生大量酵母菌。果皮蠟質(zhì)有助于這些酵母菌的附著，因此葡萄果粒破碎后不久酵母菌就會大量繁殖，出現(xiàn)自然發(fā)酵現(xiàn)象［3-4］。位于葡萄漿果表面的酵母菌種類及其數(shù)量受葡萄品種、地理位置及氣候條件等諸多因素的影響［5］。

葡萄酒釀造是一個復(fù)雜的微生物學(xué)過程，是通過酵母菌的作用，將葡萄原料中糖轉(zhuǎn)化為酒精。酵母菌是最重要的微生物菌群，酵母菌性能的好壞對葡萄酒產(chǎn)量、質(zhì)量、經(jīng)濟(jì)性、生產(chǎn)管理均有較大影響，還對葡萄酒產(chǎn)品特色和風(fēng)格的形成至關(guān)重要［6-7］。葡萄酒的釀造是通過酵母菌的作用，使原料中的各種潛在品質(zhì)在酒中得以充分體現(xiàn)，優(yōu)良的葡萄酒酵母應(yīng)具有發(fā)酵性能高、耐酒精、耐糖、耐酸、耐SO2等特性［8-9］。由于不同酵母菌的作用各異，使不同的葡萄酒具有一些不同的風(fēng)味特征［10］。所以用不同菌株發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒，其酒質(zhì)和風(fēng)味差別很大［11］。按照酵母菌作用不同，可分為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）和非釀酒酵母（Non-Saccharomyces，NS）兩大類。其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是葡萄酒釀造中的主要微生物，不同酵母可以賦予葡萄酒不同的品質(zhì)與風(fēng)味，是影響葡萄酒質(zhì)量的重要因素［12-13］。所以選育有地方特色的葡萄酒優(yōu)良釀酒微生物對我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有十分深遠(yuǎn)的意義［14］。

隨著國外優(yōu)質(zhì)葡萄酒的大量進(jìn)口，對中國酒類市場造成極大的沖擊，也讓更多的人熟知并愛上了這個酒類新寵。也讓更多的人投入到葡萄酒釀造研究中，相繼出現(xiàn)各種葡萄園，葡萄酒廠，逐步形成中國特色的葡萄酒產(chǎn)業(yè)。酵母菌相關(guān)的研究能讓我們更清楚地了解中國各個地域的酵母菌分布，為酵母菌研究提供更多便利。中國葡萄酒釀造產(chǎn)業(yè)還在發(fā)展階段，酵母菌的相關(guān)研究還有待進(jìn)一步的深入研究，讓酵母菌更好地發(fā)揮積極作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1葡萄樣品的采集

實(shí)驗(yàn)用葡萄原料取自鄭州果樹研究所，采集4種梅鹿輒葡萄種植區(qū)域的共計4種葡萄各2串。當(dāng)天采集當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于無菌條件下取葡萄表皮若干封于自封袋中，放置在-20℃下冷藏。

1.1.2培養(yǎng)基

①酵母菌富集培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基（YEPD）：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，10 mg/mL氯霉素。

②分離培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖固體培養(yǎng)基（YEPD）：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L。

③鑒定培養(yǎng)基WL

營養(yǎng)培養(yǎng)基：酵母浸粉4 g/L，胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖50 g/L，磷酸二氫鉀0.55 g/L，氯化鉀0.425 g/L，氯化鈣0.125 g/L，硫酸鎂0.125 g/L，氯化鐵0.0025 g/L，硫酸錳0.0025 g/L，瓊脂20 g/L，溴甲酚綠22 mg/L。

1.1.3主要藥品與試劑

酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鐵、硫酸錳、溴甲酚綠、DNA提取試劑盒等。

1.1.4主要設(shè)備與儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱、雙人單面凈化臺、生物顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、電熱鼓風(fēng)干燥箱、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1葡萄皮酵母菌富集計數(shù)

取50 mL YEPD液體培養(yǎng)基放入三角瓶中，經(jīng)過滅菌處理后，在無菌條件下放10粒葡萄皮，再加入200 μL氯霉素液體（10 mg/mL）控制細(xì)菌生長。放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，以180 r/min、28℃培養(yǎng)48 h。

用1000 μL移液器吸取培養(yǎng)好的酵母菌液1 mL，加入提前準(zhǔn)備好的9 mL無菌水試管中，旋渦振蕩混勻，制成10-1酵母菌懸液，標(biāo)上記號。按照上述方法依次稀釋，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8酵母菌稀釋液。

