李素明，杭柏亞

南京市中醫(yī)院，江蘇南京210001

痹痛合劑對OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)變化及軟骨細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)的影響*

李素明，杭柏亞△

南京市中醫(yī)院，江蘇南京210001

目的：觀察痹痛合劑對骨性關(guān)節(jié)炎（OA）關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響并探討其可能的作用機(jī)制。方法：將SD雄性大鼠64只隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組）、模型組（B組）、硫酸氨基葡萄糖組（C組）和痹痛合劑組（D組），A組行假手術(shù)，B、C、D組采用Hulth法復(fù)制OA模型，A組常規(guī)飼養(yǎng)，其余各組術(shù)后分別加服生理鹽水，硫酸氨基葡萄糖溶液和痹痛合劑。術(shù)后第8周處死，分別大體觀察、光鏡400×和電鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，原位雜交法檢測關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Bc1-2 mRNA表達(dá)。結(jié)果：B組關(guān)節(jié)軟骨呈典型OA形態(tài)學(xué)改變，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Bc1-2 m RNA表達(dá)減弱；C、D組關(guān)節(jié)軟骨輕度退變，形態(tài)學(xué)方面與A組接近，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Bc1-2 m RNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：痹痛合劑與硫酸氨基葡萄糖能延緩OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨的退變，其可能的作用機(jī)制是通過提高關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Bc1-2基因的表達(dá)，抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡。

骨性關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；細(xì)胞形態(tài)學(xué)；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2；痹痛合劑

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是中老年人常見病、多發(fā)病，已成為影響老年人運(yùn)動(dòng)及致殘的重要原因之一。其主要的病理特征為關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)發(fā)生變化（退變）。關(guān)節(jié)疼痛是其主要的臨床表現(xiàn)。因此，既能止痛又能延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的藥物是較為理想的選擇。痹痛合劑是院內(nèi)制劑，臨床應(yīng)用治療骨性關(guān)節(jié)炎幾十年，能有效緩解膝骨性關(guān)節(jié)炎患者的疼痛［1］。但能否有效緩解或阻止病情發(fā)展有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過建立OA大鼠模型，觀察痹痛合劑對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響并探討其可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)對照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性大鼠64只，體質(zhì)量200～220 g，2月齡，購于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心鼠類實(shí)驗(yàn)室提供SPF級醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施，動(dòng)物許可證號：SYXK（蘇）2012-0042。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3試劑及儀器痹痛合劑（南京市中醫(yī)院院內(nèi)制劑，蘇藥制字Z04000864）；硫酸氨基葡萄糖膠囊（浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20041316）；磷酸鹽緩沖液（PBS）；Bc1-2預(yù)雜交液和雜交液，Bc1-2原位雜交檢測試劑盒及探針（南京建成生物工程公司）；流式細(xì)胞儀（貝克曼庫特FC500）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)（Chemi Doc XRS+）；熒光顯微鏡（奧林巴斯BX43）；研究型倒置熒光顯微鏡（徠卡DMI3000B）；恒溫箱（Thermo HRRAce11 150i）；掃描式電鏡（日本JSM-6010LA）。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1分組將64只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（A組）、模型組（B組）、硫酸氨基葡萄糖組（C組）和痹痛合劑組（D組），每組16只。

1.4.2動(dòng)物模型的建立A組皮膚切開后，隨即縫合，不作其他處理；B、C、D組用硫噴妥鈉從耳靜脈麻醉，固定，常規(guī)備皮消毒，沿髕骨韌帶內(nèi)側(cè)緣切口，切斷雙后肢內(nèi)側(cè)副韌帶及膝前內(nèi)側(cè)筋膜擴(kuò)張部，并在斷端處修剪去除約2 mm，造成雙后肢膝外翻畸形，逐層縫合傷口，無菌敷料及繃帶包扎固定，術(shù)后連續(xù)3天肌肉注射青霉素2萬U預(yù)防感染。術(shù)后1周將造模大鼠置于拖箱內(nèi)，每天趕其行走30分鐘，16周后X線檢查，關(guān)節(jié)邊緣變尖銳，并逐漸發(fā)展成為骨贅者證實(shí)造模成功。

