魏　萍，劉文娜，王輝輝（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱50030；.鄂倫春自治旗大楊樹畜牧綜合服務(wù)站，內(nèi)蒙古呼倫貝爾65456）

三種益生菌菌株與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用

魏萍1，劉文娜1，王輝輝2
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.鄂倫春自治旗大楊樹畜牧綜合服務(wù)站，內(nèi)蒙古呼倫貝爾165456）

為模擬豬腸道內(nèi)環(huán)境，探究益生菌與細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用，利用Transwell小室在體外建立益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)，通過臺盼藍(lán)染色，檢測PK-15細(xì)胞存活率。結(jié)果表明，當(dāng)益生菌菌體濃度102cfu·mL-1≤c≤1012cfu·mL-1，共培養(yǎng)時(shí)間為1和3 h；當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間1 h≤t≤24 h，益生菌菌體濃度為102、104、106和108cfu·mL-1時(shí)，PK-15細(xì)胞存活率較高，益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)成立。采用MTT比色法檢測對TGEV抑制率，結(jié)果顯示，益生菌菌體濃度約為102~108cfu·mL-1，共培養(yǎng)時(shí)間為1~24 h時(shí)對TGEV抑制率均達(dá)90%以上。此外，益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)的TGEV平均滴度較低。

益生菌；PK-15細(xì)胞；共培養(yǎng)；抗TGEV

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2016-6-17 15:21:52[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160617.1521.010.htm l

魏萍,劉文娜,王輝輝.三種益生菌菌株與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(6):60-67.

Wei Ping,Liu Wenna,Wang Huihui.Anti-TGEV effect of three probiotics strains and PK-15 cells co-culture[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(6):60-67.(in Chinese with English abstract)

豬傳染性胃腸炎是危害嚴(yán)重的病毒性腹瀉病，主要臨床癥狀為嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水[1]。近年來，常伴有PEDV、RV等混合感染，豬傳染性胃腸炎流行趨勢嚴(yán)峻[2]。Maragkoudakis等利用動物和人腸道及非腫瘤來源巨噬細(xì)胞系模型檢測乳酸菌抗病毒活性，發(fā)現(xiàn)乳酸菌可保護(hù)完整單層細(xì)胞而不被RV或TGEV破壞，鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌抗RV和TGEV，對細(xì)胞有最佳保護(hù)效果[3]。Kumar等研究豬源腸道益生菌（植物乳桿菌和唾液乳桿菌）抗冠狀病毒（TGEV）活性，發(fā)現(xiàn)體外ST細(xì)胞上益生菌培養(yǎng)上清即代謝產(chǎn)物抑制TGEV生長，作用72 h未引起細(xì)胞病變效應(yīng)，表明益生菌培養(yǎng)上清顯著抑制TGEV吸附ST細(xì)胞[4]。高長春等根據(jù)體外ST細(xì)胞感染TGEV模型研究益生菌抗TGEV作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三株益生菌均能抑制TGEV感染ST細(xì)胞，但在菌株和作用方式存在差異[5]。前人研究僅單一利用益生菌菌體、某種成分或代謝產(chǎn)物與細(xì)胞短暫作用，無法完全反映益生菌對細(xì)胞抗病毒作用影響。另外，相對于細(xì)菌間共培養(yǎng)[6]、細(xì)胞間共培養(yǎng)[7-8]，尤其是益生菌與細(xì)胞共培養(yǎng)鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)嘗試將抗病毒和共培養(yǎng)有機(jī)融合，詣在模擬豬腸道內(nèi)環(huán)境，通過臺盼藍(lán)染色試驗(yàn)初步摸索益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)成立條件，通過MTT比色法和CPE探究益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用效果，為應(yīng)用益生菌抗腹瀉病毒提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、細(xì)胞和病毒

豬源枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和食淀粉乳桿菌均為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存；PK-15細(xì)胞購自上海拜力生物科技有限公司；豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）TO163株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈。

1.1.2試驗(yàn)試劑

DMEM/F-12 1?1購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；FBS購自浙江天杭生物科技有限公司；臺盼藍(lán)、MTT、DMSO均購自Sigma公司；Transwell、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和六孔細(xì)胞培養(yǎng)板均購自哈爾濱賽托（賽信）生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)建立

