張亞武，權(quán)柯

1蘭州大學(xué)第二醫(yī)院膽胰外科，甘肅蘭州730000；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

芍藥苷對HepG2肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

張亞武1，權(quán)柯2

1蘭州大學(xué)第二醫(yī)院膽胰外科，甘肅蘭州730000；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

目的：探討芍藥苷（Paeoni florin）對H epG 2肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，并考察其作用機(jī)制。方法：用不同濃度芍藥苷（0.5，2 m g/m L）對HepG 2肝癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用MTT法檢測細(xì)胞活力，酶標(biāo)法檢測Caspase 3活性，western blot法檢測N F-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果：隨著給藥濃度的增加，芍藥苷能逐漸降低H epG 2肝癌細(xì)胞活力，在48小時(shí)抑制率最高；并能提高Caspase 3活性，抑制細(xì)胞核內(nèi)N F-κB p65磷酸化，IκBα磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。結(jié)論：芍藥苷可能通過N F-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)H epG 2肝癌細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤效果。

HepG 2肝癌細(xì)胞；凋亡；NF-κB信號(hào)通路；磷酸化；芍藥苷

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，目前其主要治療手段為手術(shù)，但術(shù)后易復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移率較高。因此，尋求有效治療肝癌，降低復(fù)發(fā)率的藥物成為研究熱點(diǎn)。

芍藥苷（Paeonif1orin，PF）是從毛茛科植物芍藥（Paeonia Lactiflora Pa11）中提取的有效單體成份，能抗各種腫瘤活性［1-4］。已有報(bào)道芍藥苷可上調(diào)Bax，p53表達(dá)，下調(diào)Bc1-2表達(dá)，促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡［1］，但其具體機(jī)制尚不可知。并且芍藥苷可通過抑制NF-κB信號(hào)通路，抑制胃癌細(xì)胞增殖［2-3］，本研究在此基礎(chǔ)上探討芍藥苷是否通過抑制NF-κB信號(hào)通路來誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞系與藥物HepG2肝癌細(xì)胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC），細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。芍藥苷購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2試劑與儀器四唑鹽試劑（MTT）（sigma公司）；BCA法蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；ECL超敏發(fā)光液（碧云天生物技術(shù)研究所）；小鼠p65抗體（碧云天生物技術(shù)研究所）；β-actin（碧云天生物技術(shù)研究所）；兔IκBα抗體（Epitmics公司）；兔抗pp65抗體（Epitmics公司）；Caspase 3分光光度法檢測試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（Gbico公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gbico公司）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific公司）；超凈工作臺(tái)（Thermo Scientific公司）；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN集團(tuán)公司）；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

1.3方法

1.3.1MTT實(shí)驗(yàn)將80%左右融合的HepG2肝癌細(xì)胞，消化，細(xì)胞濃度調(diào)整為4×103個(gè)/mL，接種，37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。加入含PF，終濃度為0.5、1、2mg/mL的DMEM培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72小時(shí)，加MTT（5mg/mL）20μL，培養(yǎng)4小時(shí)后棄上清，加DMSO 150 μL，10分鐘左右后570 nm處測定OD值。計(jì)算藥物對細(xì)胞生長的抑制率。

1.3.2Caspase 3酶活性檢測將80%左右融合的HepG2肝癌細(xì)胞，消化，細(xì)胞濃度調(diào)整為4×103個(gè)/mL，接種，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。加入含PF，終濃度為0.5、1、2 mg/mL的DMEM培養(yǎng)基中，按照Caspase 3酶活性檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，收集細(xì)胞，裂解，加底物，顯色，于405 nm處測定吸光度。

1.3.3w est ern bl ot收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，收獲蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行測定。跑SDS凝膠電泳，后濕法磚膜。孵一抗過夜，二抗1小時(shí)后，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件對各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1芍藥苷對H epG 2肝癌細(xì)胞增殖抑制作用隨著給藥濃度的增加，芍藥苷對HepG2肝癌細(xì)胞抑制作用逐漸增強(qiáng)，在2 mg/mL時(shí)抑制率最大；隨著24、48、72小時(shí)給藥時(shí)間的增加，芍藥苷對HepG2肝癌細(xì)胞抑制作用也逐漸增強(qiáng)，其中48、72小時(shí)作用強(qiáng)度一致，所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取48小時(shí)作為給藥濃度，見表1。

