潘志恒，岳　鹍，孫勇民，劉　鵬

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學院，天津 300350）

樹舌靈芝發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基優(yōu)化

潘志恒，岳鹍*，孫勇民，劉鵬

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學院，天津 300350）

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計對影響樹舌靈芝產(chǎn)漆酶活性的因素進行了評價，篩選出具有顯著影響的因素并優(yōu)化了樹舌靈芝產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基的主要成分。結(jié)果表明，產(chǎn)酶培養(yǎng)基中小麥麩皮、豆粕、硫酸銅和香蘭素的添加量對樹舌靈芝產(chǎn)漆酶活性具有顯著影響；預(yù)測得到最佳培養(yǎng)基組成為：小麥麩皮（20 g/L）、豆粕（2 g/L），硫酸銅（0.625 g/L）和香蘭素（0.037 5 g/L）；優(yōu)化培養(yǎng)基后漆酶活性達到45.85 IU/mL，約為優(yōu)化前的56倍，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)漆酶提供技術(shù)支持。

漆酶；樹舌靈芝；Plackett-Burman設(shè)計；發(fā)酵

漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）是一種含有4個Cu2+的多酚氧化酶，學名對二酚-二氧氧化還原酶，屬于氧化酶的藍銅家族。這類酶最初發(fā)現(xiàn)于漆樹的樹脂中，由此得名漆酶。漆酶在自然界中廣泛存在，在植物體及幾乎所有的真菌中都發(fā)現(xiàn)了漆酶或其類似物［1］。不同漆酶的作用范圍不盡相同，初步統(tǒng)計漆酶可催化的不同類型底物已達約250個。隨著漆酶催化性能研究的不斷深入，國內(nèi)外漆酶應(yīng)用范圍也在不斷擴大，涉及造紙、環(huán)保、食品、醫(yī)藥、紡織等各個領(lǐng)域［2］。

發(fā)酵培養(yǎng)真菌生產(chǎn)漆酶的周期普遍較長，一般需要20 d左右。目前國內(nèi)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的漆酶菌株較少，而且穩(wěn)定性差，漆酶發(fā)酵水平低，因此，漆酶主要依靠進口，嚴重限制了漆酶工業(yè)酶制劑的制備和應(yīng)用。本研究在通過基因工程與傳統(tǒng)誘變方法相結(jié)合改造獲得樹舌靈芝（Ganoderma applanatum）菌株的基礎(chǔ)上，采用小麥麩皮、豆粕和余量水等組成發(fā)酵培養(yǎng)基，對漆酶液體發(fā)酵工藝中關(guān)鍵因子進行優(yōu)化，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)漆酶提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

1.1.1材料與試劑

樹舌靈芝（Ganoderma applanatum），由天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學院生物工程學院選育并保藏。

葡萄糖、瓊脂粉、酵母浸膏、硫酸鎂、硫酸銨、磷酸一氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉等，均為國產(chǎn)分析純。

ABTS試劑盒，由碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)。

1.1.2儀器與設(shè)備

HCB-900V型超凈工作臺，HPX-9162MBE型恒溫培養(yǎng)振蕩器，GZX-9146MBE電熱鼓風干燥箱，YXQ-LS50SII壓力蒸汽滅菌器，F(xiàn)A2004N型電子天平，UV-1800PC-DS紫外可見分光光度計。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基的制備

PDA培養(yǎng)基：土豆粉200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000mL。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母浸膏2 g，蒸餾水1 000mL。

基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸銨2g，Na2HPO40.2g，KH2PO41g，蒸餾水1000mL。

培養(yǎng)基的滅菌條件為：120℃、30min。

1.2.2平面菌種培養(yǎng)

在無菌條件下，將樹舌靈芝菌株接種到平面PDA培養(yǎng)基上，25℃避光培養(yǎng)8 d。

1.2.3液體發(fā)酵條件

250mL搖瓶中放入100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在無菌條件下接入“1.2.2”中直徑1 cm左右的菌絲體4塊，置于25℃恒溫培養(yǎng)振蕩器、150 r/min避光培養(yǎng)10 d，抽濾分離發(fā)酵液，取濾液測定酶活性，將濾紙于70℃下烘干至恒重，稱重，減去濾紙質(zhì)量，得到菌體的干重（以g/L表示），即得到樹舌靈芝菌種的生物生長量。