1.4.3給藥A組予正常水和飼料喂養(yǎng)，B組生理鹽水灌胃（3次/d，3 mL/次），C組硫酸氨基葡萄糖溶液3 mL（含藥0.037 68 g）灌胃，3次/d，D組痹痛合劑水溶液3mL（含藥1.25 mL）灌胃，3次/d。灌服藥物劑量按人與大鼠體表面積換算［2］。各組術(shù)后第2天開始給藥，連續(xù)8周。

1.4.4關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)大體觀察每組隨機(jī)抽取8只大鼠進(jìn)行大體觀察，停止給藥后處死大鼠，立即將大鼠于仰臥位固定，取材部位消毒，切開膝關(guān)節(jié)囊，大體觀察后股骨髁關(guān)節(jié)面病理改變按照以下標(biāo)準(zhǔn)評分：1）關(guān)節(jié)面光整、色澤如常為O分；2）關(guān)節(jié)面粗糙不平，有小的裂隙且色澤灰暗為1分；3）關(guān)節(jié)面糜爛，缺損深達(dá)軟骨表中層為2分；4）關(guān)節(jié)面潰瘍形成，缺損深達(dá)軟骨深層為3分；5）軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露為4分。

1.4.5關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察同“1.4.4”項(xiàng)方法，取材部位消毒，用銳利刀片切取股骨內(nèi)髁軟骨，做成2 mm×1 mm全層軟骨標(biāo)本，2.5%戊二醛溶液固定，HE染色，光鏡400×和電鏡下觀察。

1.4.6原位雜交法檢測關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中bc1-2 m RN A表達(dá)同“1.4.4”項(xiàng)，剩下的股骨內(nèi)髁軟骨連同脛骨平臺關(guān)節(jié)面一并切下，立即用PBS洗凈，用新鮮配制的4%多聚甲醛0.1m（含有1/1000DEPC）固定過夜。10%EDTA（含1/1000DEPC）脫鈣10天，石蠟包埋，切片。原位雜交：切片脫蠟至水；3%H2O2室溫處理10分鐘以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶37℃消化5分鐘；滴加20 μL預(yù)雜交液至bc1-2原位雜交檢測試劑盒中。放入恒溫箱37℃20分鐘；滴加20 μL雜交液，恒溫箱37℃雜交過夜（12小時(shí)）；滴加封閉液37℃30分鐘；滴加生物素過氧化酶37℃20分鐘；滴加DAB，顯色10分鐘。自來水沖洗10分鐘；蘇木素復(fù)染1秒，充分水洗；乙醇脫水，二甲苯透明封片。標(biāo)本切片置于光鏡下（×400），將圖像輸入圖像處理系統(tǒng)，每張切片選擇10個(gè)不同視野，對軟骨細(xì)胞中bc1-2mRNA陽性表達(dá)用陽性面積和灰度值進(jìn)行量化（灰度值系統(tǒng)設(shè)定白色最大灰度為255，黑色最小灰度為0。灰度值越小，說明其陽性反應(yīng)程度越高，表達(dá)越強(qiáng)，反之則表達(dá)越弱）。

1.4.7陽性結(jié)果判斷以細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色著色者為陽性，未加探針者為陰性對照。

1.5主要觀察指標(biāo)觀察各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞bc1-2基因表達(dá)水平的變化。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件完成，以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較用SNK-q檢驗(yàn)，等級資料采用Ridit分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大體觀察A組脛骨平臺及股骨外側(cè)髁關(guān)節(jié)面光滑平整清楚，有光澤，關(guān)節(jié)軟骨完好；B組脛骨平臺及股骨外側(cè)髁關(guān)節(jié)面不平整模糊不清，關(guān)節(jié)軟骨層無光澤、顏色灰暗，關(guān)節(jié)軟骨損壞嚴(yán)重，關(guān)節(jié)邊緣及關(guān)節(jié)內(nèi)均可見有骨贅形成，外髁負(fù)重區(qū)見軟骨剝脫；C、D組關(guān)節(jié)面大體形態(tài)基本相同，關(guān)節(jié)面清楚，光滑平整，有光澤，關(guān)節(jié)軟骨基本完好，外髁負(fù)重區(qū)軟骨基本完好，關(guān)節(jié)邊緣無骨贅形成，見表1。