當(dāng)六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中PK-15細(xì)胞鋪滿單層約為2.5×106cells·mL-1時(shí)，棄液，PBS液洗滌3次后將0.4μm Transwell小室放入培養(yǎng)板孔中，每孔即分為上室和下室，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板孔內(nèi)稱下室，在下室中添加新的細(xì)胞培養(yǎng)基，以剛接觸Transwell小室基底膜為宜，約2mL，上室加用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋的益生菌菌體，其終濃度分別為102、104、106、108、1010和1012cfu·mL-1，各處理組均封蓋于37℃，5%CO2無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別共培養(yǎng)1、3、6、12、18和24 h，移除Transwell小室，收集共培養(yǎng)上懸液，PBS液洗滌下室3次，加1m L 0.25%胰酶消化液作用5min，將貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)板上消化下來，再加1mL細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，連同收集的共培養(yǎng)上懸液一并用移液器轉(zhuǎn)移至Ep管中，1 000 r·min-1離心5min，棄上清液，加2mL PBS液并將PK-15細(xì)胞沉淀吹散成均勻單細(xì)胞混懸液，另加等體積0.4%臺盼藍(lán)染色液，混合均勻，染色2min，吸取少許液體于蓋有蓋玻片的血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)池內(nèi)，光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)錄藍(lán)染和未藍(lán)染細(xì)胞數(shù)。

1.2.2益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV效果測定

1.2.2.1益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對TGEV抑制率影響

當(dāng)六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的PK-15細(xì)胞鋪滿單層約為2.5×106cells·mL-1時(shí)，棄液，PBS液洗滌3次后，加2mL細(xì)胞培養(yǎng)基，將Transwell小室放入培養(yǎng)板孔中，上室加用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋益生菌菌體，其終濃度分別為102、104、106、108、1010和1012cfu·mL-1，封蓋于37℃，5%CO2無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)3 h，上室加細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋的終濃度為108cfu·mL-1益生菌菌體，封蓋于37℃，5% CO2無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別共培養(yǎng)1、3、6、12、18和24 h后，移除Transwell小室，PBS液洗滌下室3次，加100μL 100TCID50TGEV與PK-15細(xì)胞作用，于37℃，5%CO2無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用1.5 h，PBS液洗滌3次，加1 m L維持液于37℃，5%CO2無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照組和病毒對照組，每組處理三孔重復(fù)，改良MTT比色法測定益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對TGEV抑制率，即當(dāng)病毒對照組CPE達(dá)75%時(shí)，PBS液洗滌3次，加25μLMTT溶液（5mg·mL-1）和100μL維持液，37℃避光孵育4 h，棄液，每孔加100μL二甲基亞砜（DMSO），避光震蕩10min，酶標(biāo)儀測定490 nm波長處光吸收度即OD490，根據(jù)公式計(jì)算：病毒抑制率（%）=[（益生菌與細(xì)胞共培養(yǎng)處理組平均OD值-病毒對照組平均OD值）/（正常細(xì)胞對照組平均OD值-病毒對照組平均OD值）]× 100%。

1.2.2.2益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對TGEV滴度影響

當(dāng)六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中PK-15細(xì)胞鋪滿單層約為2.5×106cells·mL-1時(shí)，棄液，PBS液洗滌3次后，加2mL細(xì)胞培養(yǎng)基，將Transwell小室放入培養(yǎng)板孔中，向上室加用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋的終濃度為108cfu·mL-1益生菌，共培養(yǎng)12 h，PBS液洗滌3次后接入TGEV，于37℃，5%CO2無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，PBS液洗滌3次，棄液，細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于6、12、24、48和72 h置-20℃反復(fù)凍融3次，4 000 r·min-1離心10 min，收集各組上清即為病毒液，0.22μm濾器過濾并分裝，于-80℃保存待測。

當(dāng)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中PK-15細(xì)胞鋪滿單層約為105cells·mL-1時(shí)，將待測病毒作10個(gè)梯度連續(xù)10倍倍比稀釋，每個(gè)稀釋度病毒以100μL·孔-1量接種到96孔細(xì)胞微量培養(yǎng)板每一縱列，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照，于37℃，5%CO2無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天顯微鏡觀察，記錄細(xì)胞產(chǎn)生CPE孔數(shù)，直至最低稀釋度孔內(nèi)細(xì)胞無病變，且對照組細(xì)胞開始衰老為止。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2007初步整理后，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，運(yùn)用SPSS 17.0軟件，作單因素方差A(yù)NOVA和多重比較分析，P>0.05時(shí)，表示差異不顯著；P<0.05時(shí)，表示差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)建立

