吳天敏　陳金水　薛文娟

摘要：目的 研究中青年高血壓病不同證型患者及健康對照者血清代謝產(chǎn)物譜差異，尋找相關(guān)生物標(biāo)志物，揭示高血壓病痰濕壅盛證的證候本質(zhì)。方法 將34例高血壓病患者辨證分為肝火亢盛證14例、痰濕壅盛證14例、陰虛陽亢證6例，以15例健康志愿者為對照組，通過1H-NMR技術(shù)分析高血壓病3種證型患者及健康對照者的血液成分，使用PLS-DA方法進(jìn)行模式識別、尋找標(biāo)志物，同時采集尿酸（UA）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）數(shù)據(jù)。結(jié)果 高血壓病痰濕壅盛證UA水平最高，與其他組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；陰虛陽亢證TC水平最高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；痰濕壅盛證TG水平最高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）?；?H-NMR的代謝組學(xué)研究方法可以區(qū)分高血壓病痰濕壅盛組及對照組、肝火亢盛組、陰虛陽亢組。高血壓病痰濕壅盛組與對照組比較，丙酮、極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白含量增多，乳酸、絲氨酸、葡萄糖、蛋氨酸、丙氨酸含量減少；與肝火亢盛組比較，檸檬酸、丙氨酸、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白含量增多，葡萄糖、賴氨酸、谷氨酸、脯氨酸、乳酸含量減少；與陰虛陽亢組比較，肌酐含量增多。結(jié)論 中青年高血壓病痰濕壅盛證患者體內(nèi)存在脂蛋白代謝、氨基酸代謝和糖代謝異常。

關(guān)鍵詞：高血壓病；痰濕壅盛證；中青年；代謝組學(xué)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.006

中圖分類號：R259.441 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）10-0021-05

Abstract： Objective To analyze the serum samples of young and middle-aged patients with hypertension of different syndromes and healthy patients by means of metabonomics； To confirm its biomarker； To reveal the nature of phlegm dampness retention syndrome in essential hypertension. Methods The syndrome types of 34 hypertension patients were differentiated into 14 cases of liver-fire hyperactivity syndrome group， 14 cases of phlegm dampness retention syndrome group and 6 cases of yin deficiency and yang hyperactivity syndrome group. 15 healthy volunteers were selected as control group. 1H-NMR technique combined with partial least squares-discriminate analysis （PLS-DA） method was used to look for the biomarkers. And the levels of UA， TC and TG were recorded. Results The level of UA in phlegm dampness retention syndrome group was significantly higher than the other three groups （P<0.05）. The level of TC in yin deficiency and yang hyperactivity syndrome group was higher and had significantly difference with the control group （P<0.05）. The level of TG in phlegm dampness retention syndrome group was higher and had significantly difference with control group （P<0.05）. The metabonomics study based on the 1H-NMR method could distinguish the phlegm dampness retention syndrome group from the normal control group， liver-fire hyperactivity syndrome group and yin deficiency and yang hyperactivity syndrome group. Compared with the control group， the levels of acetone， VLDL， and LDL were significantly higher and the levels of lactate， serine， glucose， methionine， alanine were significantly lower in phlegm dampness retention syndrome group； compared with the liver-fire hyperactivity syndrome group， levels of citrate， alanine， VLDL， and LDL were significantly higher and the levels of glucose， lysine， glutamate， proline lactate were significantly lower； compared with yin deficiency and yanghyperactivity syndrome group， the level of creatinine was significantly higher. Conclusion There are lipoprotein metabolism， amino acid metabolism and glucose metabolism disorder in the young and middle-age hypertensive patients with phlegm dampness retention syndrome.

Key words： hypertension； phlegm dampness retention syndrome； young and middle-age adults； metabonomics

高血壓是多種心、腦血管疾病的重要原因和危險因素，是心血管疾病死亡的主要原因。世界衛(wèi)生組織在2010年的報告中指出，包括心血管疾病在內(nèi)的非傳染性疾病，目前已占全球總死亡人數(shù)的2/3[1]?！吨袊难懿蟾?013》指出，心血管病是中國居民的首位死亡原因，目前高血壓的知曉率和控制率并不理想[2]。中青年人因其體質(zhì)及生活方式的原因，發(fā)生高血壓時易表現(xiàn)為肝陽上亢證或痰濕壅盛證[3-4]。