2.2光鏡下H E染色大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)A組：軟骨表面光滑，軟骨細(xì)胞排列整齊，且四層結(jié)構(gòu)清晰可辨，潮線完整，軟骨基質(zhì)染色為粉紅色，著色均勻；B組：關(guān)節(jié)軟骨破壞最為嚴(yán)重，軟骨表面粗糙糜爛不整，形成缺損區(qū)；C組：細(xì)胞四層結(jié)構(gòu)基本清晰，潮線基本完整，有少許軟骨細(xì)胞存在輕度變性；D組：細(xì)胞四層結(jié)構(gòu)基本清晰，潮線基本完整，關(guān)節(jié)軟骨有少許炎性細(xì)胞侵潤，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有輕度變性，見圖1。

表1　各組大鼠股骨髁關(guān)節(jié)面病理改變評分分布

圖1　光鏡下各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（H E 400×）

2.3電鏡下觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化A組：膝關(guān)節(jié)內(nèi)髁部軟骨細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞壁連續(xù)，細(xì)胞核飽滿，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊無擴(kuò)張腫脹，染色體分布均勻，膠質(zhì)纖維連續(xù)性好，排列密集而整齊，有完整的結(jié)構(gòu)。B組：膝關(guān)節(jié)內(nèi)髁部軟骨細(xì)胞分布不均勻，軟骨細(xì)胞增多，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則且細(xì)胞壁破裂不整齊，細(xì)胞核縮小，染色體分布不均勻，胞質(zhì)內(nèi)可見線粒體腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞漿內(nèi)微絲堆積，膠質(zhì)纖維斷裂，排列紊亂，見大量軟骨細(xì)胞凋亡。C組：膝關(guān)節(jié)內(nèi)髁部軟骨細(xì)胞分布較均勻，細(xì)胞壁連續(xù)，細(xì)胞核飽滿，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，染色體分布均勻，膠質(zhì)纖維連續(xù)排列密集整齊，偶見部分軟骨細(xì)胞凋亡。D組：膝關(guān)節(jié)內(nèi)髁軟骨細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞壁連續(xù)，細(xì)胞核飽滿，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，染色體分布均勻，膠質(zhì)纖維連續(xù)排列密集整齊，有完整的縱橫向結(jié)構(gòu)，有少量軟骨細(xì)胞凋亡，見圖2。

圖2　電鏡下各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

2.4原位雜交法檢測關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Bc1-2 m RN A表達(dá)4組均檢測到bc1-2 mRNA的表達(dá)，其中A組表達(dá)較強(qiáng)，B組表達(dá)明顯減弱；D、C組干預(yù)后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Bc1-2 mRNA陽性細(xì)胞的表達(dá)明顯升高，接近正常組（P＞0.05），與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。C組與D組無明顯差異（P＞0.05），見圖3，表2。

圖3　光鏡下各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Bc1-2 m RN A表達(dá)（400×）

表2　原位雜交法檢測關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中bc1-2 m RN A陽性表達(dá)灰度值