應(yīng)用臺盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中藍(lán)染及未藍(lán)染細(xì)胞數(shù)，根據(jù)公式：細(xì)胞存活率（%）=未藍(lán)染細(xì)胞數(shù)/（藍(lán)染細(xì)胞數(shù)+未藍(lán)染細(xì)胞數(shù)）×100%，計(jì)算不同益生菌菌體濃度與不同共培養(yǎng)時(shí)間組合處理PK-15細(xì)胞存活率（%），結(jié)果見表1~4。

由表1可知，同一共培養(yǎng)時(shí)間條件下，益生菌菌體濃度102、104、106、108cfu·mL-14組間PK-15細(xì)胞存活率差異不顯著，但均顯著高于益生菌菌體濃度為1010和1012cfu·mL-1的PK-15細(xì)胞存活率。

表1　同一共培養(yǎng)時(shí)間不同益生菌菌體濃度PK-15細(xì)胞存活率比較(M ean±SD)Table1 Comparison of PK-15 cells survival rate of the same time of co-culture and different concentration of probiotics (%)

當(dāng)益生菌菌體濃度102cfu·mL-1≤c≤1012cfu·mL-1時(shí)，對不同共培養(yǎng)時(shí)間PK-15細(xì)胞存活率比較組間差異性，結(jié)果見表2。

由表2可知，當(dāng)益生菌菌體濃度102cfu·mL-1≤c≤1012cfu·mL-1時(shí)，共培養(yǎng)1和3 h兩組間PK-15細(xì)胞存活率差異不顯著，但均顯著高于其余各組。

綜上所述，當(dāng)益生菌菌體濃度102cfu·mL-1≤c≤1012cfu·mL-1時(shí)，共培養(yǎng)時(shí)間為1或3 h，益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)成立。

表2　不同共培養(yǎng)時(shí)間PK-15細(xì)胞存活率組間比較(Mean±SD）Table2 Comparison of PK-15 cells survival rate of different time of co-culture

由表3可知，當(dāng)益生菌菌體濃度≤108cfu·mL-1時(shí)，同一益生菌菌體濃度條件下，不同共培養(yǎng)時(shí)間各組間PK-15細(xì)胞存活率差異不顯著；當(dāng)益生菌菌體濃度108cfu·mL-1

當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間1 h≤t≤24 h時(shí)，對不同益生菌菌體濃度PK-15細(xì)胞存活率作組間差異性比較，結(jié)果見表4。

由4可知，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間1 h≤t≤24 h時(shí)，益生菌菌體濃度為102、106和108cfu·mL-1三組間PK-15細(xì)胞存活率差異不顯著，但均顯著高于其余各益生菌菌體濃度組PK-15細(xì)胞存活率。

綜上所述，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間1 h≤t≤24 h時(shí)，益生菌菌體濃度為102、106和108cfu·mL-1，益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)成立。

表3　同一益生菌菌體濃度不同共培養(yǎng)時(shí)間PK-15細(xì)胞存活率比較(M ean±SD)Table3 Comparison of PK-15 cells survival rate of the same concentration of probiotics and different time of co-culture(%)

表4　不同益生菌菌體濃度PK-15細(xì)胞存活率組間比較(M ean±SD)Table 4 Comparison of PK-15 cells survival rate of different concentration of probiotics

2.2益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對TGEV抑制率測定

不同濃度益生菌菌體與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)3 h后，加TGEV作用1.5 h，MTT比色法測OD490值，根據(jù)公式計(jì)算TGEV抑制率，并繪制TGEV抑制率隨益生菌菌體濃度變化曲線，結(jié)果見圖1。

圖1　不同濃度益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對TGEV抑制率變化曲線Fig.1 TGEV inhibition rate curve of different concentrations of probiotics and PK-15 cells co-culture

由圖1可知，TGEV抑制率隨益生菌菌體濃度增加先升后降。不同益生菌菌體與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)，對TGEV抑制率存在差異，枯草芽孢桿菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，當(dāng)菌體濃度為1010cfu·mL-1時(shí)，對TGEV抑制率達(dá)到峰值為87.4%；屎腸球菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，當(dāng)菌體濃度為106cfu·mL-1時(shí)，對TGEV抑制率達(dá)到峰值為80.95%；食淀粉乳桿菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，當(dāng)菌體濃度為108cfu·mL-1時(shí)，對TGEV抑制率達(dá)到峰值為80.39%。綜合比較每組對TGEV平均抑制率為：枯草芽孢桿菌組（53.97%）>屎腸球菌組（52.32%）>食淀粉乳桿菌組（41.86%）。