用移液器取200 μL上述梯度稀釋的酵母菌懸液均勻滴在YEPD固體培養(yǎng)基平板（加入氯霉素）上，再用涂布棒均勻涂布1遍，每個梯度平行涂布2個平板。涂布好的平板放置在恒溫培養(yǎng)箱中，28℃條件下培養(yǎng)4～5 d。

酵母菌計數(shù)：選取菌落數(shù)在30～300個之間的稀釋度（10-5）的平板進(jìn)行計數(shù)，取3個平行的平均值。1 mL酵母菌懸液中酵母菌總數(shù)=平均值÷稀釋度×50。

1.2.2酵母菌的分離純化與保藏

1.2.2.1酵母菌的分離純化

富集培養(yǎng)好的酵母菌進(jìn)行下一步分離純化。YEPD上不同形態(tài)的若干單菌落在WL培養(yǎng)基（加氯霉素）上，平板劃線要確定劃出單菌落。平板置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)5 d。

1.2.2.2酵母菌菌體保藏和收集

挑取酵母菌單菌落置于3 mL YEPD液體培養(yǎng)基試管中，在恒溫?fù)u床上180 r/min振蕩、28℃培養(yǎng)1 d。菌液移入1.5 mL無菌離心管中，12000 r/min離心1 min，收集菌體，放置在-20℃冰箱中待用。

1.2.3酵母菌的初步鑒定

1.2.3.1酵母菌的形態(tài)學(xué)鑒定

①WL培養(yǎng)基上菌落形態(tài)觀察：酵母菌在WL板上生長4～5 d，就可以看到酵母菌菌落形態(tài)有著顯著的差別。具體從酵母菌的顏色、質(zhì)地、表面特征、菌落形態(tài)等特征進(jìn)行描述，對酵母菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)方面的初步分類。

②細(xì)胞顯微形態(tài)觀察：用10 μL移液器吸取生理鹽水滴在載玻片上，再挑取菌落分散在生理鹽水中制成玻片，然后進(jìn)行顯微觀察。細(xì)胞形態(tài)描述包括3個方面：細(xì)胞形狀、細(xì)胞生殖方式和細(xì)胞為單生、對生或群生。

1.2.3.2酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

（1）菌株DNA的提取

本研究采用試劑盒法提取酵母菌基因組DNA。

（2）26S rDNADl/D2基因的擴(kuò)增及測序

26S rDNAPCR擴(kuò)增方法：

使用正向引物NL1（5'-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3'），反向引物NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）。

循環(huán)序列為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸80 s，循環(huán)次數(shù)35次，最后，72℃延伸8 min。PCR反應(yīng)液組成（30μL體系）：每管中PCR緩沖液（10×）3.0 μL；25 mM MgCl21.8 μL；2.5 mM dNTPs 2.4 μL；10 μM引物各0.6 μL；5 U/μL DNA聚合酶0.6 μL，模板DNA1 μL；最后添加ddH2O定容到30 μL。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測：取0.5 μL10×上樣緩沖液，再加入2 μL待檢DNA溶液制成2.5 μL DNA樣品。打開電源開關(guān)，電壓調(diào)至100 V，電泳時間約20 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序由上海生工生物工程股份有限公司負(fù)責(zé)測序。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄皮酵母菌富集計數(shù)結(jié)果

對涂布過的WL平板進(jìn)行酵母菌計數(shù)。經(jīng)對比，選擇10-5這個濃度梯度的平板進(jìn)行計數(shù)，每個計數(shù)3次取平均值（表1）。

表1　葡萄皮酵母菌富集計數(shù)

由表1可以看出，酵母菌在50 mL液體培養(yǎng)基中的濃度無太大差別。這反映出酵母菌在4種葡萄果皮上的附著量相當(dāng)。

2.2菌株的WL培養(yǎng)基聚類結(jié)果

根據(jù)對56株菌株做詳細(xì)的菌落形態(tài)描述，對它們進(jìn)行聚類分析，做出初步的歸類?？偣矂澐殖?個表型，見表2。

從表型上看，它們有著或多或少的差別，從形態(tài)學(xué)上分析差別較大的可能分屬于不同的屬，差別較小的可能分屬于不同的種。比如，在顏色上分為3種：黃色、紅色、綠色，可判斷它們屬于不同的酵母菌菌屬；而對于顏色相同具有較小差別的可以判斷它們屬于同種菌或者相似種。

顯微觀察可以更直觀地觀察到酵母菌的細(xì)胞上的差異。細(xì)胞形狀，單生、對生或群生，繁殖方式都可以作為評判酵母種類的依據(jù)，可將菌落形態(tài)差別不大的作進(jìn)一步的區(qū)分。