3　討論

骨性關(guān)節(jié)炎又稱退行性骨關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞變性、結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞凋亡甚至軟骨缺損等形態(tài)學(xué)的變化是其基本的病理改變［3-6］。由于沒有神經(jīng)、血管和淋巴的分布，軟骨雖然有一定的自我修復(fù)能力，但是大于5 mm以上的局部軟骨損傷很難自我修復(fù)，關(guān)節(jié)炎類軟骨疾病一直不能得到很好的治療［7-8］。目前臨床上治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物主要有兩大類：1）消炎止痛類，如非甾體抗炎藥、選擇性COX-2抑制劑等，能有效緩解疼痛，但長期服用可使關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖和透明質(zhì)酸的合成減少，加重骨性關(guān)節(jié)炎的病理損害［9］。2）緩解病情類，如氨基葡萄糖，它是一種糖胺聚糖，以乙?；男问酱嬖谟陉P(guān)節(jié)軟骨，椎間盤和滑液中，是一種天然的蛋白多糖［10］，目前廣泛應(yīng)用于臨床治療骨性關(guān)節(jié)炎［11-12］。其能特異性地作用于關(guān)節(jié)軟骨，維護(hù)軟骨基質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還能抑制前列腺素的合成，保護(hù)各種有害物質(zhì)對軟骨細(xì)胞的破壞，改善關(guān)節(jié)活動(dòng)，緩解疼痛，延緩骨性關(guān)節(jié)炎退變的過程［13-14］。但臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其止痛作用有限。因此尋找一種既能有效止痛，又能延緩疾病發(fā)展的藥物具有重大意義。中醫(yī)藥注重整體觀，采用辨證論治的方法從中醫(yī)藥寶庫中挖掘，有望實(shí)現(xiàn)該目的。由于OA疾病涉及較多蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)并鑒定的骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)蛋白已有100多個(gè)［15-16］。中藥多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)（從疾病整體水平上的調(diào)節(jié)）相對于西醫(yī)單一化合物單一靶點(diǎn)的治療模式有較大的優(yōu)勢［17］。痹痛合劑在我院用于治療骨性關(guān)節(jié)炎已有幾十年，臨床研究表明能有效緩解骨性關(guān)節(jié)炎患者疼痛等臨床癥狀，改善關(guān)節(jié)功能，總有效率高于硫酸氨基葡萄糖［2］；實(shí)驗(yàn)研究表明，痹痛合劑能夠抑制關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子IL-1、TNF-α表達(dá)［18］，推測痹痛合劑能夠保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，延緩骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，但缺乏直接的證據(jù)。本研究通過對OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生明顯退變，模型組呈現(xiàn)典型骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)變化，病理改變評分與正常組比較明顯增高（P＜0.01）。給予痹痛合劑和硫酸氨基葡萄糖干預(yù)后無論是大體觀察還是鏡下觀察，關(guān)節(jié)軟骨的退變均有明顯改善，與模型組比較關(guān)節(jié)軟骨病理改變評分下降明顯（P＜0.01），表明痹痛合劑能夠有效保護(hù)軟骨，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變。

中醫(yī)認(rèn)為，OA發(fā)病是肝腎虧虛為本，合風(fēng)寒濕邪入侵所形成的痹痿兼癥，其中有著復(fù)雜的機(jī)理和各種因素相互作用，以肝腎虧虛為基礎(chǔ)，此外還有脾虛、血瘀、痰濕幾個(gè)重要環(huán)節(jié)［19-22］。痹痛合劑正是基于以上理論，經(jīng)過幾代人的努力，研制而成。方中懷牛膝、續(xù)斷、狗脊、香加皮為君藥，以補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，其中懷牛膝為引經(jīng)藥；獨(dú)活、防風(fēng)祛下焦與筋骨間風(fēng)寒濕邪，威靈仙、徐長卿舒筋通絡(luò)止痹痛；雞血藤、桂枝、地鱉蟲活血通絡(luò)，通達(dá)四肢關(guān)節(jié)；川烏（制）、草烏（制）散寒止痛；白術(shù)、炒薏苡仁、陳皮、茯苓行氣化痰，健脾祛濕；虎杖活血清熱解毒，同時(shí)防諸藥辛燥太過，諸藥合用共奏補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕、化瘀痰之功。綜觀全方，扶正祛邪、標(biāo)本兼顧，可使肝腎強(qiáng)、筋骨壯，風(fēng)濕除而痹痛愈。但其作用機(jī)制目前尚不清楚。研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡在骨性關(guān)節(jié)炎的病理過程中起著重要作用［23］。Bc1-2基因是一種原位癌基因，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，它通過抑制線粒體釋放cytc來抑制細(xì)胞的凋亡［24］。學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［25］，老年個(gè)體Bc1-2表達(dá)較正常人低；小鼠在剔除Bc1-2基因后表現(xiàn)出典型中醫(yī)腎虛癥狀：發(fā)育不良、形體小、壽命縮短、毛發(fā)色澤變淺、軟骨發(fā)育異常、多囊腎和生殖能力下降等［26-27］。因此，有學(xué)者認(rèn)為，Bc1-2基因家族在體內(nèi)作用與中醫(yī)腎的功能非常接近，并提出［28］“Bc1-2家族可能是中醫(yī)腎本質(zhì)相關(guān)基因”的假說。因此，補(bǔ)腎療法有可能提高Bc1-2基因的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，正常組關(guān)節(jié)軟骨Bc1-2基因表達(dá)最強(qiáng)，模型組表達(dá)減弱（P＜0.01），痹痛合劑和硫酸氨基葡萄糖干預(yù)后其表達(dá)增強(qiáng)（與模型組比較P＜0.01），因而，痹痛和劑和硫酸氨基葡萄糖均能提高OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Bc1-2基因的表達(dá)。

