鄭健斌,張劍琿,陶建平,司徒勛,黃莉

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心(廣州， 519000)

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干擾素誘導跨膜蛋白3基因多態(tài)性與小兒流感嚴重程度相關性研究

鄭健斌,張劍琿,陶建平,司徒勛,黃莉

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心(廣州， 519000)

目的分析輕癥和重癥流感患兒干擾素誘導跨膜蛋白3基因(IFITM3)rs12252T/C基因多態(tài)性的分布特點， 探討其基因多態(tài)性與小兒流感嚴重程度的相關性。方法選擇符合流感診斷標準的患兒60例， 其中重癥流感患兒和輕癥流感患兒各30例， 通過從患兒外周血提取DNA擴增相應的目的片段并測序， 檢測IFITM3基因rs12252單核苷酸多態(tài)性分布情況， 統(tǒng)計學分析小兒流感遺傳易感性、 嚴重程度相關的基因型和等位基因。結(jié)果IFITM3基因rs12252 CC基因型在重癥組患兒中占70.00%而在輕癥組僅占26.67%； 在隱形遺傳模型中， CC純合子比TT純合子和CT雜合子有6倍大的風險患重癥流感(OR=6.42， 95%CI為2.08～19.76)。結(jié)論IFITM3基因rs12252T/C基因多態(tài)性對中國人群流感的流行病學具有重要影響， CC基因型可能與兒童流感的嚴重程度相關。

小兒流感； IFITM3； rs12252T/C； 中國人群

干擾素誘導跨膜蛋白3基因(Interferon induced transmembrane protein 3 gene, IFITM3)因具有較強的抗病毒感染作用而被研究人員發(fā)現(xiàn)。最初關于IFITM3的抗病毒感染作用是在《Cell》雜志上首次刊登的， 報道稱其在宿主抵御A型流感H1N1病毒、 西尼羅河病毒和登革熱病毒中發(fā)揮重要作用[1]。在2012年Everitt 等發(fā)現(xiàn)IFITM3 rs12252C等位基因的患者更容易患上重癥流感， 然而， Mills 等[2]的研究卻得出相反的結(jié)論， CC純合子基因型患者更容易患上輕癥而非重癥流感。因此， 盡管經(jīng)過了4年的研究， 關于rs12252T/C基因多態(tài)性與流感嚴重程度相關性尚無得出一致的結(jié)論， 本文主要選取小兒作為研究對象， 為此方面研究補充兒童流感方面的研究數(shù)據(jù)， 現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇我院2014年10月至2016年3月流感患兒60例， 其中重癥流感患兒和輕癥流感患兒各30例， 重癥流感和流感的診斷均參照《(流行性感冒診斷與治療指南》(2011 年版)[3]為準。所有患者均為居住在廣東1年以上的漢族小兒(年齡<14歲)， 家屬同意參與本研究且簽署知情同意書。兩組患者的臨床和實驗室一般資料如表1所示， 在性別、 年齡、 流感類型的比較上， 兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)， 具有可比性。

1.2研究方法

1.2.1血液采集全部患兒均采集空腹外周血2 mL， 血樣由枸櫞酸抗凝管(或EDTA)收集， -70 ℃保存。

1.2.2引物設計及合成采用Sequenom Assay Design 3.1軟件設計PCR擴增及延伸引物。上游及下游引物分別為5-GGAAACTGTTGAGAAACCGAA-3和5- CATACGCACCTTCACGGAGT-3， 引物由上海英駿生物公司(Invitrogen)合成。

1.2.3DNA提取及PCR擴增從采集的抗凝全血中提取DNA， 并對每個樣品進行質(zhì)檢， 要求DNA的濃度不低于 10 ng/μL， 純度在OD 1.7～2.1之間， DNA提取試劑盒和PCR擴增試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司， PCR反應體系及擴增條件參考試劑盒說明書進行操作。

1.2.4SNP實驗對PCR產(chǎn)物進行純化后使用Applied Biosystems 3730XL DNA分析儀進行測序， 單核苷酸多態(tài)性鑒定使用華大基因的Chromas軟件進行分析。

1.3統(tǒng)計學方法

對 IFITM3 基因的單核苷酸多態(tài)性結(jié)果及相關臨床資料用 SPSS20.0 進行統(tǒng)計學分析。等位基因和基因型頻率的分布差異比較采用X2檢驗； 結(jié)合不同的遺傳模型(顯性/隱性模型， 共顯性模型)進行分析， 找到符合該位點的遺傳方式， 計算不同基因型在疾病發(fā)病中相應的風險值(OR 值及95% CI)和P值， 所有檢驗均為雙側(cè)概率檢驗， 檢驗水準為a=0.05。

