張　馨, 李　揚(yáng), 曹　紅, 歐陽巧鳳,, 鄭蘭蘭,4, 李　春

(1. 石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 石河子 832003; 2. 嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院, 嘉興 314001;3. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081; 4. 喀什大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 喀什844006)

?

雙三氟甲烷磺酰亞胺類離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉菌株全細(xì)胞催化特性的影響

張馨1, 李揚(yáng)1, 曹紅2, 歐陽巧鳳1,2, 鄭蘭蘭1,4, 李春3

(1. 石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 石河子 832003; 2. 嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院, 嘉興 314001;3. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081; 4. 喀什大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 喀什844006)

研究了雙三氟甲烷磺酰亞胺陰離子Tf2N-分別與5種不同陽離子組成的離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉菌(PenicilliumpurpurogenumLi-3)的生長(zhǎng)、 代謝、 細(xì)胞膜透性及全細(xì)胞催化活性的影響. 結(jié)果表明, [N1,4,4,4]Tf2N對(duì)產(chǎn)紫青霉菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用, [Py14]Tf2N, [Bmim]Tf2N, [BPy]Tf2N和[P6,4,4,4]Tf2N 4種離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉菌的生長(zhǎng)則均有不同程度的抑制. 代謝活力保留值R的測(cè)定結(jié)果表明, [P6,4,4,4]Tf2N和[N1,4,4,4]Tf2N對(duì)產(chǎn)紫青霉菌體細(xì)胞表現(xiàn)出相對(duì)較高的生物相容性; 5種離子液體對(duì)菌體細(xì)胞的細(xì)胞膜透性均有改善作用. 全細(xì)胞催化反應(yīng)數(shù)據(jù)顯示, 最優(yōu)離子液體為[Py14]Tf2N, 當(dāng)其加入量為25%, 反應(yīng)84 h后, 單葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)產(chǎn)率高達(dá)95.38%. 5種離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉菌的生長(zhǎng)、 代謝、 細(xì)胞膜透性及全細(xì)胞催化活性的影響不僅與陰離子Tf2N-有關(guān), 陽離子的組成、 結(jié)構(gòu)和性質(zhì)也發(fā)揮重要的作用.

雙三氟甲烷磺酰亞胺陰離子; 陽離子; 離子液體; 產(chǎn)紫青霉菌; 單葡萄糖醛酸基甘草次酸

全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化過程的反應(yīng)介質(zhì)主要有水和有機(jī)溶劑兩大體系, 與水相中的生物催化反應(yīng)相比, 非水相介質(zhì)中生物催化反應(yīng)具有較特殊的優(yōu)勢(shì), 然而酶的立體選擇性和催化活性一般會(huì)受到傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的限制, 有機(jī)溶劑本身的毒害性會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成一定程度的破壞, 從而影響催化效率, 同時(shí)也會(huì)造成化學(xué)工業(yè)污染. 針對(duì)這一問題, 目前較多使用新型的綠色溶劑離子液體(ILs)作為生物催化反應(yīng)的介質(zhì).