綜上所述，痹痛合劑能有效延緩OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的退變，延緩OA病情的發(fā)展，其可能的作用機(jī)制是通過提高關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Bc1-2基因的表達(dá)，抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡而起作用。其具體的作用靶點(diǎn)有待進(jìn)一步深入研究。

［1］李素明，杭柏亞.痹痛合劑治療骨性關(guān)節(jié)炎30例［J］.中醫(yī)研究，2008，21（1）:31-33.

［2］苗明三.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，1997:143.

［3］方丹，羅利飛.加味陽和湯對膝骨性關(guān)節(jié)炎患者血清超氧化物歧化酶和丙二醛含量的影響及療效觀察［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2014，52（9）:113-115.

［4］楊軍，羅利飛.獨(dú)活寄生湯對膝骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液基質(zhì)金屬蛋白酶-3、9和13水平的影響及療效觀察［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2014，52（6）:120-122.

［5］楊強(qiáng)，李明波，陳小英.超短波配合外敷自制消炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的臨床觀察［J］.中國醫(yī)藥科學(xué)，2013，3（23）: 194-195.

［6］高偉業(yè)，吳東蘭，楊家斌，等.不同方法治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎對尿CTX-II、COMP、PYD的影響［J］.中國醫(yī)藥科學(xué)，2014，4（2）:19-21.

［7］Collier ME，Ettelaie C.Induction of endothelial cell proliferation by recombinant and microparticletissue factor involves beta1-integrin and ext racellular signal regulated kinase activation［J］.A rt eri oscl er Throm b V asc Bi ol，2010，30（9）:1810-1817.

［8］K rü ger JP，Hondke S，Endres M，et al.H um an pl at el et rich plasma stimul at es migration and chondrogenic differentiation of human subchondral progenit or cells［J］.J Orthop Res，2012，30（6）:845-852.

［9］Ver kl ei j SP，Lui jst erburg PA，Bohnen A M，et al.NSAID s vs acetaminophen in knee and hip osteoarthritis:a syst ematic review regarding het er ogenei ty influencing the out com es［J］.Osteoarthritis Cartilage，2011，19（8）:921-929.

［10］Durmus D，Alayli G，Bayrak IK，et al.Assessment of the effect of glucosamine sulfate and exercise on knee cartilage using magnetic resonance imaging in patients with knee osteoarthritis:a randomized controlled clinical trial［J］.J Back Musculoskel et Rehabi l，2012，25（4）:275-284.

［11］Reginster JY，Neuprez A，Lecart MP，et al.Role of glucosamine in the treatment for osteoarthritis［J］. Rheumat ol Int，2012，32（10）:2959-2967.

［12］Kanzaki N，Saito K，Maeda A，et al.Effect of a dietary supplement containing glucosamine hydrochloride，chondroitin sulfate and quercetin glycosides on sympt omatic knee ost eoart hritis:a randomized，doubleblind，placebo-controlled study［J］.J Sci Food Agric，2012，92（4）:862-869.

［13］Meul yzerM，Vachon P，Beaudry F，et al.Comparison of pharmacokinetics of glucosamine and synovial fluid levels following administ ration of glucosamine sulphate or glucosamine hydrochloride［J］.Osteoarthritis Cartilage，2008，16（9）:973-979.

［14］皮俊杰，呂志偉，閆志榮，等.前交叉韌帶切斷誘導(dǎo)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型：阿侖膦酸鈉與鹽酸氨基葡萄糖對其關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的保護(hù)作用［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（28）:5151-5154.

［15］Migliaccio S，Brama M，Spera G.The differential effects of bisphosphonates，SERM S（selective estrogen receptor modul ators），and par at hyroi d hor mone on bone remodeling in osteoporosis［J］.Clin Interv Aging， 2007，2（1）:55-64.

［16］馮文鋮，梁偉國.骨科疾病中蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國組織工程研究，2014，18（2）:295-300.

［17］Xu XJ.New concept s and approaches for drug discover based on traditional Chinese medicine［J］.Drug Discovery Today:Technologies，2006，3（3）:247-253.