2　結(jié)果

(1) 重癥組與輕癥組患者臨床和實驗室特征比較輕癥組患者均無出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥， 重癥組患者有29例出現(xiàn)胸片雙肺滲出或浸潤影， 16例出現(xiàn)呼吸衰竭， 9例出現(xiàn)急性呼吸窘迫整合癥， 2例出現(xiàn)播散性血管內(nèi)凝血和1例出現(xiàn)腎功能衰竭； 在實驗室檢查指標方面， 重癥組的白細胞總數(shù)、 中性細胞比率、 中性粒細胞絕對計數(shù)明顯高于輕癥組， 淋巴細胞比率、 淋巴粒細胞絕對計數(shù)明顯低于輕癥組(P<0.05)。輕癥組低血鉀和谷丙轉(zhuǎn)氨酶>40 IU/L發(fā)病率明顯低于重癥組， 且住院天數(shù)明顯較低。

表1　重癥流感組和輕癥流感組患者臨床和實驗室一般資料比較

表2　各組IFITM3基因rs12252T/C各基因型及等位基因頻率比較

(3) 輕癥組與重癥組IFITM3 基因SNP rs12252遺傳模式分析：除了顯性遺傳模型， 隱性遺傳模型和共顯性遺傳模型都顯示與嚴重感染有顯著性關聯(lián)， 其中隱形遺傳模型具有最大的比值比(相對危險度)。在隱形遺傳模型中， CC純合子比TT純合子和CT雜合子有6倍大的風險患重癥流感(OR=6.42， 95%CI為2.08～19.76)。

表3　輕癥組與重癥組IFITM3 基因SNP rs12252遺傳模式分析

3　討論

我們的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示輕癥組患者IFITM3基因rs12252T/C基因型和等位基因頻率與漢族人群相比， 結(jié)果無顯著性差異， 然而重癥組與漢族人群相比差異有統(tǒng)計學意義。此外， 漢族人群與病例組比較， 重癥組與輕癥組比較， 兩組的基因型比例、 等位基因頻率比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。等位基因風險值的統(tǒng)計結(jié)果表明， 攜帶C等位基因有更大的風險患重癥流感。另一方面， CC基因型在重癥流感患者中占的比例高達70%， 而在輕癥組和正常人群組僅占26.67%和25.38%， 提示CC基因型可能是兒童流感的嚴重性相關因子。具體的統(tǒng)計數(shù)字與相關文獻不太一致， 但是都得出了相同的結(jié)論[3-7]。

在IFITM3 基因SNP rs12252遺傳模式分析方面， XUAN Y等[4]綜合檢索EMBASE、 PubMed、 Web of Science、 維普、 萬方、 CNKI數(shù)據(jù)庫截止至2014年8月關于IFITM3 基因rs12252基因多態(tài)性與小兒流感易感性及嚴重性的文獻， 進行了一項包含445流感患者和3396健康對照者的薈萃分析， 得出IFITM3 基因rs12252T/C多態(tài)性是與患者感染重癥流感相關， 而不是與患者最初感染的易感性相關的結(jié)論， 且其基因多態(tài)性與流感的風險為CvsT:OR=1.68， 95%CI為1.32～2.13; CC vs.CT+TT: OR=2.38， 95% CI為1.52～3.73； CC+CT vs.TT:OR=1.62， 95%CI為1.18～2.22。這與Yang X等[5]團隊對445流感患者和4 180健康對照者作的薈萃分析的結(jié)果Cvs.T: OR=1.67, 95% CI: 1.32～2.13； CC vs. CT+TT: OR=2.35， 95% CI: 1.49～3.70； CC+CT vs. TT: OR=1.60， 95%CI:1.18～2.22幾乎一致。然而， 本組研究對象的統(tǒng)計結(jié)果顯示：除了顯性遺傳模型， 隱性遺傳模型和共顯性遺傳模型都顯示與嚴重感染有顯著性關聯(lián)。隱形遺傳模型具有最大的相對危險度， 在隱形遺傳模型中， CC純合子比TT純合子和CT雜合子有6倍大的風險患重癥流感(OR=6.42， 95%CI為2.08～19.76)。這與上述研究得出的結(jié)論存在一定差異， 考慮主要有以下幾點原因：由于人種及地域之間的遺傳差異， 本文選取的是中國廣東地區(qū)的漢族人群， 與其他研究的人群不同； 此外， 本組病例數(shù)較少而且病例組入組標準可能會造成選擇偏倚； 此外， 本文得到的是重癥組與輕癥組的比較數(shù)據(jù)， 與病例組和正常對照組的統(tǒng)計結(jié)果存在一定差異也屬正?，F(xiàn)象， 而且本文得出的數(shù)據(jù)與關于中國漢族人群的統(tǒng)計分析結(jié)果具有一致性[3]。