將離子液體/水雙相體系應(yīng)用于生物催化反應(yīng), 既可以充分利用離子液體能夠促進(jìn)生物催化活性和環(huán)境友好的特點(diǎn), 又能克服底物或產(chǎn)物在水相中溶解度低、 不穩(wěn)定及反應(yīng)物對(duì)催化反應(yīng)產(chǎn)生抑制等缺點(diǎn)[1]. Sch?fer等[2]在甲基叔丁基醚(MTBE)和10種不同離子液體中對(duì)8種不同脂肪酶和2種酯酶的活性進(jìn)行了檢測(cè), 結(jié)果顯示, 在離子液體[Mmim]Tf2N雙相體系中脂肪酶Pseudomonas和Alcaligenes的對(duì)映體選擇性比在MTBE中顯著提高, 且酶在離子液體[Mmim]Tf2N, [Omim][PF6]和[Bmim]5[CF3SO3]中可以保持良好活性. Robert等[3]發(fā)現(xiàn)疏水性離子液體[NMeOct3][Tf2N]和[P6,6,6,14]5[Tf2N]作為催化介質(zhì)均能提高重組E.coli細(xì)胞對(duì)甲苯雙加氧催化的效率, 這2種離子液體對(duì)E.coli細(xì)胞都具有良好的生物相容性, 離子液體/水雙相體系可有效保護(hù)細(xì)胞免受底物甲苯的毒害作用; 與水相體系相比, 細(xì)胞對(duì)甲苯的耐受性提高了8倍, 產(chǎn)物甲苯順乙二醇濃度提高了2.5倍; Kohlmann等[4]在短乳桿菌乙醇脫氫酶催化難溶于水的脂肪族酮類還原反應(yīng)中使用水溶性離子液體作為添加劑, 提高了反應(yīng)的立體選擇性; Lourenco等[5]發(fā)現(xiàn)1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯與A型明膠形成的離子凝膠包載氧化酶的催化效果良好, 當(dāng)基質(zhì)濃度大于0.15 mmol/L時(shí), 包載后的辣根過氧化物酶還能保持91%的初始酶活性, 而游離的辣根過氧化物酶則已失活, 說明離子液體與明膠復(fù)合材料能實(shí)現(xiàn)酶在較高濃度基質(zhì)中的酶促反應(yīng); Lütz研究小組[6]報(bào)道了3種典型的電化學(xué)酶在水溶性離子液體中的催化合成反應(yīng), 發(fā)現(xiàn)在離子液體中還原型輔酶Ⅱ化學(xué)再生的空時(shí)產(chǎn)率提高了3倍; 在氨基酸氧化酶催化拆分外消旋蛋氨酸反應(yīng)中, 酶輔因子黃素腺嘌呤二核苷酸通過二茂鐵羧酸再生的空時(shí)產(chǎn)率提高了50%, 催化劑利用率也提高了140%; 此外, 在含離子液體的氯過氧化物酶催化(R)-苯基甲基亞砜過程中, 所需的共基質(zhì)H2O2再生的空時(shí)產(chǎn)率和催化劑利用率增加了1～4.2倍不等, 增加多少主要取決于離子液體的類型[7].

當(dāng)陰離子為雙三氟甲烷磺酰亞胺(Tf2N-)時(shí), 大部分離子液體與水不互溶, 與緩沖溶液體系形成雙相體系. 在前期研究結(jié)果[8～12]的基礎(chǔ)上, 本文選用陰離子Tf2N-分別與5種不同陽離子組成的離子液體作為反應(yīng)介質(zhì), 從產(chǎn)紫青霉(PenicilliumpurpurogenumLi-3)細(xì)胞的生長(zhǎng)、 代謝、 細(xì)胞膜透性和催化活性等方面進(jìn)行研究, 期望從離子液體的組成結(jié)構(gòu)上找到離子液體對(duì)細(xì)胞催化作用的影響規(guī)律.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

產(chǎn)紫青霉PenicilliumpurpurogenumLi-3為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種. 甲基三丁基銨雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽([N1,4,4,4]Tf2N)、N-甲基-N-丁基吡咯烷雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽([Py14]Tf2N)、 1-丁基吡啶雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽([BPy]Tf2N)、 己基三丁基膦雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽([P6,4,4,4]Tf2N)和1-丁基-3-甲基咪唑雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽([Bmim]Tf2N), 純度均>98%, 購自中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所; 其余試劑均為分析純.

LC-10A型高效液相色譜儀(HPLC)和光電二極管陣列(PDA)檢測(cè)器(日本島津公司); InertSustain C18柱(4.0 mm×250 mm, 日本GL Science公司); LCsolution型紫外檢測(cè)器(日本島津公司).