表1　芍藥苷對H epG 2肝癌細(xì)胞增殖抑制作用（±s）

表1　芍藥苷對H epG 2肝癌細(xì)胞增殖抑制作用（±s）

注：與前一劑量組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

組別劑量/（m g·m L-1）抑制率/% 24 h48 h72 h對照組00.1±0.023.0±0.33.1±0.5 0.53.5±0.8*14.5±2.1**14.3±2.4**芍藥苷16.5±0.5*23.7±3.6**23.8±3.8**2 10.7±1.9**35.3±5.1**35.2±4.3**

2.2芍藥苷對HepG 2肝癌細(xì)胞Caspase 3活性的影響芍藥苷（0.5、1、2 mg/mL）能提高HepG2肝癌細(xì)胞Caspase 3活性，并呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

圖1　芍藥苷對HepG 2肝癌細(xì)胞Caspase 3活性的影響

2.3芍藥苷對HepG 2肝癌細(xì)胞NF-κB通路的影響芍藥苷能抑制HepG2肝癌細(xì)胞細(xì)胞核NF-κB p65蛋白磷酸化，并呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而對細(xì)胞核內(nèi)p65表達(dá)無任何影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此繼續(xù)探討NF-κB p65上游蛋白的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥苷能抑制HepG2肝癌細(xì)胞IκBα蛋白磷酸化，并呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但對IκBα自身表達(dá)無任何影響，見圖2。

圖2　芍藥苷對H epG 2肝癌細(xì)胞N F-κB通路的影響

3　結(jié)論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其危害僅次于肺癌，目前其主要治療手段為手術(shù)，但即使獲得手術(shù)切除機(jī)會(huì)，其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率依然較高［5-9］。因此，尋求有效治療肝癌，降低復(fù)發(fā)率的藥物成為當(dāng)務(wù)之急。而抗腫瘤藥物包括化療藥物、激素、生物制劑都能引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡。凋亡對腫瘤的抑制起重要作用，并且抑制NF-κB活性促進(jìn)細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的有效手段之一［10］。芍藥苷可通過抑制NF-κB信號(hào)通路來抑制胃癌細(xì)胞增殖［2-3］，所以本研究擬嘗試用不同濃度（0.5、1、2 mg/mL）芍藥苷對HepG2肝癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明隨著給藥濃度的增加，芍藥苷可逐漸降低細(xì)胞活力，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，在48小時(shí)時(shí)抑制率達(dá)到最高點(diǎn)。

Caspase 3是caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，其被合成后通常以非活化的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在多種凋亡信號(hào)刺激下經(jīng)蛋白水解作用被激活成活化形式，可對多種蛋白底物進(jìn)行降解，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是整個(gè)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)［11］。Caspase 3在HepG2肝癌細(xì)胞中活性高于給藥組［12-14］，在本研究中，與對照組比較，芍藥苷（0.5、1、2 mg/mL）呈劑量依賴性抑制Caspase 3活性。

NF-κB是一類廣泛存在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的重要轉(zhuǎn)錄因子，是多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，參與組織細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)，炎癥反應(yīng)，生長分化和凋亡等［15-16］。未受刺激時(shí)與IκB結(jié)合，當(dāng)受到刺激時(shí)，IκB磷酸化，釋放NF-κB，使之恢復(fù)轉(zhuǎn)錄活性并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。NF-κB在各種腫瘤細(xì)胞中均過表達(dá)［17］，朱開梅等［18］報(bào)道八角中莽草酸可通過抑制NF-κB p65活性，抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果表明芍藥苷能抑制HepG2肝癌細(xì)胞NF-κBp65，IκBα蛋白磷酸化，最終提高Caspase 3活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

因此，芍藥苷可能通過NF-κB信號(hào)通路，提高Caspase 3活性，促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞的凋亡。

［1］晏雪生，李瀚旻，彭亞琴，等.芍藥苷對人肝癌細(xì)胞Hep-G2凋亡及其調(diào)控基因的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25（7）: 1346-1347.

［2］方申存，戴偉，吳昊，等.芍藥苷對人胃癌SG C7901/V CR細(xì)胞增殖抑制作用及其機(jī)制研究［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：自然版，2010，30（5）:636-640.

［3］Fang S，Zhu W，Zhang Y，et al.Paeoni florin modulates multi drug resistance of a human gastric cancer cell line vi a the inhibition of NF-κB activation［J］.Mol Med Rep，2012，5（2）:351-356.

［4］Lu JT，He W，SongSS，et al.Paeoni florin inhibited the tumor invasion and metastasis in human hepato cellular carcinoma cells［J］.Brat is l Lek Listy，2014，115（7）:427-433.