2.3代表性菌株WL上的形態(tài)特征和顯微形態(tài)特征圖片（圖1）

2.426S rDNAD1/D2區(qū)段的PCR結(jié)果檢測

對酵母菌菌體DNA為模板進(jìn)行酶切，再用引物擴(kuò)增26S rDNA基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳之后置于紫外透射檢測儀上觀察、拍照。

從圖2可以看出，15個代表菌株的26S rDNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果，右邊箭頭所指的即為目標(biāo)條帶，條帶基本在一條線上，大小在600 bp左右。

2.526S rDNAD1/D2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果分析

將測序結(jié)果輸入“www.NCBI.nlm.nih.gov”，利用BLAST軟件，將測得的基因序列與Genbank數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行同源性比較。選擇同源性比較高的相關(guān)菌株，一般為99%或100%，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。

表2　酵母菌WL培養(yǎng)基聚類結(jié)果

圖1　各類型代表菌株在WL上的表型特征（左）和顯微細(xì)胞特征（右）

圖2　26SrDNAD1/D2瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

從系統(tǒng)發(fā)育樹上看，15個代表菌株共分6個屬，分別為紅酵母屬（紅冬酵母屬）、鎖擲酵母屬、隱球酵母屬、黑粉類酵母屬、出芽短梗霉屬、漢遜酵母屬，其中出芽短梗霉屬是一種類酵母屬，而紅酵母屬和紅冬酵母屬存在極高的相似性，相似度100%，如表3最上端的2個菌種。因此15個代表菌株得到5個屬的酵母菌。最終得到6個菌種：Rhodotorula graminis（Rhodosporidium babjevae）、Sporidiobolus ruineniae、Sporidiobolus pararoseus、Cryptococcus laurentii、Filobasidium floriforme、Hanseniaspora vineae。菌株和標(biāo)準(zhǔn)酵母菌的序列同源性都很高，可以確定他們同屬于一種酵母菌種。

由表3可知，F(xiàn)ilobasidium floriforme是4種葡萄所共有的，而Sporidiobolus ruineniae是②-1所獨(dú)有的，Hanseniaspora vineae是②-2所獨(dú)有的，Sporidiobolus pararoseus和Cryptococcus laurentii是②-4所獨(dú)有的。Rhodotorula graminis（Rhodosporidium babjevae）在②-1和②-3都有出現(xiàn)。由表3可看出，4種葡萄果皮上酵母菌種類分布有共通之處，又有著不同之處。并且Filobasidium floriforme是4種葡萄果皮上的共有種群，表明這種酵母菌種群在梅鹿輒葡萄果皮上的共有性。

圖3　代表菌株26S rDNAD1/D2系統(tǒng)發(fā)育樹

表3　6種酵母菌種群在4種梅鹿輒葡萄果皮上的分布

3　討論

3.1同一地域不同品種梅鹿輒葡萄果皮表面酵母菌差異

實(shí)驗(yàn)選取鄭州果蔬研究所的4種梅鹿輒葡萄，在其表皮上分離鑒定酵母菌。實(shí)驗(yàn)得到5個酵母菌屬，6個酵母菌種，F(xiàn)ilobasidium floriforme為4種葡萄共有的酵母菌種，并且也是優(yōu)勢種群。由表2可以更直觀地觀察到它們的差異性。相比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果更偏向于片面性，10粒葡萄皮并不能夠代表整串葡萄，更不能代表整株葡萄。因而，還需要作進(jìn)一步的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以確保葡萄果皮酵母菌數(shù)據(jù)的完整性，為我們得出更完善的結(jié)論提供更充分的依據(jù)。再者，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏向地域性，葡萄果皮酵母菌與土壤中酵母菌種類和優(yōu)勢種的關(guān)系可能直接決定葡萄果皮酵母菌的種類和優(yōu)勢種。因此，對同一地域土壤中酵母菌的研究也是有必要的。

另外，本次試驗(yàn)中并沒有分離出釀酒酵母，這與李雙石等［2］的研究相符合，也印證了葡萄果皮并不是釀酒酵母的主要來源。

3.2WL培養(yǎng)基鑒別結(jié)果和分子測序結(jié)果比對

整理酵母菌菌落形態(tài)描述數(shù)據(jù)后，對它們作了聚類分析，共得到9個表型，見表2。從菌落顏色上可分為3個大種，再做細(xì)分，黃色分1種：Ⅰ表型；紅色分4種：Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ表型；綠色分4種表型：Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ表型。從形態(tài)學(xué)上將它們分為9種酵母菌。