代謝組學(xué)是通過考察生物體系受到外源性或內(nèi)源性的刺激或擾動后其代謝產(chǎn)物的變化情況來研究生物體系的一門學(xué)科[5]。近年來，隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的學(xué)者在高血壓病證型研究中采用了代謝組學(xué)的方法[6-8]，且在對高血壓病痰濕壅盛證患者血清代謝組學(xué)進(jìn)行的研究采用的均為液質(zhì)聯(lián)用或氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，1H-NMR較以上2種技術(shù)來說具有無損傷性、更接近生理?xiàng)l件[9]及操作簡單的優(yōu)勢。本研究運(yùn)用該技術(shù)對中青年高血壓病痰濕壅盛證患者、非痰濕壅盛證患者及健康志愿者血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析，為中醫(yī)防治高血壓提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2010年《中國高血壓防治指南》[10]。①受試者坐位安靜休息5 min后測量坐位時的上臂血壓。首診時測量雙上臂血壓，以后通常測量較高讀數(shù)一側(cè)的上臂血壓。②≥3次非同日、非藥物干預(yù)下安靜時收縮壓≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和/或舒張壓≥90 mm Hg。③排除繼發(fā)性高血壓。分級：收縮壓140～159 mm Hg和/或舒張壓90～99 mm Hg為1級，收縮壓160～179 mm Hg和/或舒張壓100～109 mm Hg為2級，收縮壓≥180 mm Hg和/或舒張壓≥110 mm Hg為3級。

1.1.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[11]中“中藥新藥治療高血壓病的臨床研究指導(dǎo)原則”，由2位以上具有主治醫(yī)師以上資格的醫(yī)師分別獨(dú)立判定主證型及次證型，取2位以上共同判定的結(jié)果。①痰濕壅盛證：主癥包括眩暈、頭痛、頭如裹、胸悶、嘔吐痰涎；次癥包括心悸、失眠、口淡、食少、舌胖苔膩、脈滑。②肝火亢盛證：主癥包括眩暈、頭痛、急躁易怒；次癥包括面紅、目赤、口干、口苦、便秘、溲赤、舌紅苔黃、脈弦數(shù)。③陰虛陽亢證：主癥包括眩暈、頭痛、腰酸、膝軟、五心煩熱；次癥包括心悸、失眠、耳鳴、健忘、舌紅少苔、脈弦細(xì)而數(shù)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合高血壓病西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡18～59歲；③1級和2級原發(fā)性高血壓，140 mm Hg<收縮壓<180 mm Hg且90 mm Hg<舒張壓<110 mm Hg；④未用藥或已服用降壓藥但經(jīng)2周洗脫期后血壓達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)；⑤簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①繼發(fā)性高血壓及嚴(yán)重心、腦、肝、腎、肺疾患者；②急慢性感染性疾病、糖尿病、惡性腫瘤、嚴(yán)重營養(yǎng)不良者；③合并精神病者及妊娠、哺乳期婦女。

1.4 一般資料

研究對象來源于2014年9月-2015年2月就診于福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的原發(fā)性高血壓患者及體檢的健康志愿者，共49例。肝火亢盛組14例，平均年齡（53.64±5.57）歲；痰濕壅盛組14例，平均年齡（49.00±8.20）歲；陰虛陽亢組6例，平均年齡（56.00±3.35）歲；對照組15例，平均年齡（47.07±9.22）歲。各組性別構(gòu)成比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

1.5 主要試劑與儀器

重水，美國MREDA科技有限公司；AVANCE Ⅲ 500MHz型超導(dǎo)傅立葉變換NMR譜儀，瑞士BRUKER公司。

1.6 血清樣品預(yù)處理

清晨取受試者空腹靜脈血（空腹12 h），黃頭促凝管促凝，靜置1 h后3000 r/min離心10 min，取上清液，置-80 ℃冰箱保存。預(yù)處理時常溫下解凍，取血清400 ?L加重水100 ?L及緩沖液（pH 7.4）100 ?L，12 000 r/min離心5 min后，取上清液500 ?L置于直徑5 mm的核磁管中，送至福州大學(xué)測試中心行NMR代謝圖譜檢測。同時采集尿酸（UA）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）數(shù)據(jù)。

1.7 NMR數(shù)據(jù)采集和處理

將1H NMR自由感應(yīng)衰減信號導(dǎo)入Chenomx NMR suit（version 8.0， Chenomx， Edmonton， Canada）軟件，自動進(jìn)行傅立葉轉(zhuǎn)換，調(diào)整相位，校正基線，血清以甲酸鹽峰（8.46 ppm）作為全部譜圖化學(xué)位移的標(biāo)準(zhǔn)。對0.1～10.0 ppm范圍內(nèi)的譜峰進(jìn)行分析，以0.04 ppm單位的化學(xué)位移為分段積分單元。為防止水的殘留峰干擾，血清樣本除去4.50～5.10 ppm（水峰）處的分段積分值。然后將所有積分值的面積進(jìn)行歸一化處理，導(dǎo)出到Excel表格，得到每個分段和對應(yīng)的積分面積值的矩陣。再將數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入SMICAP軟件中進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLS-DA）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