［5］郭明，伍周玲，王春歌，等.黃芩苷-金屬配合物的合成及其抗腫瘤活性研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（3）:337-345.

［6］吳菲，林國楨，張晉昕.我國惡性腫瘤發(fā)病現(xiàn)狀及趨勢［J］.中國腫瘤，2012，21（2）:81-85.

［7］魏沙.2002—2010年我國城市惡性腫瘤死亡率變化趨勢分析［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，20（1）:111-113.

［8］李鐘聲.原發(fā)性肝細(xì)胞癌的治療進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)學(xué)，2009， 30（7）:830-832.

［9］蔡欣然，黃長玉，周良藝.原發(fā)性肝癌根治術(shù)后不同復(fù)發(fā)時(shí)期高危因素及療效研究［J］.實(shí)用腫瘤雜志，2010，25（5）: 560-563.

［10］Baud V，Karin M.Is N F-kappaB a good target for cancer therapy？Hopes and pitfalls［J］.Nat Rev Drug Discov，2009，8（1）:33-40.

［11］Porter A G，Janicke RU.Emerging roles of caspase-3 in apopt os is［J］.Cell Death Differ，1999，6（2）:99-104.

［12］Xiang Q，M aY，Dong J，et al.Carnosic acid induces apopt osi s associ at ed with mit ochondri al dysfuncti on and Akt inact i vation in HepG 2 cell s［J］.Int J Food Sci Nutr，2015，66（1）：76-84.

［13］Zhang H，Guo Z，Han L，et al.The antitumor effect and mechanism of tai pei ni ne A，a new C19-dit erpenoid al kal oi d fr om Aconi tumt ai pei cum，on the HepG 2 hum an hepat ocel l ul ar carci nom a cel l l i ne［J］.J BU O N，2014，19（3）:705-712.

［14］Sudan S，Rupasi nghe H P.Fl avonoi d-enri ched appl e fraction A F4 i nduces cell cycle arrest，DNA topoisomerase II inhi bition，and apoptosis in human liver cancer HepG 2 cells［J］.Nutr Cancer，2014，66（7）:1237-1246.

［15］Zhang Y H，Yan HQ，Wang F，et al.TIPE2 inhi bits TN F-α i nduced hepatocellular carcinoma cell metastasis via Erk1/2 downregul at i on and N F-κB activation［J］. Int J Oncol，2015，46（1）:254-264.

［16］Shan RF，Zhou Y F，Peng A F，et al.Inhi bition of Aurora-B suppresses H epG 2 cell invasi on and migration via the PI3K/A kt/N F-κB si gnaling pathway in vitro［J］. Exp Ther Med，2014 8（3）:1005-1009.

［17］崔嵩，劉學(xué)鋒，吳斌.N F-κB在腫瘤中的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17（1）:134-137.

［18］朱開梅，顧生玖，顧小文，等.八角中莽草酸對人肝癌H epG 2細(xì)胞增殖及N F-κB蛋白表達(dá)的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（1）:126-129.

Apoptotic Induction Effects of Paeoniflorin on Hepatoma Carcinoma Cells

ZHANG Yawu1，QUAN Ke2
1 Biliary Pancreatic Surgery Department of Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730000，China；2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine

Objective:To explore apoptotic induction effects of paeoniflorin on hepatoma carcinoma cells（HepG2），and to investigate its mechanism.Methods:HepG2 cells were cultivated with different concentrations of paeoniflorin（0.5，2 mg/mL），cell viability was detected by MTT method，Caspase 3 activity measured by enzyme linked immunosorbent assay and the expression of NF-κB signaling pathway related protein by western blot method. Results:As the concentrations of the drug increased，paeoniflorin could decrease the viability of HepG2 cells gradually，and the inhibition rate reached the highest within 48 hours；it increased Caspase 3 activity，inhibited the phosphorylation of NF-κB p65 and IκBα，thereby to promote cellular apoptosis.Conclusion:Paeoniflorin could obtain anti-tumor effects by inducing the apoptosis of HepG2 cells via NF-κB signaling pathway.

hepatoma carcinoma cells；apoptosis；NF-κB signaling pathway；phosphorylation；paeoniflorin

R735.7

A

1004-6852（2016）05-0023-03

2015-02-19

張亞武（1971—），男，碩士學(xué)位，副主任醫(yī)師。研究方向：消化道腫瘤的診治。