1.2.4產(chǎn)酶培養(yǎng)

250mL三角瓶中接種樹舌靈芝菌株，接種量為15%，在25℃、150 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)10 d。

1.2.5漆酶活性的測定

以ABTS為底物，采用分光光度計測定［3-4］。3mL酶活反應(yīng)體系中包括1mL漆酶濾液3倍稀釋液、0.2mL 3mmol/L的ABTS和1.8mL 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=4.5），25℃水浴保溫反應(yīng)5min，于420 nm處測定吸光度。對照液為已滅活的酶液。1個漆酶單位（IU）為1min轉(zhuǎn)化1μmolABTS的所需酶量。

1.2.6產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.6.1單因素試驗

（1）碳源對漆酶活性的影響

分別以不同的碳源（小麥麩皮、玉米粉、蔗糖、麥芽糖、淀粉，均為20 g/L）代替基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的葡萄糖進行考察。

（2）氮源對漆酶活性的影響

碳源采用小麥麩皮，分別以不同氮源（豆粕、蛋白胨、硝酸銨、磷酸二氫銨，均為2 g/L）代替基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的硫酸銨，考察影響酶活性的不同氮源。

（3）金屬離子對漆酶活性的影響

碳源和氮源分別采用小麥麩皮和豆粕，分別用不同的金屬離子（硫酸鋅、碳酸鈣、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸銅，均為0.5 g/L）代替基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的硫酸鎂，考察影響酶活性的不同金屬離子。

（4）誘導(dǎo)劑對漆酶活性的影響

碳源、氮源和金屬離子分別采用小麥麩皮、豆粕和硫酸銅，分別添加不同誘導(dǎo)劑（沒食子酸、香蘭素、阿魏酸、鄰甲苯胺，均為0.03 g/L），以未加誘導(dǎo)劑的處理作為對照，篩選出最佳的產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑。

按“1.2.4”中的方法培養(yǎng)7 d，平行試驗3次，以漆酶活性為響應(yīng)值，結(jié)果取平均值。

1.2.6.2Plackett-Burman試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇影響漆酶活性的6個因素進行考察，每個因素取高（1）、低（-1）兩個水平，按試驗方法“1.2.4”進行培養(yǎng)，以漆酶活性為響應(yīng)值，試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，選用N=12的Plackett-Burman設(shè)計，為考察試驗誤差設(shè)3個虛擬變量，試驗設(shè)計如表1所示。

表1　Plackett-Burman試驗設(shè)計因素水平表Table 1　Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.7數(shù)據(jù)處理

采用MINITAB 16.0分析軟件進行處理。

2　結(jié)果與分析

2.1基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中漆酶的活性和樹舌靈芝的生物生長量

由圖1可見，在10 d的培養(yǎng)過程中，前7天樹舌靈芝所產(chǎn)漆酶活性呈逐漸升高的趨勢，第7天達到最高，為0.82 IU/mL，之后漆酶活性下降。培養(yǎng)前期，樹舌靈芝的生物生長量保持增加，在第7天達到最大值，菌體的干重為0.18 g/L；培養(yǎng)8～10 d，樹舌靈芝的生物生長量呈下降趨勢。由此可見，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)樹舌靈芝產(chǎn)漆酶，樹舌靈芝的生物生長量及漆酶的活性都很低。

2.2單因素試驗結(jié)果

2.2.1碳源對漆酶活性的影響

由圖2可見，在不同碳源的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，漆酶活性大小的順序為：小麥麩皮＞玉米粉＞淀粉＞麥芽糖＞蔗糖，即以小麥麩皮為碳源時，漆酶的活性最高，而以蔗糖和麥芽糖為碳源時，漆酶活性較低，其原因可能是因為簡單碳源在發(fā)酵過程中消耗較快，碳源濃度難以維持高水平。