通過上述分析所獲得各樣本的主成分得分作圖可判別組間差異，進(jìn)一步用PLS-DA方法進(jìn)行主成分因子負(fù)荷矩陣分析、作變量散點(diǎn)圖，從圖中可發(fā)現(xiàn)具有區(qū)分2組間代謝差異的變量，即“差異代謝物”。此時獲得的僅為相關(guān)差異代謝物的化學(xué)位移，進(jìn)一步根據(jù)這些信息進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測，從而明確其化學(xué)結(jié)構(gòu)及名稱，并運(yùn)用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異代謝物的篩選。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

計量資料用—x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。代謝組學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SIMCAP11.5軟件進(jìn)行PLS-DA，并通過SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組生化指標(biāo)比較

痰濕壅盛組UA與其他3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），陰虛陽亢組TC與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。提示血脂異常以痰濕壅盛組和陰虛陽亢組為主，UA水平升高以痰濕壅盛組為主。

2.2 PLS-DA分析

得分圖上顯示的散點(diǎn)代表每個血清樣本的相對位置及相對關(guān)系，散點(diǎn)越靠近說明樣本差異越小，反之，距離越遠(yuǎn)，差異越大。荷載圖上每一個上的數(shù)值均代表其化學(xué)位移，離中心越遠(yuǎn)，提示其對區(qū)分樣本所做的貢獻(xiàn)越大，其重要程度可表現(xiàn)為VIP分值。VIP值>1表示“重要的”變量，VIP值<0.5表示“不重要的”變量。

圖1顯示，對照組（A組）位于PLS-DA得分圖的上方區(qū)域，痰濕壅盛組（C組）位于得分圖的下方區(qū)域，2組能較明顯地區(qū)分出來，可見痰濕壅盛組和對照組代謝輪廓存在明顯差異。

圖2顯示，肝火亢盛組（B組）樣本分布于PLS-DA得分圖的右上方區(qū)域，痰濕壅盛組（C組）樣本分布于得分圖的左下方，2組能較明顯地區(qū)分出來，提示痰濕壅盛組和對照組的代謝輪廓存在差異。但圖中C13混雜在B組中，且2組交界處有成分混雜，考慮2組的代謝情況有部分共性。

圖3顯示，陰虛陽亢組（D組）位于PLS-DA得分圖的上方區(qū)域，痰濕壅盛組（C組）位于得分圖的下方區(qū)域，2組能較明顯地區(qū)分出來，提示陰虛陽亢組和痰濕壅盛組的代謝輪廓存在差異。但圖中D1混雜在C組中，且2組交界處有少數(shù)成分混雜，考慮2組的代謝情況有部分共性。

2.3 差異代謝物

對VIP值>1的化學(xué)位移，運(yùn)用t檢驗(yàn)對其對應(yīng)的積分面積進(jìn)行統(tǒng)計分析，得出痰濕壅盛組和其他3組之間的差異性血清代謝物。其中“↓”表示痰濕壅盛組與其他3組相比，差異代謝物水平呈下降趨勢；“↑”表示痰濕壅盛組與其他3組相比，差異代謝物水平呈上升趨勢。結(jié)果見表3、表4。

對照組和痰濕壅盛組中有顯著差異的代謝物為：乳酸、絲氨酸、葡萄糖、丙酮、蛋氨酸、丙氨酸、極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白。其中痰濕壅盛組的丙酮、極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平較對照組升高，乳酸、絲氨酸、葡萄糖、蛋氨酸、丙氨酸水平較對照組下降。

肝火亢盛組和痰濕壅盛組中有顯著差異的代謝物為：葡萄糖、賴氨酸、檸檬酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、乳酸、極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白。其中痰濕壅盛組的檸檬酸、丙氨酸、極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平較肝火亢盛組升高，葡萄糖、賴氨酸、谷氨酸、脯氨酸、乳酸水平較肝火亢盛組下降。