分子測序分析結(jié)果見圖3，可以看到酵母菌分別與7個不同的酵母菌種群聚為一個系統(tǒng)發(fā)育分支，且相似性都為100%。整體來看，該結(jié)果與形態(tài)學(xué)上的分類結(jié)果是相符的。黃色菌落的酵母菌最終被歸為一個種群，紅色的菌落最終被分為3個種群，綠色的菌落最終得到3個種群。同時酵母菌種類和表型分析結(jié)果不完全一致，表明形態(tài)學(xué)上的分類僅能作為初步分類的參考，并不能準(zhǔn)確區(qū)分不同的種群。如Ⅱ和Ⅶ表型最終屬于一種菌種。對于菌種要求不高的可以選擇WL鑒別培養(yǎng)基來作形態(tài)學(xué)上的鑒別。形態(tài)學(xué)上的鑒別比較節(jié)省時間，可以為分子測序提供便利，極大地減少了工作量。

本實(shí)驗(yàn)選取鄭州果樹研究所的4種不同梅鹿輒葡萄果皮經(jīng)分離、純化得到共計56個酵母菌株。在WL鑒別培養(yǎng)基上做詳細(xì)的菌落形態(tài)觀察和聚類分析，共分成9個形態(tài)類群。對每個形態(tài)類群分別挑選代表菌株，提取DNA，然后進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)段的PCR擴(kuò)增測序及系統(tǒng)發(fā)育分析。最終確定酵母菌歸屬于5個屬，6個種，排除其中存在的一種霉菌屬的菌群。經(jīng)過分析，同一地域的4種梅鹿輒葡萄品種中總共分離得到6種酵母菌，F(xiàn)ilobasidium floriforme是4個品種所共有的酵母菌種，而Sporidiobolus ruineniae和Hanseniaspora vineae僅為1個株系所獨(dú)有，而Rhodotorula graminis（Rhodosporidium babjevae）則為2個株系所共有。由結(jié)果可以推斷，由于4個株系都來自同一個品種且種植的客觀環(huán)境一致，它們果皮都含有酵母菌種群Filobasidium floriforme，但是由于株系本身的不同，又分別含有不同于其他株系的特殊的酵母菌種群。該研究啟示我們在今后的葡萄相關(guān)酵母菌研究中，要重視葡萄種群內(nèi)株系間的差異，而不能只關(guān)注種群水平的組成差異。

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Separation&Identification of Yeasts from Pericarp of Different Merlot Grape Strains and Analysis of Their Difference

ZHANG Junjie1，YANG Xu1，GUO Chen1，LI Mingyang1，ZHANG Wenye1and LIU Chonghuai2
（1.School of Food and Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou，He'nan 450002；2.Zhengzhou Fruit Research Institute，ChineseAcademy ofAgricultural Sciences，Zhengzhou，He'nan 450009，China）

In this study，the difference in yeast population from pericarp of different Merlot grape strains was analyzed.Four strains of Merlot grape from Zhengzhou Fruit Research Institute were used as the research objects.Through enrichment culture of yeast strains，and isolation and purification of YEPD culture medium，a total of 56 yeast strains was obtained.Then after incubation in WL medium，the colony morphology and microscopic morphology were observed to make a preliminary classification of the obtained strains.As a result，nine morphological yeast groups with significant difference were found.In addition，DNA extraction，26S rDNA gene PCR amplification and sequencing of the representative strains of different morphological groups were performed.By using 26S rDNA gene phylogenetic analysis，all the representative strains could be identified as six different yeast species.Finally，the difference in yeast strains from pericarp of different grape strains was analyzed.It was found that，F(xiàn)ilobasidium floriforme was found in all four Merlot strains，while Sporidiobolus ruineniae or Hanseniaspora vineae was only specific to only one Merlot strain and Rhodotorula graminis（Rhodosporidium babjevae）was found in two Merlot strains.It could be concluded that，the four grape strains were from the same grape species and planted under the same environment，so their pericarp all contained yeast population of Filobasidium floriforme.On the other hand，because they were different in grape strains，they contained specific yeast population in the pericarp.The study enlightened us that in the research on yeast population in grapes we should not only focus on species difference but also pay more attention to strain difference of the same species.

Merlot；pericarp；yeast；isolation；identification

TS262.6；Q93-3；TS261.1；TS261.2

A

1001-9286（2016）10-0022-05

10.13746/j.njkj.2016212

2016-06-29

張俊杰（1984-），男，博士，教授、校青年骨干教師、碩士生導(dǎo)師，E-mail：kirka640@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-09-14；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160914.1421.001.html。