馬學(xué)斌，白　璐，趙強(qiáng)元

(中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100048)

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·論著·

離心條件對(duì)凝血三項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果的影響及分析

馬學(xué)斌，白璐，趙強(qiáng)元

(中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100048)

目的驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)室常規(guī)凝血檢測(cè)離心條件并探討建立優(yōu)化離心條件。方法以該院體檢者及住院患者為研究對(duì)象，分為常規(guī)組、標(biāo)準(zhǔn)組、提速組。應(yīng)用不同離心條件離心獲得乏血小板血漿(PPP)，進(jìn)行常規(guī)凝血項(xiàng)目凝血酶原時(shí)間(PT)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)、纖維蛋白原(FIB)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的檢測(cè)；其次對(duì)不同血小板含量的標(biāo)本采用常規(guī)條件和標(biāo)準(zhǔn)條件離心后，檢測(cè)血漿中剩余血小板含量。結(jié)果常規(guī)組和提速組的凝血常規(guī)各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；血小板濃度低于500×109/L時(shí)，常規(guī)條件和標(biāo)準(zhǔn)條件離心后PPP 100%合格，血小板濃度高于500×109/L時(shí)合格率降低為64%。結(jié)論目前的常規(guī)離心條件可以滿足常規(guī)凝血檢測(cè)，對(duì)特殊類型凝血檢測(cè)及血小板濃度高于500×109/L的標(biāo)本，需要嚴(yán)格按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)的要求進(jìn)行離心處理。

凝血檢測(cè)；離心條件；乏血小板血漿

凝血檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于患者凝血因子和凝血功能的診斷，出血和血栓性疾病的診斷，抗凝藥物和因子替代治療的監(jiān)測(cè)，以及特異性和非特異性抗凝物質(zhì)的篩查等[1]。凝血檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性受多種因素的影響，其中檢驗(yàn)前處理程序尤為重要[2]。枸櫞酸鈉抗凝的全血標(biāo)本在進(jìn)入分析前，需以一定的速度和時(shí)間離心而獲得乏血小板血漿(PPP)?！度珖?guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第3版)》規(guī)定活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)檢測(cè)要求3 000 r/min離心10 min，凝血酶原時(shí)間(PT)低速分離血漿即可。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)指南于2015年制定的《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)匯編·臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)卷》為1 500 g離心15 min。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)第3版要求采用3 000 r/min離心10 min，但能否滿足新的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，尚未進(jìn)行驗(yàn)證；同時(shí)為有效縮短凝血標(biāo)本檢測(cè)的周轉(zhuǎn)時(shí)間(TAT)，對(duì)提高離心轉(zhuǎn)速縮短離心時(shí)間是否可行也需作進(jìn)一步的驗(yàn)證。本研究探討不同離心條件對(duì)常規(guī)凝血檢測(cè)項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果影響，包括：凝血酶原時(shí)間(PT)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)、APTT、纖維蛋白原(FIB)。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)行的離心條件進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步建立適合本室條件的凝血項(xiàng)目最佳離心條件。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2015年11月1日至12月30日該院健康體檢者為研究對(duì)象，入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)基本健康，既往無(wú)出血、血栓性疾病。(2)無(wú)心、肺、肝、腎和血液系統(tǒng)疾病史。共40例，男26例，女14例，年齡23～80歲，平均年齡(62±5)歲，進(jìn)行不同濃度血小板PPP驗(yàn)證。選取該院住院患者，根據(jù)不同血小板濃度進(jìn)行分組。

1.2儀器與試劑美國(guó)Instrumentation Laboratory公司的ACL-TOP700全自動(dòng)血凝分析儀及配套試劑、質(zhì)控品；日本西森美康XE-2100全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及配套試劑、質(zhì)控品；美國(guó)Backman DL電動(dòng)離心機(jī)，離心半徑12.5 cm。所有儀器均在良好狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3方法