陰虛陽亢組和痰濕壅盛組中有顯著差異的代謝物為肌酐，其水平在痰濕壅盛組中高于陰虛陽亢組。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，對照組和痰濕壅盛組血清代謝物存在顯著差異，分別為乳酸、絲氨酸、葡萄糖、丙酮、蛋氨酸、丙氨酸、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白；肝火亢盛組和痰濕壅盛組中存在顯著差異的代謝物有葡萄糖、賴氨酸、檸檬酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、乳酸、極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白；痰濕壅盛組中肌酐水平高于陰虛陽亢組。上述代謝物中低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白參與了脂蛋白代謝，葡萄糖、乳酸、丙酮、檸檬酸參與了糖代謝，蛋氨酸、丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸參與了氨基酸代謝，痰濕壅盛組上述物質(zhì)與對照組及肝火亢盛組相比具有顯著差異，提示痰濕壅盛組患者體內(nèi)出現(xiàn)了脂蛋白、糖、氨基酸三大代謝的異常。

研究表明，高脂飲食可引起模型動物血清/血漿中能量代謝以及氨基酸代謝的異常。如Zha等[12]運(yùn)用氣相色譜飛行時間-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對高膽固醇飲食倉鼠的代謝情況進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)食用高膽固醇飼料的倉鼠血漿中脂肪酸、碳水化合物以及氨基酸的水平發(fā)生顯著變化，并且飼料中膽固醇含量越高，這些代謝物與對照組的差異越大，尤以氨基酸的差異更為顯著。Shearer等[13]運(yùn)用核磁共振技術(shù)進(jìn)行相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食會導(dǎo)致小鼠血清中各種氨基酸，如賴氨酸、甘氨酸、亮氨酸以及能量代謝中間產(chǎn)物檸檬酸鹽等小分子代謝物的代謝水平發(fā)生了顯著變化。結(jié)合以上研究成果推測，痰濕壅盛組血脂水平較肝火亢盛者高，飲食構(gòu)成中高脂成分較對照組和肝火亢盛組多，考慮高脂飲食進(jìn)一步加重了痰濕壅盛證患者體內(nèi)的氨基酸代謝紊亂，使其出現(xiàn)了脂蛋白代謝、糖代謝和氨基酸代謝的異常。張氏[14]研究發(fā)現(xiàn)，血清?；撬帷⒑虬被峥偤停ǖ鞍彼??；撬?胱硫醚）、賴氨酸、絲氨酸、胱氨酸、1-甲基組氨酸和門冬酰胺等和血壓顯著負(fù)關(guān)聯(lián)。Lovenberg[15]通過相關(guān)研究提出含硫氨基酸可使高血壓大鼠血壓降低而預(yù)防腦卒中。本研究中高血壓病痰濕壅盛證患者的血清絲氨酸、蛋氨酸含量均較對照組降低，與上述研究結(jié)果一致。同型半胱氨酸（HCY）為蛋氨酸代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，目前認(rèn)為高HCY血癥是心血管疾病的獨(dú)立危險因素，高血壓病痰濕壅盛證患者血清中蛋氨酸含量降低，不排除其消耗增多致使半胱氨酸產(chǎn)生增多，進(jìn)而可能引起高血壓的發(fā)生。痰濕壅盛證患者與肝火亢盛證患者血清代謝物相比，賴氨酸、谷氨酸、脯氨酸含量均降低。賴氨酸屬于生酮氨基酸，是人體必需氨基酸之一，其可降低血中TG水平，預(yù)防心腦血管疾病，其在痰濕壅盛證患者中含量減少，可能是痰濕壅盛之人TG水平升高的原因之一。

本研究顯示肌酐水平在痰濕壅盛組中高于陰虛陽亢組。外源性肌酐是肉類食物在體內(nèi)代謝后的產(chǎn)物，內(nèi)源性肌酐是體內(nèi)肌肉組織代謝的產(chǎn)物，其排泄主要通過腎臟。痰濕壅盛證患者的UA水平較其他3組明顯升高，考慮UA升高影響了腎臟的排泄功能，且痰濕壅盛證患者多食肉類食物，外源性肌酐攝入增多。肌酐來源增多、去路減少，因此痰濕壅盛證患者的肌酐水平較陰虛陽亢證患者升高。根據(jù)本研究的生化指標(biāo)統(tǒng)計分析結(jié)果，可見痰濕壅盛證患者和陰虛陽亢證患者的血脂水平均較對照組和肝火亢盛組高，考慮不同原因引起的血脂增高情況均引起了氨基酸代謝和糖代謝紊亂的情況；由于兩證型組患者體內(nèi)氨基酸代謝和糖代謝紊亂情況相當(dāng)，所以，兩證型組的血清代謝物分析中未發(fā)現(xiàn)游離氨基酸、血糖、乳酸、丙氨酸、檸檬酸、脂蛋白等氨基酸代謝、糖代謝及脂蛋白代謝相關(guān)物質(zhì)的含量存在明顯差異。

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（收稿日期：2015-10-15）

（修回日期：2016-01-28；編輯：陳靜）