綜上所述，當(dāng)益生菌菌體濃度約為108cfu·mL-1時(shí)，對TGEV抑制率較高，因此108cfu·mL-1為益生菌最佳濃度。

濃度為108cfu·mL-1益生菌菌體與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間，加TGEV作用1.5 h，MTT比色法，測OD490，根據(jù)公式計(jì)算對TGEV抑制率，并繪制TGEV抑制率隨共培養(yǎng)時(shí)間變化曲線，結(jié)果見圖2。

圖2　益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間對TGEV抑制率變化曲線Fig.2 TGEV inhibition rate curve of probiotics and PK-15 cells different time of co-culture

由圖2可知，TGEV抑制率隨共培養(yǎng)時(shí)間呈先升后降趨勢。益生菌菌體與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間，對TGEV抑制率存在差異，枯草芽孢桿菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間延長至12 h時(shí)，對TGEV抑制率達(dá)到峰值為86.49%；屎腸球菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間延長至18 h時(shí)，對TGEV抑制率達(dá)到峰值為93%；食淀粉乳桿菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間延長至12 h時(shí)，對TGEV抑制率達(dá)到峰值為68.81%。綜合比較，每組對TGEV平均抑制率為：枯草芽孢桿菌組（50.21%）>屎腸球菌組（48.36%）>食淀粉乳桿菌組（40.92%）。

綜上所述，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間延長至12 h時(shí)，對TGEV抑制率較高，因此12 h為最佳共培養(yǎng)時(shí)間。

2.3益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對TGEV滴度測定

濃度為108cfu·m L-1益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后，接種TGEV作用1.5 h，洗滌后加細(xì)胞維持液，不同時(shí)間點(diǎn)收集病毒液，按Reed-Muench兩氏法計(jì)算TGEV滴度。以收集TGEV時(shí)間為橫坐標(biāo)，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量負(fù)對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制TGEV滴度變化曲線，結(jié)果見圖3。

圖3　益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)TGEV滴度變化曲線Fig.3 TGEV titer curve of probiotics and PK-15 cells co-culture

由圖3可知，TGEV半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量負(fù)對數(shù)隨收集病毒液時(shí)間呈先升后降趨勢。益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)收集TGEV，其滴度差異顯著?？莶菅挎邨U菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，48 h收集TGEV，其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量負(fù)對數(shù)達(dá)到峰值為3.87；屎腸球菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，24 h收集TGEV，其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量負(fù)對數(shù)達(dá)到峰值為5.16；食淀粉乳桿菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，48 h收集TGEV，其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量負(fù)對數(shù)達(dá)到峰值為4.55。綜合比較，每組TGEV平均滴度為：枯草芽孢桿菌組（102.70）<屎腸球菌組（102.85）<食淀粉乳桿菌組（102.92）<正常病毒對照組（103.46）。

綜上所述，益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)能降低TGEV滴度，降低程度為：枯草芽孢桿菌組>屎腸球菌組>食淀粉乳桿菌組。

3　討論

3.1益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)建立

杜維霞等利用Caco-2腸上皮細(xì)胞單層屏障模型，研究四種腸道微生物對腸道屏障影響，檢測細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)體系中緊密連接蛋白表達(dá)和分布，結(jié)果致病菌組（大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌）緊密連接蛋白表達(dá)明顯減少；益生菌組表達(dá)與空白對照組相比無明顯變化，說明致病菌降低緊密連接蛋白表達(dá)、改變蛋白分布，最終導(dǎo)致腸道屏障功能受損；益生菌對腸道屏障無損傷作用[9]。Georgia等利用體外Transwell共培養(yǎng)模型，研究細(xì)菌與鼠源腸上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)相互作用，發(fā)現(xiàn)益生菌能顯著增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞活性，證實(shí)細(xì)胞趨化因子作用，而金黃色葡萄球菌作用效果不明顯；益生菌可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分化、成熟[10]。細(xì)菌穿越物理屏障誘導(dǎo)pro-inflammatory信號能力與其致病性和共生狀態(tài)無關(guān)，依賴特殊表面“物質(zhì)”即脂多糖。為模擬腸道環(huán)境，研究益生菌與細(xì)胞相互作用，尤其是益生菌對細(xì)胞有益作用，建立益生菌與細(xì)胞共培養(yǎng)模型十分必要。本試驗(yàn)以PK-15細(xì)胞為平臺，建立益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)模型，探索共培養(yǎng)條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)益生菌菌體濃度102cfu·mL-1≤c≤1012cfu·mL-1，共培養(yǎng)時(shí)間為1或3 h；當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間1 h≤t≤24 h，益生菌菌體濃度為102、106和108cfu·mL-1時(shí)，PK-15細(xì)胞存活率較高，表明益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)成立。