1.2離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響實(shí)驗(yàn)

向5只錐形瓶中各加入100 mL基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基, 再分別加入2 mmol [BPy]Tf2N, [Py14]Tf2N, [N1,4,4,4]Tf2N, [P6,4,4,4]Tf2N和[Bmim]Tf2N 5種離子液體. 經(jīng)滅菌、 冷卻及接種產(chǎn)紫青霉后, 于32 ℃, 150 r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)96 h, 取出, 抽濾, 將附著菌體的濾紙(已于80 ℃恒重)置于80 ℃恒溫干燥箱中恒重, 計(jì)算菌體干重[以細(xì)胞干重(DCW) g/L計(jì)]. 另取空白組[不接菌, 加入相同體積磷酸鹽(PB)緩沖液]和對(duì)照組(接菌, 加入相同體積PB緩沖溶液), 按照相同方法處理. 平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次, 取平均值.

1.3離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉細(xì)胞的生物相容性實(shí)驗(yàn)

以產(chǎn)紫青霉細(xì)胞在離子液體中的糖代謝活力保留值(R)[13]來評(píng)價(jià)離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉菌株細(xì)胞的生物相容性. 將5種離子液體分別與PB緩沖溶液(0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4, pH=7.0)按照體積比1∶1配成混合體系, 然后分別準(zhǔn)確移取5 mL混合體系溶液加入6支10 mL離心管中, 離子液體體積分?jǐn)?shù)分別為0, 6%, 10%, 14%, 20%和25%, 再各加0.15 g產(chǎn)紫青霉?jié)窬w, 于32 ℃, 150 r/min轉(zhuǎn)速下, 浸泡24 h后, 離心, 除去上層清液. 用生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%)洗滌菌體, 離心, 除去上層清液后, 加入5 mL葡萄糖溶液(1.0 g/L), 在32 ℃, 150 r/min轉(zhuǎn)速下振搖4 h, 離心. 準(zhǔn)確移取1 mL上清液于25 mL容量瓶中定容, 采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)[14]法測(cè)定其中葡萄糖的含量. 另取空白組(將0.15 g濕菌體微波滅活后, 加入5 mL離子液體/PB緩沖溶液的混合體系中浸泡24 h)和對(duì)照組(將0.15 g濕菌體加入5 mL PB緩沖溶液中浸泡24 h)按照相同方法處理和測(cè)定, 計(jì)算R值. 平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次, 取平均值.

1.4離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉細(xì)胞膜透性的影響實(shí)驗(yàn)

將5種離子液體分別與PB緩沖溶液(0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4, pH=7.0)按照體積比1∶3配成混合體系, 然后分別準(zhǔn)確移取5 mL混合溶液加入6支20 mL離心管中, 再各加入0.5 g濕菌體, 于32 ℃, 150 r/min轉(zhuǎn)速下振搖. 每隔2 h準(zhǔn)確移取0.5 mL發(fā)酵液, 測(cè)定其中蛋白質(zhì)[15]和核酸[16]的含量. 另取對(duì)照組(將0.5 g濕菌體加入5 mL PB緩沖溶液中)按照相同方法處理和測(cè)定. 平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次, 取平均值.

1.5離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉全細(xì)胞催化活性的影響實(shí)驗(yàn)

取6支10 mL離心管, 分別加入4 mL含2.8 g/L甘草酸(GL)的底物溶液(由0.2 mol/L, pH=7.0的PB緩沖溶液配制)和0.15 g產(chǎn)紫青霉?jié)窬w, 按照一定的體積分?jǐn)?shù)(0, 6%, 10%, 14%, 20%和25%)分別加入[BPy]Tf2N, [Py14]Tf2N, [N1,4,4,4]Tf2N, [P6,4,4,4]Tf2N和[Bmim]Tf2N 5種離子液體, 再用PB緩沖液(0.2 mol/L, pH=7.0)定容至6 mL. 置于常壓恒溫?fù)u床上(32 ℃, 150 r/min)反應(yīng), 間隔一定時(shí)間取反應(yīng)液離心(10000 r/min, 2 min)后, 移取0.5 mL上層清液, 用甲醇定容于10 mL容量瓶中, 過濾后, 用高效液相色譜檢測(cè)[17], 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm, 流動(dòng)相甲醇與重蒸水(加入適量醋酸, pH=2.85)體積比為81∶19, 流速為0.7 mL/min, 柱溫箱為40 ℃, 進(jìn)樣20 μL. 取樣的時(shí)間間隔為20, 40, 60和84 h. 平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次, 取平均值.