1.3.1不同離心條件對(duì)凝血項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果空腹?fàn)顟B(tài)下，用含109mmol/L枸櫞酸鈉0.3 mL的真空采血管采集受檢者靜脈血2.7 mL，輕輕顛倒混勻后，送到實(shí)驗(yàn)室。共收集40份標(biāo)本，將每份平均分為3份，每份1 mL，分為常規(guī)組、標(biāo)準(zhǔn)組、提速組，分別按不同的離心條件進(jìn)行離心。常規(guī)組按照第3版要求3 000 r/min離心10 min，標(biāo)準(zhǔn)組按照《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)匯編˙臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)卷》要求1 500 g離心15 min，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)的離心半徑(12.5 cm)換算離心轉(zhuǎn)速為3 302 r/min離心15 min，提速組使用3 600 r/min離心5 min。應(yīng)用美國(guó)Instrumentation Laboratory公司生產(chǎn)配套凍干粉質(zhì)控品，復(fù)溶后分杯-20 ℃凍存，每天早晨常規(guī)實(shí)驗(yàn)前取出，室溫放置15 min溶解平衡后，混勻上機(jī)檢測(cè)，質(zhì)控在控下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PT和APTT均為凝固法；INR采用PT衍生計(jì)算法；FIB為Clauss法。所有標(biāo)本均在采集后4 h內(nèi)完成離心和上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2常規(guī)條件離心后PPP驗(yàn)證篩選同時(shí)檢測(cè)全血細(xì)胞分析和凝血常規(guī)的標(biāo)本，根據(jù)血小板檢測(cè)結(jié)果分為3組：(100～300)×109/L組，(300～500)×109/L組，(500～800)×109/L組，每組20例，將凝血標(biāo)本平均分成2份，按常規(guī)離心條件(3 000 r/min，10 min)和標(biāo)準(zhǔn)離心條件(3 302 r/min，15 min)平行進(jìn)行離心后，檢測(cè)PPP中剩余血小板含量。

2　結(jié)　　果

2.1不同離心條件對(duì)凝血三項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果的影響常規(guī)組離心條件3 000 r/min換算離心力為1 238 g，離心10 min，提速組3 600 r/min換算離心力為1 782 g離心5 min，標(biāo)準(zhǔn)組1 500 g離心15 min。3組離心后進(jìn)行檢測(cè)，3組間PT、INR、FIB、APTT兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明目前應(yīng)用的離心條件及提速離心條件均能滿足常規(guī)標(biāo)本的檢測(cè)要求。見表1。

表1　　不同離心條件下凝血檢測(cè)結(jié)果比較±s)

2.2常規(guī)離心條件下PPP的驗(yàn)證結(jié)果血小板濃度(100～300)×109/L組和(300～500)×109/L組，常規(guī)離心條件下PPP中剩余血小板分別為(5.00±2.05)×109/L和(6.35±2.56)×109/L，2組PPP剩余血小板濃度均低于10×109/L；血小板(500～800)×109/L組，常規(guī)離心條件下PPP中有部分剩余血小板高于10×109/L，不合格標(biāo)本占總例數(shù)的36%，而標(biāo)準(zhǔn)離心條件下PPP中剩余血小板全部低于10×109/L。見表2。

表2　　離心后PPP的驗(yàn)證結(jié)果

3　討　　論

凝血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與檢測(cè)流程的標(biāo)準(zhǔn)化、室內(nèi)質(zhì)量控制及實(shí)驗(yàn)前多種因素顯著相關(guān)，離心制備PPP是其中最關(guān)鍵的步驟，因而離心條件的驗(yàn)證對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)流程，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性具有十分重要的臨床意義。

《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第3版)》規(guī)定APTT檢測(cè)要求3 000 r/min,離心10 min，PT低速離心分離血漿即可，其他項(xiàng)目無(wú)明確要求。由于各醫(yī)院所用離心機(jī)品牌不同，型號(hào)不同，有效離心半徑也不同，因而在相同轉(zhuǎn)速條件下，獲得相對(duì)離心力不相同，而相對(duì)離心力才是離心沉降的決定性因素。有研究表明，血小板磷脂與蛋白成分共同促進(jìn)凝血酶原酶與凝血酶的形成，使整個(gè)凝血過(guò)程加速2×108倍[3]。推測(cè)血小板可使內(nèi)源性凝血途徑提速近1 000倍，如果離心時(shí)間不夠，血小板未完全沉降，相應(yīng)凝血的磷脂催化表面增加，從而嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果。

CLSI建議常規(guī)凝血檢測(cè)項(xiàng)目及特殊凝血檢測(cè)項(xiàng)目離心獲得合格的PPP，即血漿中血小板濃度低于10×109/L，要求離心速度為1 500 g，離心時(shí)間不少于15 min[4]?！吨腥A人民共和國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)匯編·臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)卷(2015年版)》采納CLSI的離心條件，作為我國(guó)凝血項(xiàng)目檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

有研究報(bào)道，以CLSI推薦的1 500 g為金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用不同的離心力(3 000、1 500、1 000、500 g)離心分離獲得PPP，然后檢測(cè)各組離心后PPP中剩余血小板，結(jié)果顯示，離心力為1 000 g獲得的剩余血小板與1 500 g離心比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而離心力為3 000 g分離的剩余血小板顯著低于1 500 g離心；離心力為500 g的剩余血小板顯著高于1 500 g離心[5]。本研究使用常規(guī)離心條件獲得PPP，進(jìn)行凝血項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)離心條件下檢測(cè)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與上述研究結(jié)果具有一致性。