2.2.2氮源對漆酶活性的影響

由圖3可見，豆粕是最佳的氮源，能明顯提高漆酶活性，對碳源和氮源優(yōu)化后，漆酶活性較優(yōu)化前提高了約13倍。其次為蛋白胨，相比而言，硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨等小分子無機氮源利用率比較差。這可能是由于不同菌種對氮源喜好不同，相關(guān)研究也表明，側(cè)耳Pleurotus ostreatus很難利用酵母抽提物（YE）作為氮源［6］，真菌Panus tigrinus對酒石酸銨利用效率很高［7］，真菌Cerrena unicolor產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基則使用玉米漿［8］。

2.2.3金屬離子對漆酶活性的影響

由圖4可見，Cu2+可明顯提高樹舌靈芝所產(chǎn)漆酶的活性，Ca2+、Mg2+和Fe2+的誘導(dǎo)作用次之，而Zn2+對樹舌靈芝所產(chǎn)漆酶有明顯的抑制作用。漆酶是一種含Cu2+的藍色多酚氧化酶，其活性與Cu2+有著密切的關(guān)系，歐陽翔等［9］研究表明，Cu2+能夠促進漆酶基因的高效表達。

2.2.4誘導(dǎo)劑對漆酶活性的影響

對漆酶進行誘導(dǎo)是提高漆酶產(chǎn)量常用的方法，芳香族化合物鄰甲苯胺、香蘭素、沒食子酸和阿魏酸常被用作漆酶的誘導(dǎo)劑［10-11］。由圖5可見，這些誘導(dǎo)劑均能不同程度地提高樹舌靈芝產(chǎn)漆酶的活性，其中香蘭素誘導(dǎo)的效果最好，漆酶活性最高，其次分別為沒食子酸、鄰甲苯胺和阿魏酸。

2.3Plackett-Burman試驗設(shè)計處理及響應(yīng)值

試驗設(shè)計及漆酶活性的響應(yīng)值見表2。

表2　Plackett-Burman設(shè)計方案及響應(yīng)值Table 2　Design and result of Plackett-Burman test

2.4漆酶活性主要影響因子的篩選

采用MINITAB 16.0分析軟件對Plackett-Burman試驗結(jié)果進行分析，擬合得到的模型方程為：

Y=39.457+0.190X1-0.602X2-0.443X3-1.995X4-1.868X5-0.095X6+1.203X7+1.298X8-0.412 X9

由表3可知，調(diào)整后回歸方程的誤差系數(shù)R2adj為0.956 6，說明試驗中95.66%的數(shù)據(jù)可由此模型解釋，F(xiàn)檢驗（P=0.035）說明回歸方程具有顯著的統(tǒng)計學意義。

表3　回歸模型的方差分析Table 3　Variance analysis of regressionmodel

由表4偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗可知，影響樹舌靈芝產(chǎn)漆酶活性的主要影響因子為：X4小麥麩皮（P=0.029）、X5豆粕（P=0.025）、X7硫酸銅（P=0.034）和X8香蘭素（P=0.029）（95%置信區(qū)間）。

表4　偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗Table 4　Partial regression coefficients and their significance

2.5樹舌靈芝產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基最佳配方的確定

通過回歸模型預(yù)測樹舌靈芝產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基的最佳配方為：小麥麩皮（20 g/L）、豆粕（2 g/L）、硫酸銅（0.625 g/L）、香蘭素（0.037 5 g/L），該條件下，漆酶活性理論上可達46.61 IU/mL。由圖6可見，實際操作中，通過優(yōu)化培養(yǎng)基的培養(yǎng)，到第7天，漆酶活性達到最高，為45.85 IU/mL，為優(yōu)化前的約56倍；同時，第7天時生物生長量達到最高，為3.12g/L，約為優(yōu)化前的17倍。