1.6數(shù)據(jù)處理

高效液相色譜(HPLC)的主要儀器參數(shù)參見文獻(xiàn)[18]. 計(jì)算公式為YGAMG=PGAMG/S0(YGAMG為GAMG的產(chǎn)率,PGAMG為反應(yīng)后產(chǎn)物GAMG的濃度,S0為反應(yīng)前底物GL的初始濃度).

2　結(jié)果與討論

2.1離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響

由圖1可見, 在相同培養(yǎng)條件下, 與對(duì)照組相比, [N1,4,4,4]Tf2N對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用, 這可能是因?yàn)閇N1,4,4,4]Tf2N在培養(yǎng)基中能解離出銨離子, 給菌體提供了生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所致. [Bmim]Tf2N對(duì)菌體生長(zhǎng)則產(chǎn)生了較明顯的抑制, 其次是[BPy]Tf2N, 而[Py14]Tf2N和[P6,4,4,4]Tf2N對(duì)菌體生長(zhǎng)抑制作用較弱, 這4種離子液體對(duì)菌株細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用可能與陰離子Tf2N-能夠強(qiáng)效抑制細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATP+酶的活性[19]有關(guān), 而抑制作用的強(qiáng)弱則與陽離子的組成、 結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān).

Fig.1　　　　Influence of ionic liquid on the cell biomass a. Aqueous; b. [Bmim]Tf2N; c. [BPy]Tf2N; d. [Py14]Tf2N; e. [N1,4,4,4]Tf2N; f. [P6,4,4,4]Tf2N.

Fig.2　Metabolic activity retention(R) of Penicillium purpurogenum Li-3 cell in different ionic liquidsa. Aqueous; b. [Bmim]Tf2N; c. [BPy]Tf2N; d. [Py14]Tf2N; e. [N1,4,4,4]Tf2N; f. [P6,4,4,4]Tf2N.

2.2離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉細(xì)胞的生物相容性

糖代謝是細(xì)胞基本的代謝活動(dòng), 可用細(xì)胞糖代謝活力保留值R表征細(xì)胞的代謝活力和生長(zhǎng)狀況. 若溶劑的毒性越小, 則R值越大, 表明溶劑對(duì)細(xì)胞的生物相容性越好[20]. 由圖2可知, 5種離子液體按照代謝活力保留值R由大到小的順序?yàn)閇P6,4,4,4]Tf2N >[N1,4,4,4]Tf2N >[Py14]Tf2N >[Bmim]Tf2N >[BPy]Tf2N. 其中, [P6,4,4,4]Tf2N和[N1,4,4,4]Tf2N的R值相近, 二者僅略低于水溶液的R值, 且比其它3種離子液體的R值均大, 說明這2種離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉Li-3菌體細(xì)胞表現(xiàn)出相對(duì)較高的生物相容性. 根據(jù)相關(guān)離子液體對(duì)微生物毒性研究[19]的報(bào)道, 由于這2種離子液體的陽離子結(jié)構(gòu)中都不含有芳香烴或其它環(huán)狀結(jié)構(gòu), 親油性低, 且半徑比較大, 因此其對(duì)菌體細(xì)胞的潛在毒性較小, 對(duì)菌體代謝的抑制作用弱. 此外, 由圖2還可知, [BPy]Tf2N的R值最小, 表明在5種離子液體中, [BPy]Tf2N對(duì)菌體代謝活力的抑制作用最強(qiáng). 這可能與[BPy]Tf2N的陽離子帶有芳香性的吡啶環(huán)有關(guān). [Bmim]Tf2N和[Py14]Tf2N的陽離子分別帶有芳香性的吡咯環(huán)和飽和五元雜環(huán), 這也是導(dǎo)致它們對(duì)菌體代謝活力的抑制作用相對(duì)較強(qiáng)的原因. 因此, 可以推斷陽離子結(jié)構(gòu)上的差異是導(dǎo)致這5種離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉細(xì)胞毒性差異的根本原因.