［18］朱桂松，杭柏亞.痹痛合劑對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞Bcl-2及關(guān)節(jié)液IL-1和TN F-α表達(dá)的影響［J］.江蘇中醫(yī)藥，2013，45（9）:72-74.

［20］尤從新.樊成虎教授治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎經(jīng)驗(yàn)［J］.西部中醫(yī)藥，2014，27（12）:33-34.

［21］李興勇，徐霞，麻虎，等.中醫(yī)藥治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的現(xiàn)狀［J］.西部中醫(yī)藥，2013，26（12）:144-146.

［22］苗戍燕，邱南海，苗瑞瑞.溫針聯(lián)合磁振熱治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎療效分析［J］.中醫(yī)藥信息，2014，31（4）:137-138.

［23］王旭光，陳根殷，楊展.原花青素對佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（4）：365-368.

［24］Bitter W，Gerrits H，Kieft R，et al.The role of transferri n-recept or variation in the host range of Trypanosom a brucei［J］.Nature，1998，391（6666）:499-502.

［25］Aggar wal S，Gupta S.Increased apoptosis of Tcell subsets in aging humans:alt ered expression of Fas（CD 95），F(xiàn)as ligand，Bcl-2，and Bax［J］.J Immunol，1998，160（4）:1627-1637.

［26］Kamada S，Shi mono A，Shinto Y，et al.bcl-2 deficiency in mice leads to pleiotropic abnormal it ies:accelerated lymphoid cell death in thymus and spleen，polycystic kidney，hair hypopigmentation，and distorted small intestine［J］.Cancer Res，1995，55（2）:354-359.

［27］Shei bani N，Scheef EA，Di maio TA，et al.Bcl-2 expressi on modul ates cell adhesion and migration promoting branching of ur et eri c bud cel l s［J］.J Cell Physiol，2007，210（3）:616-625.

［28］張登海，凌昌全，劉穎，等.現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)與中醫(yī)學(xué)說-家族與中醫(yī)腎本質(zhì)關(guān)系探討［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，1999，21（3）: 125-127.

The Influence of BiTong Mixture on the Expression of Cartilage Cells Bcl-2 and Articular Cartilage Morphological Changes of OA Rats

LI Suming，HANG Baiya△
Nanjing Municipality TCM Hospital，Nanjing 210001，China

Objective:To observe the influence of BiTong mixture on articular cartilage morphology of osteoarthritis（OA）rats，and explore its possible mechanism.Methods:Sixty-four SD male rats were randomized into sham operation group（A），the model group（B），glucosamine sulfate group（C）and BiTong mixture group（D），the rats in group A were performed with sham operation，the rats in the group B，C and D were replicated by Hulth method，the rats in the group A accepted conventional feeding，the rats in other groups took physiological saline，glucosamine sulfate solution and BiTong mixture after the operation respectively.The rats were sacrificed at the eighth week after the operation，cellular morphology of articular cartilage was inspected by gross observation，under light microscope and electron microscope，and the expressions of Bcl-2 mRNA in articular cartilage cells were detected by in situ hybridization（ISH）.Results:Articular cartilage showed typical OA morphological changes in the group B，the expressions of Bcl-2 mRNA in articular cartilage cells reduced obviously；articular cartilage degenerated slightly in the groups C and D，morphological changes were similar to the rats in the group A，the expressions of Bcl-2 mR -NA in articular cartilage cells enhanced significantly，it had significant difference compared with the group B（P＜0.01）. Conclusion:BiTong mixture and glucosamine sulfate solution could delay articular cartilage degeneration of OA rats，and the mechanism might be inhibiting articular cartilage cellular apoptosis by raising the expressions of Bcl-2 mRNA in articular cartilage cells.

osteoarthritis；cartilage cells；cellular morphology；B cell lymphoma/leukemia-2；BiTong mixture

R285.5

A

1004-6852（2016）05-0018-05

2015-05-10

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目（編號YKK 12151）。

李素明（1975—），男，碩士學(xué)位，副主任醫(yī)師，副教授。研究方向：骨與關(guān)節(jié)疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。

杭柏亞（1965—），男，碩士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師。研究方向：骨關(guān)節(jié)疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。