本研究探討提高離心速度縮短離心時(shí)間對(duì)凝血檢測(cè)結(jié)果的影響。緊急情況下，常規(guī)凝血項(xiàng)目的檢測(cè)時(shí)間不能滿足臨床急診。本組將離心速度提高至3 600 r/min，離心時(shí)間縮短至5 min獲得PPP進(jìn)行凝血檢測(cè)，結(jié)果表明該結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)離心條件下獲得的凝血檢測(cè)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，是緊急情況下縮短TAT的有效、可行方法，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[6-7]。

根據(jù)CLSI建議，不同凝血檢測(cè)項(xiàng)目對(duì)血漿中殘存血小板的要求不同。PT和APTT檢測(cè)低于200×109/L即可，而特殊類型凝血檢測(cè)項(xiàng)目(蛋白S)則必須要求血漿中血小板濃度低于10×109/L。有研究顯示，1次離心可滿足常規(guī)凝血項(xiàng)目，而特殊類型項(xiàng)目則需要經(jīng)過(guò)2次離心才能達(dá)到小于10×109/L[8]。有學(xué)者研究報(bào)道，離心機(jī)工作時(shí)加速鍵的“開”或者“關(guān)”也是影響PPP中剩余血小板的重要因素，建議凝血標(biāo)本離心時(shí)選擇“關(guān)”[9]。依據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，普通凝血4項(xiàng)檢測(cè)在常規(guī)離心條件下可達(dá)到要求。特殊類型項(xiàng)目需增加離心條件或者進(jìn)行2次離心，達(dá)到合格。由于特殊類型項(xiàng)目的檢測(cè)試劑昂貴，本組未進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，僅以離心后PPP水平驗(yàn)證離心效果。

某些患者血小板含量非常高，常規(guī)離心后是否能滿足檢測(cè)要求。本研究選取血小板含量不同的患者凝血標(biāo)本，按常規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)條件離心后，檢測(cè)PPP中剩余血小板含量，結(jié)果顯示，血小板(100～300)×109/L和(300～500)×109/L時(shí)，PPP中剩余血小板均在10×109/L以下，而當(dāng)血小板高于500×109/L時(shí)，PPP中剩余血小板僅有64%小于10×109/L，有36%的標(biāo)本離心后PPP中剩余血小板高于10×109/L，按標(biāo)準(zhǔn)條件離心后血小板全部低于10×109/L。因此對(duì)于常規(guī)凝血項(xiàng)目檢測(cè)，用常規(guī)離心條件的PPP水平可接受，但如果是特殊類型凝血項(xiàng)目，如狼瘡抗凝物檢測(cè)等，則需要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)要求的離心條件進(jìn)行離心，獲得標(biāo)準(zhǔn)的、可滿足檢測(cè)的PPP[10]。

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Analysis the effect of different centrifugal conditions on the results of coagulation

MAXuebin，BAILu，ZHAOQiangyuan

(DepartmentofClinicalLaboratory,NavyPLAGeneralHospital,Beijing100048,China)

ObjectiveTo verify the effect of different centrifugal conditions on coagulation and ascertain the optimum centrifugal time for coagulation testing in the laboratory.MethodsNavy General hospital check-up and hospitalized patients were divided into three groups which were conventional group,standard group and speed up the group respectively according the different centrifugation conditions.The platelet poor plasma (PPP) was harvested in the three different groups.The PT,INR,FIB and APTT were tested and the results were compared and analyzed.Samples with different platelets were centrifuged in normal condition or standard condition,after that,the residual platelet in plasma was detected.ResultsThere was no significant difference of the PT,INR,FIB and APTT results among the routine group,speed group and the standard group.The results of PPP was qualified 100% in samples which platelets were less than 500×109/L with routine conditions and standards of centrifugal conditions.However,the qualified result of PPP was dropped to 64% in those samples which platelets were higher than 500×109/L with routine and standards of centrifugal conditions.ConclusionThe conventional centrifugation conditions can meet clinical routine coagulation testing requirements,the special types of coagulation assays or the samples which platelets count are more than 500×109/L should centrifuge in accordance with the requirements of the CLSI centrifugal processing.

coagulation testing;centrifugal conditions;platelet-poor plasma

馬學(xué)斌,女,主管技師，主要從事凝血與血栓研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.005

A

1673-4130(2016)19-2672-03

2016-02-25

2016-04-20)