2.3離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉菌株細(xì)胞膜透性的影響

如圖3所示, 在相同時(shí)間下, 5種離子液體介質(zhì)中菌體細(xì)胞透出蛋白質(zhì)和核酸的量不同; 對(duì)于同一種離子液體, 不同反應(yīng)時(shí)間的細(xì)胞透出蛋白質(zhì)和核酸的量也不相同. 這說明5種離子液體均對(duì)細(xì)胞膜透性有不同程度的改善作用, 這與離子液體的疏水基團(tuán)可與細(xì)胞壁/脂質(zhì)膜上的親脂基團(tuán)發(fā)生相互作用[21]有關(guān). 實(shí)驗(yàn)測(cè)定的5種離子液體介質(zhì)中, 透出蛋白質(zhì)含量的順序?yàn)閇Bmim]Tf2N>[BPy]Tf2N>[Py14]Tf2N>[N1,4,4,4]Tf2N>[P6,4,4,4]Tf2N, 透出核酸含量的順序?yàn)閇Bmim]Tf2N>[BPy]Tf2N>[Py14]Tf2N>[P6,4,4,4]Tf2N>[N1,4,4,4]Tf2N. 說明[Bmim]Tf2N, [BPy]Tf2N和[Py14]Tf2N這3種離子液體對(duì)菌體透出蛋白質(zhì)及核酸含量都比在水溶液和其它2種離子液體介質(zhì)中多, 對(duì)細(xì)胞膜透性的改善作用較大; 而其它2種離子液體[P6,4,4,4]Tf2N和[N1,4,4,4]Tf2N對(duì)細(xì)胞膜透性改善作用較小. 其原因可能是[P6,4,4,4]Tf2N和[N1,4,4,4]Tf2N這2種離子液體的陽離子都不含環(huán)狀結(jié)構(gòu), 且半徑都比較大, 其對(duì)菌體細(xì)胞的潛在毒性較小, 因此對(duì)細(xì)胞膜的穿透作用較弱.

Fig.3　　　　Strain cell membrane permeability with proteins(A) and RNA(B) in 25%(volume fraction) different ionic liquids a. Aqueous aqueous; b. [BPy]Tf2N; c. [Py14]Tf2N; d. [N1,4,4,4]Tf2N; e. [P6,4,4,4]Tf2N; f. [Bmim]Tf2N.

2.4離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響

在甘草酸生物轉(zhuǎn)化體系中分別加入5種離子液體, 考察了陽離子種類及添加離子液體濃度對(duì)產(chǎn)紫青霉全細(xì)胞催化進(jìn)程的影響, 結(jié)果如圖4所示.

Fig.4　　　　Effect of ionic liquids with different volume fraction on the yield of GAMG (A)[Bmim]Tf2N; (B)[BPy]Tf2N; (C)[Py14]Tf2N; (D)[N1,4,4,4]Tf2N; (E)[P6,4,4,4]Tf2N; a. Aqueous; volume fraction of ionic liquid: b. 6%; c. 10%; d. 14%; e. 20%; f. 25%.

由圖4(A)可知, 隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng), 在5種離子液體介質(zhì)中, GAMG產(chǎn)率均呈持續(xù)增加趨勢(shì), 并且在反應(yīng)20 h后, 5種離子液體介質(zhì)體系中GAMG的產(chǎn)率均逐漸明顯高于純緩沖液體系.