杜維霞等研究側(cè)重于與致病菌相比，益生菌對腸道屏障無損傷作用[9]。Georgia等研究側(cè)重于機(jī)理方面[10]。而本試驗(yàn)側(cè)重于探索益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)條件，為益生菌與細(xì)胞共培養(yǎng)抗病毒相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。細(xì)胞平臺，應(yīng)選用更加貼近腸道內(nèi)環(huán)境IPEC-J2細(xì)胞，體外建立益生菌與IPEC-J2細(xì)胞共培養(yǎng)模型，探索益生菌與IPEC-J2細(xì)胞共培養(yǎng)條件。目前難以建立益生菌與腸黏膜細(xì)胞共培養(yǎng)模型原因：①益生菌是兼性厭氧甚至絕對厭氧，腸黏膜細(xì)胞為5%CO2，無體外共培養(yǎng)試驗(yàn)裝置；②益生菌適宜培養(yǎng)基是MRS液體培養(yǎng)基，腸黏膜細(xì)胞為DMEM/F-12 1:1+10%FBS，現(xiàn)有培養(yǎng)基無法同時(shí)滿足體外共培養(yǎng)需求；③益生菌對營養(yǎng)物質(zhì)消耗大于腸黏膜細(xì)胞，共培養(yǎng)使腸黏膜細(xì)胞處于乏養(yǎng)狀態(tài)；④益生菌代謝速度遠(yuǎn)大于腸黏膜細(xì)胞，代謝產(chǎn)物積累，形成過酸環(huán)境，容易損傷腸黏膜細(xì)胞；⑤腸道環(huán)境復(fù)雜，存在多種益生菌，代謝產(chǎn)物豐富，相互作用，血液循環(huán)能給腸黏膜細(xì)胞提供足夠營養(yǎng)物質(zhì)和穩(wěn)定pH環(huán)境，腸黏膜本身分泌黏液對腸黏膜細(xì)胞形成保護(hù)層等。建議延長共培養(yǎng)時(shí)間為2和3 d甚至更長時(shí)間，增加更換細(xì)胞培養(yǎng)基頻次或使用帶有進(jìn)出孔可使細(xì)胞培養(yǎng)基流動的裝置。

3.2益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV效果評價(jià)

研究多集中在單一利用益生菌菌體（如活菌體、滅活菌體、破碎菌體等）、某些成分（如S-層蛋白）或代謝產(chǎn)物（如所有培養(yǎng)上清、提取單獨(dú)胞外多糖等）與細(xì)胞短暫作用評價(jià)益生菌對細(xì)胞抗病毒作用效果。由于作用時(shí)間短且單獨(dú)某一時(shí)間點(diǎn)，益生菌不同培養(yǎng)時(shí)間產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)不同，無法完全反映益生菌對細(xì)胞抗病毒作用影響。鑒于PK-15細(xì)胞是TGEV易感細(xì)胞，本試驗(yàn)在益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)基礎(chǔ)上，模擬豬腸道內(nèi)益生菌與細(xì)胞相互作用動態(tài)變化過程，進(jìn)行抗TGEV效果評價(jià)，主要針對兩方面檢測：①通過測定PK-15細(xì)胞活性即OD490間接計(jì)算共培養(yǎng)對TGEV抑制率；②測定TGEV滴度即TCID50直接反映共培養(yǎng)對TGEV作用。結(jié)果表明，益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)具有抗TGEV作用，表現(xiàn)為對TGEV抑制率升高，降低TGEV滴度，不同益生菌菌株與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)具有不同抗TGEV作用效果，表現(xiàn)為枯草芽孢桿菌組>屎腸球菌組>食淀粉乳桿菌組，說明益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用具有菌株差異性，推測可能與益生菌菌株自身結(jié)構(gòu)有直接關(guān)系。需改進(jìn)之處是增設(shè)動物性試驗(yàn)，供試仔豬可全面評價(jià)益生菌與細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用效果。目前，益生菌抗TGEV機(jī)制尚不清楚，后續(xù)將深入研究。