3　結(jié)論

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗設(shè)計對影響樹舌靈芝產(chǎn)漆酶活性的因素進行了評價，優(yōu)化了樹舌靈芝產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基的主要成分。結(jié)果表明，產(chǎn)酶培養(yǎng)基中小麥麩皮、豆粕、硫酸銅和香蘭素的添加量對樹舌靈芝產(chǎn)漆酶活性具有顯著影響（P＜0.05）；通過回歸方程預(yù)測得到最佳培養(yǎng)基組成為：小麥麩皮（20 g/L）、豆粕（2 g/L）、硫酸銅（0.625 g/L）和香蘭素（0.037 5 g/L）；優(yōu)化培養(yǎng)基后，漆酶活性達到45.85 IU/mL，比優(yōu)化前有大幅提高。

［1］劉家揚，焦國寶，有小娟，等.真菌漆酶的性質(zhì)、生產(chǎn)及應(yīng)用研究進展［J］.生物技術(shù)通報，2016，32（4）：24-33.

［2］靳蓉，張飛龍.漆酶的應(yīng)用技術(shù)［J］.中國生漆，2013，32（2）：35-42，50.

［3］何為，詹懷宇，王習文.一種改進的漆酶酶活檢測方法［J］.華南理工大學學報（自然科學版），2003，31（12）：46-49.

［4］侯紅漫，周集體，王競，等.白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶對蒽醌染料SN4R脫色研究［J］.大連理工大學學報，2004，44（5）：640-645.

［5］汪彬彬，車振明.Plackett-Burman和Box-Benhnken Design實驗設(shè)計法優(yōu)化華根霉產(chǎn)糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基的研究［J］.食品科技，2011（5）：41-45.

［6］LIU L，LIN Z，ZHENGT，etal.Fermentation optimization and characterization of thelaccase from Pleurotus ostreatus strain 10969［J］.Enzyme and Microbial Technology，2009，44（6-7）：426-433.

［7］QUARATINO D，CIAFFIM，F(xiàn)EDERICIE，et al.Response surfacemethodologystudyoflaccaseproductionin Panustigrinus liquid cultures［J］.Biochemical Engineering Journal，2008，39：236-245.

［8］JANUSZ G，ROGALSKI J，SZCZODRAK J.Increased production of laccase by Cerrena unicolor in submerged liquid cultures［J］.World Journal ofMicrobiology and Biotechnology，2007，23（10）：1459-1464.

［9］歐陽翔，吳婧，丁一新，等.靈芝漆酶基因轉(zhuǎn)錄Cu2+誘導(dǎo)特性及其啟動子的克隆與序列分析［J］.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2009，32（1）：36-40.

［10］許穎.靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶研究［D］.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學，2006.

［11］黃乾明.漆酶高產(chǎn)菌株的誘變選育及其酶的分離純化、性質(zhì)和基因克隆研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2006.

Optim ization of CultureM edium for Laccase Production from Ganoderma applanatum

PAN Zhi-heng，YUE Kun*，SUN Yong-min，LIU Peng
（Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China）

On the basis of single factor experiment，the Plackett-Burman experimental design was applied to evaluate the factors that potentially influence the laccase activity of Ganoderma applanatum.The most important factors were selected to optimize the culture medium.Results showed that，different levels of wheat bran，soybean meal，copper sulphate and vanillin could significantly influence the laccase activity.The most optimized culture medium included wheat bran（20 g/L），soybean meal（2 g/L），copper sulphate（0.625 g/L）and vanillin（0.037 5 g/L）. Laccase activity increased up to 45.85 IU/mL，which was approximate 56 times before the optimization.This study provided the technical support for large scale fermentation of laccase.

laccase；Ganoderma applanatum；Plackett-Burman design；fermentation

Q939.97

A

10.3969/j.issn.1009－6221.2016.04.019

天津市技術(shù)開發(fā)工作扶持經(jīng)費項目（ysk2011-29）

潘志恒（1984—），男，漢族，碩士，講師，主要從事生物發(fā)酵、檢測分析等方面的研究工作。

岳鹍，碩士，副教授，主要從事食品發(fā)酵等方面的研究工作。

2016-03-21