從介質(zhì)中離子液體的濃度變化分析可見, 當(dāng)[Bmim]Tf2N體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí), 反應(yīng)84 h后GAMG產(chǎn)率達(dá)76.2%[圖4(A)]; 當(dāng)反應(yīng)84 h時(shí), 在分別加入體積分?jǐn)?shù)20%和25%[BPy]Tf2N體系中, GAMG產(chǎn)率均趨于60.9%[圖4(B)]; 反應(yīng)20 h后, GAMG的產(chǎn)率在含不同濃度[Py14]Tf2N的介質(zhì)體系中均比在純緩沖溶液體系中明顯提高, 并且GAMG產(chǎn)率隨著加入離子液體體積分?jǐn)?shù)的增大而升高[圖4(C)], 當(dāng)加入體積分?jǐn)?shù)為25%, 反應(yīng)84 h時(shí), GAMG的產(chǎn)率達(dá)95.4%; 含不同濃度的[N1,4,4,4]Tf2N和[P6,4,4,4]Tf2N介質(zhì)體系對(duì)全細(xì)胞催化GL合成GAMG也同樣具有促進(jìn)作用, 在加入體積分?jǐn)?shù)為25%, 反應(yīng)84 h時(shí), 在[N1,4,4,4]Tf2N和[P6,4,4,4]Tf2N介質(zhì)體系中GAMG產(chǎn)率分別達(dá)81.2%和71.6%[圖4(D)和(E)].

全細(xì)胞催化活性的大小是由離子液體對(duì)細(xì)胞的生物相容性和細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響、 離子液體對(duì)細(xì)胞膜通透性改善的程度以及離子液體中陰、 陽離子對(duì)酶催化活性的影響等多方面因素共同作用決定的. 5種離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉全細(xì)胞催化活性均具有促進(jìn)作用, 這是因?yàn)槠潢庪x子Tf2N-為疏水基團(tuán), 可以和細(xì)胞壁/脂質(zhì)膜上的親脂基團(tuán)相互作用而穿透細(xì)胞膜內(nèi), 其疏水性可導(dǎo)致胞內(nèi)酶蛋白質(zhì)周圍水的活性提高, 游離水分子促使酶蛋白趨于以活性增強(qiáng)的構(gòu)象表達(dá)酶活性[21].

5種離子液體對(duì)全細(xì)胞催化促進(jìn)作用的強(qiáng)弱順序?yàn)閇Py14]Tf2N >[N1,4,4,4]Tf2N >[Bmim]Tf2N >[P6,4,4,4]Tf2N >[BPy]Tf2N. 由于[Bmim]Tf2N和[BPy]Tf2N的陽離子中含有芳香雜環(huán), 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用, 且具有較強(qiáng)的毒性, 因此減小了離子液體對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的促進(jìn)程度. [P6,4,4,4]Tf2N對(duì)菌體生長(zhǎng)雖然沒有明顯的抑制作用, 且具有較好的生物相容性, 但因其陽離子尺寸較大, 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)較困難, 對(duì)酶催化的促進(jìn)作用較弱. [N1,4,4,4]Tf2N對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用, 且生物相容性較好, 其陽離子尺寸也比[P6,4,4,4]Tf2N要小, 因此在陰離子的作用下, 相對(duì)較容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)對(duì)酶催化反應(yīng)產(chǎn)生促進(jìn)作用. [Py14]Tf2N對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)活性略有抑制, 并且對(duì)菌體也有一定毒性, 但卻對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)表現(xiàn)出很強(qiáng)的促進(jìn)作用. 這一特殊現(xiàn)象與Allen等[22]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似, 可解釋為這種離子液體能通過對(duì)細(xì)胞呼吸過程的抑制促使NADH和O2轉(zhuǎn)向高表達(dá)的生物催化過程, 從而阻止細(xì)胞對(duì)一些非生產(chǎn)性底物的消耗, 使反應(yīng)向更有利于生成產(chǎn)物方向進(jìn)行.

3　結(jié)　　論

研究了5種雙三氟甲烷磺酰亞胺類離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉菌生長(zhǎng)、 代謝、 細(xì)胞膜透性以及全細(xì)胞催化活性的影響. 結(jié)果表明, 5種離子液體對(duì)產(chǎn)紫青霉菌生長(zhǎng)、 代謝、 細(xì)胞膜透性及全細(xì)胞催化活性的影響與其陽離子的組成、 結(jié)構(gòu)和性質(zhì)密不可分; 與其它4種離子液體相比, [Py14]Tf2N在產(chǎn)紫青霉全細(xì)胞催化GL合成GAMG的過程中表現(xiàn)出更大的促進(jìn)作用. 本文結(jié)果為雙三氟甲烷磺酰亞胺類離子液體應(yīng)用于生物催化領(lǐng)域提供了理論依據(jù).