4　結(jié)論

本試驗(yàn)通過Transwell小室，利用臺盼藍(lán)染色檢測PK-15細(xì)胞存活率，初步摸索共培養(yǎng)條件，即當(dāng)益生菌菌體濃度102cfu·mL-1≤c≤1012cfu·mL-1，共培養(yǎng)時(shí)間為1和3 h；當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為1 h≤t≤24 h，益生菌菌體濃度為102、104、106和108cfu·mL-1時(shí)，益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)成立。在此基礎(chǔ)上，檢測益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對TGEV抑制率和滴度變化，評價(jià)益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對TGEV有抑制作用，能降低TGEV滴度，組抗TGEV作用效果枯草芽孢桿菌>屎腸球菌組>食淀粉乳桿菌組。

[1]殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997:681-688.

[2]Zhang Q,Hu R,Tang X,et al.Occurrence and investigation of en?teric viral infections in pigswith diarrhea in China[J].Archives of virology,2013,158(8):1631-1636.

[3]Maragkoudakis P A,Chingwaru W,Gradisnik L,et al.Lacticacid bacteria efficiently protect human and animal intestinal epithelial and immune cells from enteric virus infection[J].International journal of food microbiology.2010,141(1):S91-S97.

[4]Kumar R,Seo B J,Mun M R,et al.Putative probiotic Lactobacillusspp.from porcine gastrointestinal tract inhibit ransmissible gastro?enteritis coronavirus and enteric bacterial pathogens[J].Tropical Animal Health and Production.2010,42(8):1855-1860.

[5]高長春,鄧玲玲,尹鑫,等.豬源益生菌體外抗豬傳染性胃腸炎病毒作用的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,35(9):715-719.

[6]黃兵,劉寧,黃英,等.放線菌與枯草芽孢桿菌的共培養(yǎng)及其對活性次生代謝產(chǎn)物的影響[J].生物工程學(xué)報(bào),2009,25(6):932-940.

[7]陳國忠,姜海行,陸正峰,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)對肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡和Roh A表達(dá)的調(diào)控[J].世界華人消化雜志,2010,18(16):1643-1649.

[8]徐磊.基于共培養(yǎng)體系考察間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨表型的研究[D].上海:華東理工大學(xué),2012.

[9]杜維霞,沈名揚(yáng),艾青,等.Zonulin介導(dǎo)的腸道微生物對腸上皮細(xì)胞屏障功能的調(diào)節(jié)[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2014,36(10): 1362-1367.

[10]GeorgiaZ,Effie T,Joelle D,et al.Differential crosstalk between epi?thelial cells,dendritic cells and bacteria in a co-culture model[J]. International Journal of Food Microbiology,2009,131:40-51.

Anti-TGEV effect of three probiotics strains and PK-15 cells co
culture/WEI Ping1,LIU Wenna1,WANG Huihui2
(1.School of Veterinary Medicines,Northeast

Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Animal Husbandry Comprehensive Service Station of Dayangshu,Oroqen Autonomous Banner,Hulunbeir Inner Mongolia 165456,China)

In order to simulate the porcine intestinal environment and explore the anti-TGEV effect of probiotics and cells co-culture,this experiment used Transwell to establish probiotics and PK-15 cells coculture in vitro.In addition,this test took advantage of trypan blue staining to detect the PK-15 cells survival rates.The results showed that the PK-15 cells survival rates were higher under the conditions of 102cfu·mL-1≤the concentration of probiotics≤1012cfu·mL-1,1,3 h of co-culture time or 1 h≤the time of co-culture≤24 h, 102,104,106and 108cfu·mL-1of probiotics concentration.On this basis,this experiment made use of MTT colorimetric assay to detect the TGEV inhibition rates.The results showed that the TGEV inhibition rates were more than 90%when the concentration of probiotics was about 102-108cfu·mL-1and the time of coculture was about 1-24 h.Furthermore,the TGEV average titer of probiotics and PK-15 cells co-culture was lower.

probiotics;PK-15 cells;co-culture;anti-TGEV

S858.28

A

1005-9369（2016）06-0060-08

2016-04-14

黑龍江省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（12521z001）；哈爾濱市科技局項(xiàng)目（2014RFXGJ096）

魏萍（1961-），男，教授，博士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)傳染病學(xué)與流行病學(xué)。E-mail:weiiping@163.com