確定IFITM3 基因rs12252T/C多態(tài)性位點作為篩查重癥流感高危人群檢測指標具有重要意義， 有助于早期發(fā)現(xiàn)流感重癥易患人群， 若采取早期預防、 干預措施， 將能有效降低重癥流感發(fā)生率， 提高治愈率。但是目前關于中國漢族人群有關此基因位點的流感病例對照研究在國內(nèi)尚少， 關于小兒的統(tǒng)計數(shù)據(jù)更缺乏， 因此， 我們迫切需要進行跨地區(qū)、 多中心、 大樣本量的前瞻性研究來進行進一步評估。

[1] 周勇，鄔林泉. 干擾素誘導跨膜蛋白 3 在人類惡性腫瘤中作用的研究進展[J]. 廣東醫(yī)學，2015,36(9):1459-1461.

[2] Mills TC, Rautanen A, Elliott KS, et al. IFITM3 and susceptibility to respiratory viral infections in the community[J]. J Infect Dis， 2014,209(7):1028-1031.

[3] Zhang YH, Zhao Y, Li N,et al. Interferon-induced transmembrane protein-3 genetic variant rs12252-C is associated with severe influenza in Chinese individuals[J]. Nat Commun， 2013,(4):1418.

[4] Xuan Y, Wang LN, Li W,et al. IFITM3 rs12252 T>C polymorphism is associated with the risk of severe influenza: a meta-analysis[J]. Epidemiol Infect， 2015,143(14):2975-2984.

[5] Yang X, Tan B, Zhou X, et al. Interferon-Inducible Transmembrane Protein 3 Genetic Variant rs12252 and Influenza Susceptibility and Severity: A Meta-Analysis[J]. PLoS One， 2015,10(5): e0124985.

[6] Williams DE, Wu WL, Grotefend CR,et al. IFITM3 polymorphism rs12252-C restricts influenza A viruses[J]. PLoS One， 2014,9(10):e110096.

[7] Everitt AR, Clare S, Pertel T，et al. IFITM3 restricts the morbidity and mortality associated with influenza[J].Nature, 2012,484(7395): 519-523.

Association of Interferon Inducible Transmembrane Protein 3 Gene Polymorphism with the Severity of Influenza in Children

ZHENG Jianbin, ZHANG Jianhui, TAO Jianping, SITU Xun, HUANG Li

Guangzhou Women and Children Medical Center(Guangzhou,510623)

ObjectiveTo analyze the distribution characteristics of IFITM3 gene rs12252T/C in children suffered from mild or severe influenza and explore the relationship between gene polymorphism and the severity of influenza.Methods60 cases of children suffered from influenza diagnostic criteria were selected, including 30 cases of severe influenza and 30 with mild. IFITM3 gene rs12252 single nucleotide polymorphism was detected by DNA extracted from peripheral blood and sequenced, and the genotype and allele associated with genetic susceptibility and severity in children with influenza were analyzed statistically.ResultsIFITM3 gene rs12252 CC genotype in the intensive group accounted for 70% while in the mild group accounted for only 26.67%. In the recessive genetic model, the CC genotype was estimated to confer six times greater risk for severe infection than the CT and TT genotypes(OR=6.42，95%CI: 2.08～19.76).ConclusionThe polymorphism of rs12252T/C in IFITM3 gene has an important influence on the epidemiology of influenza in Chinese population. CC genotype may be associated with the severity of childhood influenza.

children with influenza， IFITM3， Rs12252T/C， Chinese population

10.3969/j.issn.1674-1242.2016.02.002

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導項目(20141A011035)

鄭健斌，E-mail:zjb18927@163.com

R725.6

A

1674-1242(2016)02-0066-04

2016-04-06)