[ 1 ]Weuster-Botz D.,Chem.Rec., 2007, 7(6), 334—340

[ 2 ]Sch?fer S. H., Kaftzik N., Wasserscheid P., Kragl U.,Chem.Commun., 2001, 1, 425—426

[ 3 ]Robert J.C., Catherine L.W., Stephanie S., Royston G., Gill S.,GreenChem., 2008, 10, 685—691

[ 4 ]Kohlmann C., Robertz N., Leuchs S., Dogan Z., Lutz S., Bitzer K., Namnieh S., Greiner L.,J.Mol.Catal.B:Enzym., 2011, 68(2), 147—153

[ 5 ]Lourenco N. M. T., Osterreicher J., Vidinha P., Barreiros S., Afonso C. A. M., Cabral J. M. S., Fonseca L. P.,React.Funct.Polym., 2011, 71(4), 489—495

[ 6 ]Kohlmann C., Greiner L., Leitner W., Wandrey C., Lütz S.,Chem.Euro.J., 2009, 15(43), 11692—11700

[ 7 ]Guo L. T., Le C. G.,Chemistry, 2012, 75(5), 400—406(郭麗濤, 樂長(zhǎng)高. 化學(xué)通報(bào), 2012, 75(5), 400—406)

[ 8 ]Cao H., Sun Q., Duan H. Y., Ye H., Chen S. Y., Liu G. Y.,J.BeijingIns.Technol., 2011, 31(6), 732—736(曹紅, 孫倩, 段海燕, 葉海, 陳思羽, 劉桂艷. 北京理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 31(6), 732—736)

[ 9 ]Cao H., Sun Q., Li C., Li K. X., Li J.,Chem.J.ChineseUniversities, 2013, 34(8), 1873 —1879(曹紅, 孫倩, 李春, 李開雄, 李軍. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 34(8), 1873—1879)

[10]Cao H., Ye H., Li C., Zheng L. L., Li Y., Ouyang Q. F.,ProcessBiochem., 2014, 49(5), 791—796

[11]Chen J. Y., Liu G. Y., Huang S., Tong Y. B., Li C.,ChineseJournalofBioprocessEngineering, 2011, 9(5), 17—21(陳金燕, 劉桂艷, 黃申, 童延斌, 李春. 生物加工過程, 2011, 9(5), 17—21)

[12]Li Y., Cao H., Ouyang Q. F., Li C., Zheng L. L., Zhang X.,Chem.J.ChineseUniversities, 2014, 35(5), 1057—1062(李揚(yáng), 曹紅, 歐陽巧鳳, 李春, 鄭蘭蘭, 張馨. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2014, 35(5), 1057—1062)

[13]Luo J. M., Song Y., Wang J. F., Ning J., Cheng Y. X., Zheng Y., Shen Y. B.,Chemistry&Bioengineering, 2012, 29(5), 49—53(駱健美, 宋妍, 王建鋒, 寧靜, 成永新, 鄭宇, 申雁冰. 化學(xué)與生物工程, 2012, 29(5), 49—53)

[14]Ma G. L., Zhang X. J., Jin L.,ChinaBrewing, 2009, 207(6), 22—24(馬歌麗, 張學(xué)軍, 靳麗. 中國釀造, 2009, 207(6), 22—24)

[15]Wang X. P., Xing S. L.,TianjingChemicalIndustry, 2009, 23(3), 40—41(王孝平, 邢樹禮. 天津化工, 2009, 23(3), 40—41)

[16]Luan Y. S., Bao Y. M.,HandbookofBiochemicalExperimentTechniques, Chemical Industry Press, Beijing, 2005, 18—19(欒雨時(shí), 包永明. 生物工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè), 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005, 18—19)

[17]Chen J. Y., Zou S. P., He D. M., Yang X. G., Li C.,CIESCJournal, 2011, 62(11), 3136—3141(陳金燕, 鄒樹平, 何冬梅, 楊曉剛, 李春. 化工學(xué)報(bào), 2011, 62(11), 3136—3141)

[18]Zou S. P., Zhang Q., Li L. M., Guo Y. X., Dai D. Z., Li C.,CIESCJournal, 2009, 60(8), 2040—2045(鄒樹平, 張琦, 李麗敏, 郭燕霞, 戴大章, 李春. 化工學(xué)報(bào), 2009, 60(8), 2040—2045)

[19]Chen Z. G., Zong M. H., Gu Z. X.,Chin.J.Org.Chem., 2009, 29(5), 672—680(陳志剛, 宗敏華, 顧振新. 有機(jī)化學(xué), 2009, 29(5), 672—680)

[20]Xie S. L., Zheng S. X., He J. Y., Wang P., Wang R. Z.,JournalofZhejiangUniversityofTechnology, 2011, 39(5), 532—535, 540 (謝松霖, 鄭書香, 何軍邀, 王普, 王榮柱. 浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 39(5), 532—535, 540)

[21]Fang S., Chen Q. H., Liu X. J.,Eur.FoodRes.Technol., 2011, 233, 507—515

[22]Allen C. C. R., Boudet C. J., Hardacre C., Migaud M. E.,RSCAdv., 2014, 4, 19916—19924

(Ed.: P, H, S, K)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.21146012, 21266029).

Effect of the Ionic Liquids with Anion Tf2N-on the Whole Cell Catalytic Properties ofPenicilliumPurpurogenumLi-3 Strain?

Zhang Xin1, LI Yang1, CAO Hong2*, Ouyang Qiaofeng1,2, Zheng Lanlan1,4, LI Chun3

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China; 2.CollegeofBiological,ChemicalSciencesandEngineering,JiaxingUniversity,Jiaxing314001,China; 3.SchoolofLifeScienceandTechnology,BeijingInstituteofTechnology,Beijing100081,China; 4.CollegeofChemistryandEnvironmentalScience,KashiUniversity,Kashi844006,China)

PenicilliumpurpurogenumLi-3 cells properties of growth, metabolism, permeability of cell membrane and catalysis were studied in five ionic liquids composed with anion Tf2N-and five different ca-tions. The results showed that, the ionic liquids [Py14]Tf2N, [Bmim]Tf2N, [BPy]Tf2N and [P6,4,4,4]Tf2N had inhibitory effect on the growth ofpenicilliumpurpurogenumLi-3 while ionic liquid [N1,4,4,4]Tf2N had a promoting effect. Through metabolic activity determination of retention value(R) in ionic liquids, [P6,4,4,4]Tf2N and [N1,4,4,4]Tf2N showed relatively high biocompatibility to cells. At the same time, five ionic liquids on cell membrane permeability were improved effect. Whole-cell catalysis results displayed that [Py14]Tf2N was optimal ionic liquid. When the addition of [Py14]Tf2N was 25%, after 84 h, glycyrrhetinic acid monoglucuronide(GAMG) rate and glycyrrhizin acid(GL) conversion rate were as high as 95.38% and 99.84%. Therefore, the addition of [Py14]Tf2N, greatly promoted the formation of conversion and product. It showed that the effects of five kinds of ionic liquids on cells properties of growth and metabolism, cell membrane permeability and the whole cell catalytic activity were not only related to the anion Tf2N-, but also played an important role in the composition, structure and properties of the cations.

Tf2N-; Cation; Ionic liquid;PenicilliumpurpurogenumLi-3; Glycyrrhetinic acid monoglucuronide

10.7503/cjcu20160201

2016-03-31. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-09-23.

國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 21146012, 21266029)資助.

O643; Q556+.2

A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介: 曹紅, 女, 博士, 研究員, 主要從事生物催化與酶工程研究. E-mail: chyf_ch@126.com